本文描述了一种在大鼠听觉假体研究中应用的经典恐惧条件反射行为范式。该范式通过心率作为评估指标,提供了一种识别动物对不同声学和电刺激进行检测及分辨的方法。
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本文描述了一种在大鼠听觉假体研究中应用的经典恐惧条件反射行为范式。该范式通过心率作为评估指标,提供了一种识别动物对不同声学和电刺激进行检测及分辨的方法。
急性动物实验已被用于前瞻性研究神经听觉假体(如听觉脑干植入物1-3和听觉中脑植入物4,5)中的电极设计与刺激技术。尽管急性实验可初步揭示植入装置的有效性,但对慢性植入且清醒动物进行测试的优势在于能够评估通过植入设备所诱发感觉的心理物理学特性6,7。
已有多种技术被用于提供对相关刺激属性检测的行为学验证,例如基于奖励的操作性条件反射6-8、条件性回避9-11或经典恐惧条件反射12。选择何种技术需权衡多个因素,包括时间效率(基于奖励的方法通常效率较低)、能否同时测试多种刺激属性(条件性回避在此方面受限),以及重复刺激的测量可靠性(当采用生理学测量时可能存在此限制)。
本文介绍了一种经典的恐惧条件反射行为学方法,可用于同时检测动物对刺激的感知能力以及对两种刺激之间的辨别能力。采用心率作为恐惧反应的指标,从而减少或无需耗时的视频编码来分析冻结行为或其他类似指标(尽管也可加入此类指标以提供 convergent evidence)。动物通过这些技术进行训练,共进行三次、每次2小时的条件反射训练 session,每次提供48次刺激试验。随后进行48次试验的测试 session,用于检测每对刺激中各个刺激的感知能力,并检验每对刺激中各成员刺激之间的辨别能力。
该行为学方法在听觉假体研究中的应用被予以介绍。展示了心电图遥测装置的植入过程。同时展示了在声学刺激诱发的神经反应监测引导下,将脑电极植入耳蜗核,并将其固定以实现长期使用的过程。
1. 心电图遥测设备植入
2. 脑电极植入
3. 条件化处理
4. 测试
5. 典型结果
在植入后一周使用植入式遥测设备记录的样本心电图如图1所示。此类记录通常可从植入设备中获得,即使使用可溶性缝合线将导线固定于肌肉,这些设备仍能持续正常工作并记录超过六个月的心电数据。图2所示的心电图记录来自植入后八个月以上的动物个体。
图3显示了一次成功植入的位置。电极放置在后腹侧耳蜗核(PVCN)内具有多个电极位点,可对背腹侧大部分区域进行刺激和记录。本次植入各电极位点的频率响应如图4所示。电极分布在PVCN较长的区域内,使得可用于记录和刺激的细胞群对广泛频率范围内的声音具有调谐性。此外,这些细胞群本身的调谐性较窄——仅对特定窄带的声音频率产生响应(见图5)。
相比之下,图6展示了一种较差的电极放置位置。在此情况下,电极放置过于偏内侧,且插入深度不足,未能穿透PVCN。因此,仅有电极尖端附近的记录位点能够对声音产生反应,如图7所示。此外,可记录到的细胞群体所调谐的频率范围极为有限。这些细胞群体本身的调谐范围较窄(见图8),且其特征频率呈簇状分布,导致无法有效刺激不同的频率区域。
在条件化声刺激呈现期间,基础心率数据存在波动。为消除这种变异性,将原始心率(HR)数据标准化为刺激交替开始时(时间0)所观测心率的相对比例。图9展示了首次条件化训练期间以多种形式采集的数据。在初始条件化训练后期另一只动物所获得的心率结果示例见图10。动物对声刺激的条件化过程迅速,在少数几次试验中即可观察到明显的心率变化,如图9和图10中仅进行7次试验即出现显著变化。在刺激交替开始后立即观察到的心率变化(参见3.4.1和3.4.2)表明,动物能够区分最初重复呈现的刺激与随后添加的第二种刺激。
在开始测试阶段时,通常给予的是电刺激而非声刺激,而加入声刺激呈现可确认条件反射效应是否仍然存在。心率(HR)在声刺激呈现开始时发生的一般性变化,证实了对声刺激的条件反射效应依然存在,如图11所示。同样地,图12展示了在首次测试阶段中,声调交替开始前后心率的平均相对变化。与图9和图10类似,在第二个刺激引入之前心率相对稳定,而在第二个刺激引入之后心率迅速发生变化,这表明个体已能够区分两种声调。
相比之下,在 图13 中开始施加电刺激时,未观察到检测反应。在10次试验的平均心率比例变化中,未出现如 图11 所示检测发生时所见的持续快速下降。同样,在 图14 中心率未出现持续且快速的变化,表明所施加的两个电刺激之间的差异不足以引发辨别反应。无论是在交替刺激阶段开始之前(0时刻之前)还是开始之后,心率的平均比例变化均接近无变化基线。
一种更能体现神经刺激对之间区别的特征性模式如图15所示。在刺激交替开始后,心率迅速下降,随后出现显著的心率上升。本案例中采用的特定刺激策略成功地诱发了具有行为学意义的反应。

