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啮齿类动物全动物灌注固定

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DOI：

10.3791/3564

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2012年7月30日

 ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Michigan , 2Department of Neurological Surgery, University of Washington School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍一种低成本、快速、可控且均匀的固定方法，通过大鼠心脏经血管系统灌注4%多聚甲醛，以实现对脑组织的最佳保存。

摘要

固定的目标是快速且均匀地将组织以类似生命的状态保存下来。虽然将小块组织直接放入固定液中效果良好，但对于完整的大脑等较大标本而言，浸入式固定存在困难，因为固定液无法以相同速率到达组织的所有区域5,7。通常，在组织被充分固定之前，缺氧所引发的组织变化便已开始12。通过循环系统直接灌注固定液的优势在于，化学固定剂可借助天然的血管网络迅速到达生物体的各个部位。为了最有效地利用循环系统，必须注意维持与生理状态相匹配的压力3。需要注意的是，生理压力因所用物种而异。灌注固定的技術方法取决于待固定的组织类型以及固定后组织的后续处理方式。在本视频中，我们介绍一种低成本、快速、可控且均匀的固定方法：通过大鼠心脏经血管系统灌注4%多聚甲醛，以实现对大脑组织进行最佳保存，用于免疫组织化学分析。该技术相较于重力驱动系统的主要优势在于能更有效地利用循环系统。

方案

1. 准备固定剂

（参见表 固定剂与缓冲液。）

2. 准备灌注缓冲液

（参见表 固定剂与缓冲液。）

3. 准备仪器和麻醉

  1. 使用水浴将灌注缓冲液预热至 37 °C。将出口阀置于盛有缓冲液的烧杯中。用缓冲液填充一个 50 ml 注射器，并连接到固定剂管路。通过反复排出和吸入缓冲液来冲洗管路。
  2. 用缓冲液冲洗管路，直至消除管路中的所有气泡。灌注成功的关键在于各管路中均不得存在气泡。
  3. 取下注射器，连接 4% 多聚甲醛固定剂容器（室温）。为避免管路末端产生气泡，在将管路插入容器时应挤压管路，使管路末端突出一滴缓冲液，以接触容器内的液面。
  4. 关闭出口端口（针头端）。将缓冲液阀门（蓝色）转至与固定剂阀门（白色）相同的位置。此操作将仅允许缓冲液管路中的液体流动。
  5. 打开出口端口，并重复步骤 A1 至 A3 以填充缓冲液管路。待所有气泡完全排除后，关闭出口端口，取下注射器并连接缓冲液容器，注意避免将气泡引入管路中。
  6. 通过按压橡胶压力计球囊测试系统是否能够维持压力。由于系统内空气被压缩，通常会感受到一定阻力。
  7. 按使用顺序摆放手术器械，以便取用。用缓冲液填充灌注针头，以避免产生气泡。
  8. 手术前，通过腹腔注射（27 号针头和 1 cc 注射器）给予氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮剂量最高可达 80 mg/kg 体重，赛拉嗪剂量为 10 mg/kg 体重）。在每台手术过程中，将根据需要追加麻醉剂，以维持外科麻醉水平。

4. 灌注手术

  1. 当动物达到手术麻醉深度时，将其置于装有碎冰的浅盘中。（使用脚趾夹捏反应法判断麻醉深度，动物必须无反应后方可继续操作）。
  2. 在肋骨下方的体表和腹壁处做一个5-6厘米长的侧向切口。小心地将肝脏与膈膜分离。
  3. 使用弯头钝头剪刀在膈膜上做一个小切口。手指的位置和施加的压力有助于切割膈膜。
  4. 沿整个肋骨长度继续切开膈膜，以暴露胸膜腔。
  5. 将弯头钝头剪刀沿一侧肋骨放置，小心移开肺组织，然后从肋骨一直切至锁骨。在对侧进行相同的切口操作。
  6. 将胸骨向上提起，小心修剪任何将其与心脏相连的组织。用止血钳夹住胸骨尖端，并将止血钳置于头部上方。操作正确时，胸腺会随胸骨一同被提起，从而清晰暴露主要血管。
  7. 使用虹膜剪刀在左心室后端做一小切口。

显示获取心脏步骤的大鼠解剖过程，实验室示意图，研究方法。
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  1. 将一根15号钝头或橄榄头灌注针经切断的心室插入升主动脉。针尖应透过主动脉壁可见，但不应到达锁骨下动脉和颈动脉分叉的主动脉弓部位。
  2. 使用止血钳夹住心脏，以固定针头并防止泄漏。如有需要，可使用改良止血钳夹住针尖周围的主动脉（这些止血钳将一直保留至开始解剖，但为清晰起见，在后续图示中省略）。
  3. 最后，使用虹膜剪在动物右心房处做一切口，尽可能制造较大的流出通道，同时避免损伤降主动脉。此时，动物已准备就绪，可进行灌注。

