干细胞移植在一种 体外 模拟缺血/再灌注模型

摘要

我们演示如何建立一个 体外 缺血/再灌注模型及干细胞治疗对缺血后心肌细胞作用的评估方法

摘要

干细胞移植方案正逐步进入临床实践^1,2,3。获得更优的治疗效果、提高方案的稳健性以及寻找可用于移植的新细胞来源，是近期研究的重点^4,5。评估细胞治疗的有效性并非易事，需要开发新工具以研究治疗过程中涉及的机制⁶。我们设计了一种缺血/再灌注的实验方案，以便在缺血/再灌注损伤期间及干细胞移植后，观察细胞间的连接乃至亚细胞机制，并评估细胞治疗的疗效。将H9c2心肌母细胞接种于细胞培养板上^7,8。通过在无葡萄糖培养基中培养150分钟且氧浓度低于0.5%来模拟缺血状态。随后恢复正常的培养基和氧浓度以模拟再灌注。在氧糖剥夺后，将标记的人骨髓来源间充质干细胞加入培养体系中，对受损细胞进行移植治疗。间充质干细胞在临床试验中备受青睐，因其可通过微创手术轻松获取，易于扩增，且可实现自体移植。共培养24小时后，使用钙黄绿素和溴化乙啶同型二聚体对细胞染色，以区分活细胞与死细胞。该实验设置使我们能够利用共聚焦荧光显微镜观察细胞间的相互作用，并通过流式细胞术量化缺血后细胞的存活率。共聚焦显微镜显示了两种细胞群体之间的相互作用，如细胞融合及细胞间纳米管的形成。流式细胞术分析揭示了受损细胞中存在3个可被绘制成图并进行统计分析的细胞簇。这些细胞群体可被分别研究，并据此数据对模拟治疗策略的有效性得出结论。

方案

1. 准备H9c2心肌母细胞

H9c2 大鼠心肌母细胞购自 ATCC（Wesel，德国），并在含 10% 胎牛血清、4 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素的高糖（4.5 g/L）DMEM 培养基中扩增 100 μg/ml 链霉素。H9c2成肌细胞系源自胚胎大鼠心脏，常用于 体外 骨骼肌和心肌的模型 ^8,9.

准备 H9c2 细胞的 12 孔板：

1. 从 H9c2 细胞的培养皿中移除培养基。
2. 用 5 ml PBS 洗涤细胞两次，并加入 2–3 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 消化。
3. 将培养皿置于 37°C 培养箱中孵育 5 分钟。
4. 加入 10 ml DMEM 培养基以终止胰蛋白酶消化。
5. 以 1200 RPM 离心 8 分钟，沉淀细胞。
6. 移除上清液后，将细胞重悬于 1 ml DMEM 培养基中，使用台盼蓝染色并通过血细胞计数板进行细胞计数。
7. 在 12 孔板中每孔加入 2 ml DMEM 培养基，接种 30,000 个 H9c2 细胞。
8. 将培养板置于 37°C CO₂ 培养箱中培养 24 小时。

2. 模拟缺血/再灌注

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讨论

本实验所展示的方案是一种针对心肌梗死干细胞治疗这一更为复杂问题的体外研究方法，具有此类模型所固有的各项优势与局限性。显然，该模型无法完全模拟心肌梗死发生过程中及之后所出现的复杂事件（例如免疫反应），但可专注于所添加细胞对缺血后细胞产生的直接效应。模拟缺血对H9c2心肌母细胞的影响在很大程度上取决于氧糖剥夺（OGD）的时间、所用细胞的传代次数以及氧气（O₂）浓度。研究者必须精确调整这些参数，为特定细胞类型确定最佳实验条件，以建立标准化的实验流程。此后，该方案可广泛应用于多种研究场景（如肾、肝或脑缺血/再灌注^11,12,13,14），用于评估不同类型添加细胞（如胚胎干细胞、诱导多能干细胞或成体干细胞¹⁵）的作用、条件培养基的效果¹⁶、不同预处理策略的有效性^17,18，或任何其他关注的研究参数。

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