图 1. 使用植入式遥测装置在植入后一周获得的心电图记录。该记录中显示的信号在使用此类装置获得的记录中具有代表性。

图 2. 使用植入式遥测装置在植入六个月后获得的心电图记录。在此时间段内,记录信号几乎没有发生退化,该信号完全足以用于计算动物心率。

图3. 通过结合X射线计算机断层扫描与组织学切片实现的电极成功植入的三维重建。两根电极杆均穿入耳蜗核的后腹侧区域,且电极朝向该结构定向排列。

图 4. 根据图 3所示电极放置位置记录的电生理反应分布图。每个直方图显示一个电极位点在特定声学频率刺激下的活动数据;每列表示一个25 ms的时间段。在电极阵列的两个分支上,仅在特定窄频带刺激下可在各个独立电极位点检测到响应,但这些窄频带在较宽的频率范围内分布。此类分布是理想的,因为大脑中许多与不同频率相关的独立区域可被分别刺激。

图 5. 来自 图 3 和图 4 所示植入体的第 10 通道的电生理响应。理想情况下,电极放置应使得在多个通道上均可检测到神经对声学刺激的响应,且在声强低至 10 dB 时仍可记录到响应,如此例所示。

图6. 一次电极置入位置不佳的三维重建结果。尽管电极的尾侧-头侧角度正确,但其位置过于内侧。此外,电极插入深度不足,导致靠近电极尖端的记录位点位于耳蜗背核内。

图 7. 使用如图 6所示的电极放置方式记录到的电生理反应图谱。每个电极阵列分支尖端均检测到活动,但在各个电极位点引发反应的声刺激频率变化较小。此类植入方式无法实现对不同频率层的刺激,因而不适用于辨别测试。

图 8. 电极放置位置(如图 6 与图 7所示)中第 28 通道的电生理反应。声学刺激引发强烈的活动爆发,其尖峰频率与在非常成功的植入案例中观察到的相似(图 3)。该通道的阈值也相当低,可检测到对 20 dB 声强音调的反应。若阵列其他通道中最强反应所对应的频率存在更大差异,则该通道无疑足以用于刺激。

图9. 一只动物在首次条件化训练期间记录的原始心率(A)与平均比例心率(B)数据的比较。展示了7次刺激呈现的反应。由于在声音刺激改变开始前的基础心率存在个体差异,平均原始心率(±95%置信区间)未能充分反映心率先下降后上升的变化程度,而个体原始轨迹(A,底部)可清晰显示该趋势。在平均比例心率数据中,每条轨迹的心率被标准化为条件性声刺激呈现时刻的心率值,结果如图(B)所示。该分析显示,条件刺激呈现后心率出现具有统计学意义的下降,并在后期出现显著回升,95%置信区间反映了这一变化。个体比例心率轨迹如图(B,底部)所示。