5. 灌注

  1. 打开并连接出液口至针座，注意避免引入任何气泡。
  2. 迅速且均匀地挤压压力计球囊，使压力达到 80 mm Hg，并在整个缓冲液灌注期间维持此压力。启动计时器。
  3. 调整针头角度。针头角度对达到最大流速至关重要（注意调整角度时流速的变化）。
  4. 当缓冲液即将用完（200 ml）时，切换缓冲液阀门（蓝色）。此时流出液体应变得澄清。肝脏变清是灌注良好的指标，此时肝脏应已完全澄清。记录此时间点以备存档。
  5. 固定颤动应在数秒内出现；此时间点应视为真正的固定开始时间。记录此时间点以备存档。
  6. 可逐渐将压力升高至最高 130 mm Hg 2，以维持稳定的流速。
  7. 当固定液即将用尽时，关闭出液阀。记录结束时间以备存档。
  8. 此时大鼠应已变得僵硬。
  9. 使用过的多聚甲醛必须按照所在机构的规定收集并储存，以便后续处理。

6. 解剖 4,11

  1. 使用剪刀去除头部。
  2. 从颈部沿体表中线向鼻部做一纵行切口，暴露颅骨。
  3. 修剪掉残留的颈部肌肉，使颅底充分暴露；用剪刀或咬骨钳清除任何残余肌肉组织。
  4. 将一对虹膜剪的尖端从一侧枕骨大孔插入，小心沿颅骨内表面滑动剪刀。
  5. 接着，剪切至后部颅骨表面的远端边缘；在对侧做相同切口。使用咬骨钳清除小脑周围颅骨组织。
  6. 继续沿颅骨内表面小心滑动剪刀，使剪刀尖端从背侧后方远端角移至颅骨前部远端边缘，切割时轻轻上抬刀片以避免损伤脑组织。对另一侧重复相同操作。
  7. 使用咬骨钳将颅骨背侧部分从脑组织上剥离。同时用咬骨钳修剪去除颅骨两侧部分。
  8. 使用刮匙切断脑腹侧表面的嗅球及神经连接。
  9. 轻柔地将脑组织从颅腔中分离，若仍有硬脑膜连接脑与颅骨，可用虹膜剪予以剪除。
  10. 取出脑组织并放入装有固定液的样品瓶中，固定液体积应至少为脑组织体积的10倍。期间可偶尔轻轻摇动样品瓶。

7. 固定后处理与保存

  1. 将脑组织置于固定液中，在 4 °C 下保存 24 小时，期间偶尔轻轻摇动。
  2. 24 小时后，用磷酸盐缓冲液洗涤脑组织，更换溶液 3 次，每次均轻轻摇动。
  3. 随后可将脑组织保存在含叠氮化钠的磷酸盐缓冲液或 HBHS 中，并置于 4 °C 下储存。

8. 代表性结果

灌注成功的一个初步指标是外周部位（如鼻子、耳朵和爪子）以及内部器官（如胸腺和肝脏）变得透明（IHC World）。肉眼观察脑组织可发现血管内无血液残留（呈白色至淡黄色）。这一现象在用于染色和免疫组织化学的组织切片中也同样明显。灌注效果的最终指标是组织中超微结构的保存状况。1,6,7,8

配制固定液：
配制8%多聚甲醛储备液
  1. 将40 g多聚甲醛加入500 ml去离子水（dH2O）中，在搅拌条件下加热至60–65 °C（温度不得超过65 °C，否则可能对免疫组织化学实验的成功产生不利影响）。
  2. 为使溶液澄清，降低加热温度，并用滴管加入2–3 ml的1.0 M NaOH。
  3. 过滤后于4 °C保存，最多可保存1个月。
配制0.2 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4
  1. 配制磷酸二氢钠储备液：将27.8 g NaH2PO4·H2O溶于1 L去离子水（dH2O）中。
  2. 配制磷酸氢二钠储备液：将28.4 g Na2HPO4溶于1 L去离子水（dH2O）中。
  3. 取810 ml磷酸二氢钠储备液与190 ml磷酸氢二钠储备液混合。
配制4%多聚甲醛固定液
  1. 将等体积的8%多聚甲醛储备液与0.2 M磷酸钠缓冲液混合。
  2. 注意：该固定液最好现用现配，提前配制时间不超过72小时。
配制灌注与储存缓冲液：
配制磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），pH 7.4
  1. 1 L去离子水（dH2O）
  2. 9 g NaCl
  3. 144 mg KH2PO4
  4. 795 mg Na2HPO4
  5. 检测pH值
含叠氮化钠的HEPES缓冲Hanks溶液（HBHS），pH 7.4
  1. 990 ml去离子水（dH2O）
  2. 7.5 g NaCl
  3. 0.3 g KCl
  4. 0.06 g KH2PO4
  5. 0.13 g Na2HPO4
  6. 2 g右旋葡萄糖/葡萄糖
  7. 2.4 g 10 mm Hepes
  8. 0.1 g六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）
  9. 0.05 g七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）
  10. 0.165 g二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）
  11. 90 mg NaN3
  12. 检测pH值

