我们演示如何建立一个 体外 缺血/再灌注模型及干细胞治疗对缺血后心肌细胞作用的评估方法
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摘要
摘要
干细胞移植方案正逐步进入临床实践1,2,3。获得更优的治疗效果、提高方案的稳健性以及寻找可用于移植的新细胞来源，是近期研究的重点4,5。评估细胞治疗的有效性并非易事，需要开发新工具以研究治疗过程中涉及的机制6。我们设计了一种缺血/再灌注的实验方案，以便在缺血/再灌注损伤期间及干细胞移植后，观察细胞间的连接乃至亚细胞机制，并评估细胞治疗的疗效。将H9c2心肌母细胞接种于细胞培养板上7,8。通过在无葡萄糖培养基中培养150分钟且氧浓度低于0.5%来模拟缺血状态。随后恢复正常的培养基和氧浓度以模拟再灌注。在氧糖剥夺后，将标记的人骨髓来源间充质干细胞加入培养体系中，对受损细胞进行移植治疗。间充质干细胞在临床试验中备受青睐，因其可通过微创手术轻松获取，易于扩增，且可实现自体移植。共培养24小时后，使用钙黄绿素和溴化乙啶同型二聚体对细胞染色，以区分活细胞与死细胞。该实验设置使我们能够利用共聚焦荧光显微镜观察细胞间的相互作用，并通过流式细胞术量化缺血后细胞的存活率。共聚焦显微镜显示了两种细胞群体之间的相互作用，如细胞融合及细胞间纳米管的形成。流式细胞术分析揭示了受损细胞中存在3个可被绘制成图并进行统计分析的细胞簇。这些细胞群体可被分别研究，并据此数据对模拟治疗策略的有效性得出结论。
方案
1. 准备H9c2心肌母细胞
H9c2 大鼠心肌母细胞购自 ATCC（Wesel，德国），并在含 10% 胎牛血清、4 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素的高糖（4.5 g/L）DMEM 培养基中扩增 100 μg/ml 链霉素。H9c2成肌细胞系源自胚胎大鼠心脏，常用于 体外 骨骼肌和心肌的模型 8,9.
准备 H9c2 细胞的 12 孔板：
- 从 H9c2 细胞的培养皿中移除培养基。
- 用 5 ml PBS 洗涤细胞两次，并加入 2–3 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 消化。
- 将培养皿置于 37°C 培养箱中孵育 5 分钟。
- 加入 10 ml DMEM 培养基以终止胰蛋白酶消化。
- 以 1200 RPM 离心 8 分钟，沉淀细胞。
- 移除上清液后，将细胞重悬于 1 ml DMEM 培养基中，使用台盼蓝染色并通过血细胞计数板进行细胞计数。
- 在 12 孔板中每孔加入 2 ml DMEM 培养基，接种 30,000 个 H9c2 细胞。
- 将培养板置于 37°C CO2 培养箱中培养 24 小时。
2. 模拟缺血/再灌注
模拟缺血/再灌注 体外 通过在H9c2细胞培养物上实施氧糖剥夺（OGD）进行实验。该操作在蔡司共聚焦显微镜载物台上结合PeCon细胞培养系统（Erbach，德国）完成，可在OGD过程中实时观察细胞状态。
- 用移液器从 H9c2 细胞的 12 孔板中吸除培养基。
- 用 PBS 洗涤细胞两次。
- 每孔加入 3 ml 无糖培养基。
- 将培养板放入细胞培养系统中。
- 开始通入氮气，以置换培养系统中的氧气。
- 待氧浓度降至 0.5% 后启动计时器。0.5% 的氧浓度相当于约 3 mmHg 的氧分压。使细胞接受 150 分钟的模拟缺血处理。
- 模拟缺血结束后，从细胞中移除无糖培养基。
- 用移液器向各孔加入 2 ml 正常培养基。
- 将 12 孔板置于 37°C CO2 培养箱中孵育 30 分钟；此阶段为“再灌注期”。
3. 准备受体间充质干细胞