图 10. 从交替声学刺激呈现开始前 8 秒至开始后 8 秒的平均心率比例变化,数据来自第二次和第三次条件化训练会话的合并结果。所展示的数据包括在两次条件化训练会话中呈现的七次试验,其中第一次条件化训练会话包含四次,第二次包含三次。在交替刺激呈现的反应中,心率首先出现显著下降,随后出现晚期上升。

图11. 在30秒静音期后,声学刺激呈现开始前10秒至开始后10秒内心率的平均相对变化。试验数据来自首次测试会话,包含六次声学刺激呈现。心率早期明显下降表明受试者能够区分所呈现的声学刺激。

图12. 从首次测试会话中提取的声学刺激呈现开始前8秒至开始后8秒的平均心率比例变化,包含五次声学刺激呈现。心率早期明显下降表明受试者能够区分所呈现的声学刺激。

图13. 在30秒静默期后,电刺激脑部开始前10秒至开始后10秒内平均心率比例变化。试验数据来自第一次和第二次测试会话,共包含18次电刺激呈现,均使用相同的刺激参数设置。在刺激起始时刻(时间0点)附近未观察到心率明显下降,表明动物无法感知该刺激。

图14. 从首次测试会话中提取的在交替电刺激呈现前后8秒内平均心率相对于基线的比例变化(参见4.6.5和4.6.6),共包含33次电刺激呈现。在时间0点附近未出现一致的心率变化模式,表明交替刺激之间的差异不足以引发可分辨的反应。