表1. 固定剂与缓冲液的配制。

用于组织保存过程的带有压力计、固定剂和缓冲液的灌注系统示意图。
图 1. 带有标注组件的灌注装置。

灌注装置示意图，显示固定剂和缓冲液的流动，用于组织保存。
图 2. 灌注装置的准备 I。从固定剂管路开始。通过快速将缓冲液推入和抽出注射器并流经管路，排出管路中的气泡并充满缓冲液。关闭针头端的阀门。将固定剂管路插入固定剂瓶中，避免引入气泡。

灌流系统示意图，生物样本制备中的固定剂缓冲液装置。
图 3. 灌流装置的准备 II。1. 打开针头端的阀门。2. 将缓冲液阀门（蓝色）旋转至流通位置。3. 使用注射器快速推注并回抽缓冲液，以排出管路中的气泡并充满缓冲液。4. 关闭针头端的阀门。将管路插入缓冲液瓶中。通过挤压压力计球囊并观察压力表读数来测试压力，确保系统密封良好。此时装置已准备好进行灌流操作。

固定组织系统示意图，显示固定液、缓冲液瓶及连接管路的实验装置。
图4. 灌注装置就位，用于缓冲液输送。

显示手术步骤的啮齿类动物解剖示意图，用于进入胸腔和心脏。
图5. 灌注手术 I。a) 通过皮肤和腹壁做一侧切口。b) 在膈肌上做切口，并横切膈肌以暴露心脏；沿肋骨两侧平行切割至锁骨。c) 用止血钳夹住胸骨尖端，并将止血钳置于头部上方。

啮齿类动物心脏摘除手术技术；解剖方法示意图。
图6. 灌注手术 II。a) 将灌注针穿过切开的心室插入升主动脉。b) 固定灌注针，使用一把止血钳夹住心脏。也可使用另一把改良止血钳夹住针尖周围的主动脉，以防止泄漏。使用虹膜剪在左心室后端做一小切口。

灌注方法示意图，用于啮齿类动物组织制备实验的固定剂和缓冲液装置。
图 7. 缓冲液灌注 使用压力泵挤压压力计球囊，使管路内产生压力。打开阀门（1），并连接至针头座。必须确保不引入任何气泡。将压力计球囊加压至 80 mm Hg，并在整个缓冲液灌注期间维持此压力。

大鼠灌注装置示意图；固定液、缓冲液流动；神经生物学实验。
图 8. 固定液灌注 当缓冲液即将用完（约 200 ml）时，切换缓冲液阀门（1），使固定液开始流动。压力可逐渐升高，最高不超过 130 mm Hg。

显示手术切口的大鼠解剖示意图。
图 9. 解剖步骤 I。a) 使用剪刀切除头部。b) 沿中线从颈部至鼻部在皮肤上做一切口，并暴露颅骨。c) 修剪掉残留的颈部肌肉，使颅底暴露。固定头部，使颅骨表面的大孔（枕骨大孔）易于接触。将虹膜剪的尖端小心插入枕骨大孔并进行剪切。对对侧重复相同操作。使用咬骨钳清除小脑周围颅骨组织。

显示三个阶段中胚胎颅面发育形态变化的示意图。
图 10. 解剖步骤 II。a) 将剪刀沿颅骨内表面小心滑动。剪切时轻轻抬起剪刀尖端，以避免损伤脑组织。对另一侧重复相同操作。使用咬骨钳将颅骨从脑组织上剥离。b) 颅骨已移除、脑组织暴露的示意图。c) 使用刮匙在脑最前部切断嗅球及神经连接。小心沿脑组织底面引导刮匙尖端，以切断连接，便于取出。将脑组织取出后置于含有固定液的小瓶中。