将人源骨髓样本接种于T75培养瓶中，并用含10%胎牛血清（FCS）、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、4 mM L-谷氨酰胺和1 g/l葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）稀释。将培养瓶置于37°C、5% CO2的完全湿化培养箱中培养3天。培养结束后，骨髓间充质干细胞（BMSCs）贴附于培养瓶表面，未贴壁的骨髓成分通过PBS洗涤去除。实验所用BMSCs代次为第1至第5代。通过流式细胞术检测谱系特异性细胞表面标志物以确认细胞身份。检测的造血谱系特异性表面标志物包括CD34和CD45，间充质表面标志物包括CD73、CD90、CD105和CD166。
在模拟缺血期间，准备用于移植的挽救型间充质干细胞。
- 将荧光染料 Vybrant DiD 以 1:200 的比例溶于 DMEM 培养基中。
- 吸除拯救细胞中的培养基，并加入 300 μl 含 Vybrant DiD 的 DMEM 培养基。
- 将培养皿置于 37°C CO2 培养箱中孵育 30 分钟。
- 从间充质干细胞的培养皿中移除培养基。
- 用 5 ml PBS 洗涤细胞两次，并用 2–3 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 消化。
- 将培养皿置于 37°C 培养箱中孵育 5 分钟。
- 加入 10 ml DMEM 培养基以终止胰蛋白酶消化。
- 以 1200 RPM 离心 8 分钟收集细胞。
- 去除上清液后，将细胞重悬于 1 ml DMEM 培养基中，使用台盼蓝染色法并通过血细胞计数板进行细胞计数。
- 在再灌注结束 30 分钟后，每孔加入 20,000 个间充质干细胞至缺血后 H9c2 心肌成肌细胞中。
- 将共培养的细胞置于 37°C CO2 培养箱中培养 24 小时。
4. 共聚焦显微镜分析
模拟缺血/再灌注损伤后，细胞在正常培养基中孵育24小时。
- 24 小时后，用 PBS 洗涤细胞两次。
- 将细胞在 500 μl 活/死染料溶液中染色 30 分钟（PBS 中含 5 nM 钙黄绿素和 400 nM 碘化丙啶同源二聚体-2）（5×104 个细胞/ml）。
通过形态学和荧光特征选择活细胞与死细胞后，可使用 ImageJ 软件（美国国立卫生研究院）对共聚焦图像进行评估。在共培养条件下，由于 Vybrant DiD 细胞标记的存在，可将 MSCs 与 H9c2 细胞区分开。每种培养样本可在 4 个独立的视野（物镜 10×）中以盲法评估死细胞比例10。
使用共聚焦显微镜的细胞培养系统，还可对培养在42 mm玻璃盖玻片上的H9c2心肌成纤维细胞在缺血/再灌注损伤期间及之后进行延时视频显微镜观察。可随时间推移研究细胞间的相互作用，例如细胞融合和细胞间纳米管的形成。
5. 流式细胞术分析
模拟缺血/再灌注损伤后，细胞在正常培养基中孵育24小时。
- 24 小时后，收集培养基。收集培养基非常重要，因为在 24 小时孵育期间，一些死亡的细胞可能已从培养皿表面脱落。
- 用 PBS 洗涤细胞两次，并用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化。
- 用 DMEM 培养基终止胰蛋白酶反应。
- 将细胞和收集的培养基在 1200 RPM（约 150–200g）下离心 8 分钟。
- 弃去上清液。
- 将细胞重悬于 500 μL 活/死染料溶液中，孵育 30 分钟（PBS 中含 5 nM 钙黄绿素和 400 nM 碘化乙啶同源二聚体-2）（5×104 个细胞/mL）。
- 将细胞转移至流式管中。
- 启动 CellQuest Pro 软件。
- 为设置流式细胞仪的检测参数，需准备活细胞和死细胞的对照样品。
- 按照步骤 1 的方法，将 H9c2 细胞以 3×104 的密度接种于 12 孔板中。