图15. 来自第二只动物第七次测试会话的个体轨迹(A)和平均心率比例数据(B,C)的代表性示例,记录时间为交替电刺激开始前8秒至开始后8秒,共包含12次电刺激呈现。在第二次神经刺激引入后,心率迅速显著下降,随后出现显著上升,表明动物已检测到第一次与第二次刺激之间的差异。在(B)所示的比例均值±标准误(SE)图中可观察到反应的误差程度和变异性。通过将95%置信区间应用于(C)所示数据,可验证第二次刺激呈现后心率下降和上升的显著性。(C)中观察到的反应与图9 B中的反应相似。
本文所述技术可快速测试多种辨别任务,训练时间短,并允许大幅自动化,从而最大限度减少数据处理所需的研究人员时间。利用植入式心电图(ECG)获得的数据,可在刺激呈现时自动计算心率(HR)变化。心电图处理中的错误(例如遗漏单次心跳)会因在极短时间内导致表观心率出现虚假的大幅变化而易于识别,这种便捷的错误检测方式最大限度减少了耗时的手动数据审查需求。
文中所述心电遥测设备植入技术所获得的记录结果通常干扰极小或无干扰(见图1和图2)。然而,导联在纵隔区域位置的相对微小变化,可能导致邻近肌肉的干扰以及与呼吸相关的特定噪声。在植入过程中,尤其是在缝合固定导联后,验证导联位置是否正确,可对导联位置进行精细调整,从而最大限度地减少干扰。
将电极植入耳蜗核的过程较为困难。通过使用多个频率范围的带通滤波噪声进行连续刺激,而非以往研究所采用的宽带噪声3,可快速评估电极记录位点上细胞群的频率-响应特性,而非特异性较低的噪声响应。在测试电刺激分辨能力的研究中,快速判断是否已获得足够范围的频率调谐细胞群至关重要。若未能获得足够的频率分布,则不同频率区域刺激之间的比较将无法实现。然而,在固定电极位置之前,仍必须完成更为耗时的频率-强度响应图谱绘制,以详细表征细胞群调谐特性的宽窄程度。
在行为训练和测试中,每次试验开始前、刺激呈现之前设置一个无刺激(或静默)时段,有助于观察对初始刺激呈现的反应。当使用电刺激神经时,对刺激起始的反应表明受试者能够简单地察觉该刺激。因此,若在初始刺激呈现时未出现反应,而在引入第二次交替刺激时才出现反应,则可推断仅后者刺激能被察觉。若不设置此类静默时段,将无法判断初始刺激是否未被察觉。
该行为测试技术的一个局限性在于,在神经刺激呈现后未给予足底电击,可能导致条件性恐惧的特异性形成,即仅在呈现声学刺激时才表达恐惧反应。也就是说,动物可能学会将神经刺激特有的感觉效应与未受到足底电击联系起来。相反,在神经刺激呈现后给予足底电击,则可能导致动物对神经刺激本身产生条件性恐惧,这种恐惧独立于神经刺激可能具有的任何类似声音的特性。在神经刺激后不给予足底电击所获得的结果,相较于在神经刺激后给予足底电击的情况,能够为神经刺激具有类声学特性提供更有力的证据,因为在前者中,条件性恐惧已从声学刺激泛化至神经刺激。然而,仍存在动物对声学刺激而非神经刺激产生特异性的风险。使用带通滤波噪声作为声学刺激,而非纯音脉冲,可能有助于降低此类特异性发展的风险,因为前者可能更接近神经刺激的感知体验。然而,这种方法引入了滤波器带宽这一额外变量,会影响辨别任务的结果。
与任何慢性神经植入(如行为学测试所需)相关的另一个局限性是,电极或相关神经组织的功能会随着时间推移而发生变化。对神经组织的刺激可能导致神经活动的暂时性抑制13,以及细胞丢失14和脑组织对电极的直接反应等组织学改变15。
所述的植入和行为测试方法能够在短暂训练后检测对声学和电刺激的感知与辨别能力,并可控制试验频率。利用心率变化作为条件性恐惧指标的技术不仅适用于听觉测试,还可广泛应用于任何能够呈现离散时间段刺激并需要检测感觉感知或辨别能力的感觉功能测试中。
Antonio Paolini 博士是 Bioengenesis Technologies Pty Ltd 的董事,该公司是 Tucker Davis Technologies 的澳大利亚代表,同时也是 NeuroNexus 探针在澳大利亚的经销商。
本研究的经费由加内特·帕斯和罗德尼·威廉姆斯纪念基金会以及拉筹伯大学提供。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PowerLab | ADInstruments | ML880 | 记录来自植入式 TR40 发射器接收的数据 |
| SmartCtrl 控制器卡 | Med Associates, Inc. | DIG-716B | 控制行为测试箱,包括足底电刺激 |
| 模块化行为测试箱 | Med Associates, Inc. | ENV-009 | 测试箱尺寸:30.5 cm × 39.4 cm |
| 厌恶刺激发生器 | Med Associates, Inc. | ENV-410B | 通过固态随机化单元向笼子的金属栅地板传递厌恶性足底电击 |
| 可编程衰减器 | TDT | PA5 | 控制所传递声学信号的幅度,以确保在不同频率下幅度稳定 |
| 静电扬声器驱动器 | TDT | ED1 | 驱动静电扬声器(EC1、ES1) |
| 自由场静电扬声器 | TDT | ES1 | 在行为测试箱中使用该扬声器呈现声音 |
| 耦合式静电扬声器 | TDT | EC1 | 在神经植入手术期间使用该扬声器呈现声音 |
| 刺激器基站 | TDT | RX7 | 控制电神经刺激的传递(与 MS16 配合使用) |
| 微刺激器 | TDT | MS16 | 传递多通道电神经刺激 |
| 处理基站 | TDT | RZ2 | 在脑部植入期间记录神经活动(使用 PZ2 前置放大器) |
| 前置放大器 | TDT | PZ2-256 | 256 通道高阻抗前置放大器 |
| 遥测设备接收器 | Telemetry Research | TR162 | 接收来自 TR40 的数字信号,并将其转换为放大的模拟输出 |
| 可植入心电图遥测设备 | Telemetry Research | TR40 | 植入式发射器设备,采样频率为 2 kHz |
| 多功能处理器 | Tucker-Davis Technologies | RX6 | 用于生成声学刺激 |
| Vertex Castavaria | Vertex Dental | 用于固定电极的牙科丙烯酸材料 | |
| Kwik-Sil 粘合剂,低粘度 | World Precision Instruments, Inc. | 用于涂覆电极杆的硅酮弹性体 | |
| 多通道电极 | NeuroNexus Technologies | a2x16-10mm 100-500-413 | 用于植入的双杆 32 通道细胞外电极阵列。电极位点已激活,以形成氧化铱涂层,为刺激做准备。 |
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