讨论

手术成功附加注意事项：

  1. 一旦横膈膜被穿透，应迅速进行操作，因为缺氧和高碳酸血症将引发不可逆的生理变化，可能干扰后续分析结果。
  2. 当针头插入并固定到位后，残留压力会将血液推至针尖末端（回血现象）。事实上，体型较大的动物可能会剧烈喷出血液。关键在于血液至少应到达针尖基部，以避免引入气泡，否则气泡将阻碍完全灌注。若未在针尖基部观察到血液，应拔出针头并通过连接灌注装置的出口端重新用缓冲液充满。待缓冲液流经针尖后，可将针头重新插入心脏。
  3. 针头在主动脉内的正确放置至关重要，不应深入至主动脉弓。
  4. 若需进行多次灌注，无需每次从头开始设置。操作者只需确保每个瓶中装有适量的缓冲液和固定液（每只动物每种溶液200 ml）。必要时可重新加液。需重点考虑的是冲洗从装置到动物之间的灌注管路（输出阀）。一次灌注完成后，该管路内会残留4%多聚甲醛。将管路从缓冲液瓶中移出，使用装有50 ml水的注射器冲洗固定液。确保输出阀置于废液收集瓶中，以便妥善处理多聚甲醛。此过程需重复三次。随后按照2.3步骤所示方法重新注入缓冲液。
  5. 该固定方法具有高度可调性，可根据实验需求更换缓冲液和固定液，包括适用于电镜研究的其他固定剂。
  6. 该系统也常用于活体组织的提取。在此过程中，仅使用缓冲液灌注即可（将连接于整个系统的缓冲液瓶置于冰桶中，固定液瓶则保持密封但为空瓶）。这可确保以最佳压力进行低温缓冲液灌注。此后，系统还可用于可固定染料的灌注，可通过将染料直接加入缓冲液（若用量充足），或在缓冲液与固定液步骤之间使用含少量缓冲液/染料混合液的注射器实现。
  7. 在血管铸型实验中，压力监测下的缓冲液灌注步骤至关重要；但由于铸型溶液具有较高黏度且会固化，必须使用50 ml注射器进行直接灌注，或采用一次性附加装置（包括管路、阀门和容器）与现有系统连接。本实验室的血管铸型技术早于灌注装置的设计与制造，因此无法保证压力读数在灌注部位的准确性。可能需要调整压力参数以成功输送高黏度液体。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由神经通信技术中心（CNCT）资助，该中心是生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB，P41 EB002030）资助的 P41 资源中心，并由美国国立卫生研究院（NIH）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>麻醉剂：
氯胺酮/赛拉嗪混合物（麻醉剂可能因实验室/机构而异）KetasetNDC 0856-2013-0110 mL 小瓶
<强>外科手术：
针尖，27 G × 1.25"物资服务25251
大型直头/弯头钝头剪刀（约14.5 cm）Fine Science Tools14519-14
直头虹膜剪Fine Science Tools14058-11
标准镊子Fine Science Tools11027-12
精细（Graefe）镊子Fine Science Tools11050-10
1 把大号止血钳——弯型或直型（约 19 cm）surgicaltools.com17.21.51
2 把标准止血钳——直纹齿状（14 cm）Fine Science Tools13013-14
1 把经改装的止血钳（在尖端钻出一个15号规格的孔）Fine Science Tools13013-14
15号钝头或橄榄头针（灌注针）Fisnar5601137
<强>灌注:
HyPerfusion 系统或同等设备
磷酸盐缓冲液，pH 7.4
0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）中的 4% 多聚甲醛
浅口玻璃或塑料托盘，约10" × 10"
碎冰
水浴（37 °C)
计时器
50 ml 注射器Medline IndustriesNPMJD50LZ
<强>解剖:
一对标准直头尖/钝剪刀（约12 cm）精细科学工具14054-13
中等弯曲或直头咬骨钳（14–16 cm）或颅骨去除钳Fine Science Tools16020-14
直型虹膜剪（约9 cm）精细科学工具14058-11
微型刮勺（双头 2" 平端，一端圆形，一端锥形，锥端直径为1/8")精细科学工具10091-12
<强>固定后处理 &和储存：
50 ml 玻璃瓶
含叠氮化钠（90 mg/L）的40 ml HEPES缓冲Hanks液（HBHS）

参考文献

  1. Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
  2. Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
  3. Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
  4. Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
  5. Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
  6. Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
  7. Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
  8. Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
  11. Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
  12. Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).

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