- 按照步骤 1 的方法，通过单次胰蛋白酶消化制备活细胞对照。
- 通过 10 μM H2O2 处理 1 小时制备死细胞对照。
- 胰蛋白酶消化后，将活细胞和死细胞对照分别重悬于 500 μL 活/死染料溶液中（PBS 中含 5 nM 钙黄绿素-AM 和 400 nM 碘化乙啶同源二聚体-2）。
- 应调整仪器设置，使活细胞表现为钙黄绿素阳性、碘化乙啶同源二聚体阴性，而死细胞表现为钙黄绿素阴性、碘化乙啶同源二聚体阳性。
- 这些细胞群的百分比可用柱状图表示，并对这些数值进行统计学分析。
- 检测不同的实验组。
6. 典型结果：
我们的结果显示，添加的间充质干细胞能够改善缺血后心肌细胞的存活。共聚焦显微镜图像揭示了细胞间的直接相互作用，例如部分膜连接或细胞间纳米管，这些结构可能在观察到的保护作用中发挥重要作用10。这些纳米管跨越数个细胞直径的距离，其直径在200至500 nm之间（白色箭头所示）。
图 1. 细胞间纳米管的形成。 在 Vybrant DiO 标记的心肌母细胞与 Vybrant DiD 标记的间充质干细胞之间观察到纳米管形成（白色箭头所示）。
流式细胞术分析显示了存活和坏死的心肌母细胞及间充质干细胞的群体。有趣的是，我们还观察到第三类“受损”心肌母细胞群体，该群体含有钙黄绿素，但也含有死细胞标志物溴化乙锭同二聚体（图2）。
图 2. 模拟缺血后不同细胞群体的代表性散点图。
多项实验结果表明，与缺血后单独培养的心肌母细胞相比，将间充质干细胞添加到缺血后H9c2心肌母细胞中可显著提高活细胞比例（图3）。
图3. 干细胞治疗对缺血后心肌母细胞的影响。 与对照组相比，模拟缺血后活细胞百分比显著降低（对照组 vs. 缺血-再灌注模型组：90.36±2.60 vs. 10.52±0.48，*** p>0.001），加入骨髓间充质干细胞后该比例上升（缺血-再灌注模型组 vs. 缺血-再灌注+骨髓间充质干细胞组：10.52±0.48 vs. 25.21±2.13，*** p>0.001）。数据以均值±标准误表示。采用单因素方差分析结合Tukey多重比较事后检验进行统计学分析。
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讨论
本实验所展示的方案是一种针对心肌梗死干细胞治疗这一更为复杂问题的体外研究方法，具有此类模型所固有的各项优势与局限性。显然，该模型无法完全模拟心肌梗死发生过程中及之后所出现的复杂事件（例如免疫反应），但可专注于所添加细胞对缺血后细胞产生的直接效应。模拟缺血对H9c2心肌母细胞的影响在很大程度上取决于氧糖剥夺（OGD）的时间、所用细胞的传代次数以及氧气（O2）浓度。研究者必须精确调整这些参数，为特定细胞类型确定最佳实验条件，以建立标准化的实验流程。此后，该方案可广泛应用于多种研究场景（如肾、肝或脑缺血/再灌注11,12,13,14），用于评估不同类型添加细胞（如胚胎干细胞、诱导多能干细胞或成体干细胞15）的作用、条件培养基的效果16、不同预处理策略的有效性17,18，或任何其他关注的研究参数。
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致谢
本工作由匈牙利科学研究基金（OTKA）D45933、T049621、匈牙利科学技术基金会（TÉT）A4/04、Arg-17/2006 和 SIN、Bolyai、Öveges 奖学金以及 TÁMOP 4.2.2-08/1/KMR-2008-0004 和 4.2.1/B 09/1/KMR-2010-0001 项目资助。OTKA 83803。我们感谢 William Gesztes 为本片提供了配音。
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