我们演示了如何分离和培养鸡胚第4天的前庭耳蜗神经节以及第6天的脊髓外植体。外植体在无血清条件下于三维胶原凝胶中培养24小时。通过添加生长因子的培养基以及包被蛋白质的微珠来检测神经突的反应性。
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摘要
摘要
鸡内耳感觉器官由位听神经节（SAG）神经元的周围突起所支配。感觉器官的神经支配依赖于多种轴突导向信号的协同作用。1 和存活因子2 位于生长的轴突路径上和/或其感觉器官靶区内。例如，对经典的轴突导向信号通路——信号素-神经纤毛蛋白（semaphorin-neuropilin）通路进行功能干扰，会导致耳部轴突的错误投射3此外，在转基因动物中，内耳感觉靶区表达的多种生长因子（包括神经营养素-3（NT-3）和脑源性神经营养因子（BDNF））已被人为调控，同样导致螺旋神经节轴突的错误投射。4这些相同的分子可同时促进鸡属螺旋神经节神经元的存活和神经突生长 体外5,6.
在此，我们描述并演示了 体外 我们目前采用该方法检测鸡胚螺旋神经节（SAG）神经突对可溶性蛋白的反应性，这些蛋白包括已知的形态发生素（如Wnts）以及对促进SAG神经突生长和神经元存活具有重要作用的生长因子。通过该模型系统，我们希望阐明分泌型配体对SAG神经元存活和神经突生长所产生的影响。
在胚胎第4天（E4）分离SAG外植体，并在无血清条件下将其培养于三维胶原凝胶中，持续24小时。首先，通过将外植体置于添加蛋白质的培养基中培养，检测神经突的反应性。随后，为探究分泌型配体的局部来源是否可对神经突生长产生方向性影响，将外植体与蛋白质包被的微珠共培养，并检测微珠局部促进或抑制神经突生长的能力。我们还展示了E6脊髓外植体的解剖（改良方案7）与培养过程。我们常规使用脊髓外植体在与SAG外植体相同的培养条件下，验证蛋白质及蛋白浸泡微珠的生物活性，并确认其与鸡组织之间的物种交叉反应性。这些体外实验便于快速筛选对SAG神经元具有营养（存活）或趋向（方向性）作用的分子，尤其适用于开展体内研究之前的初步评估。此外，该方法可在无血清条件下对单个分子进行测试，并实现较高的神经元存活率8。
方案
实验方案
鸡林格氏液
| 7.2 g | NaCl |
| 0.23 g | CaCl2 + 2H2O |
| 0.37 g | KCl |
| 0.115 g | Na2HPO4 |
| 900 ml | 水（组织培养级） |
注意：用水平衡至终体积 1000 ml，调节 pH 至 7.4。
10倍浓度 PBS
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na2HPO4 |
| 1.2 g | KH2PO4 |
| 450 ml | DEPC 水 |
注意：用蒸馏水将 pH 值调至 7.4，并定容至 500 ml。工作浓度（1X）通过将 1 份 10X 储存液与 9 份组织培养级水稀释制得，例如使用 Millipore 紫外照射系统制备的电导率为 18 MΩ-cm 的水。
SAG 外植体维持培养基
- 含 L-谷氨酰胺、10 mM Hepes 的 DMEM/F12 培养基
- 10% 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS+1）
- 1% 青霉素-链霉素（pen-strep）
组织块培养基
- SAG 组织块培养维持培养基
- 10 ng/ml 神经营养因子-3 (NT-3)
- 10 ng/ml 睫状神经营养因子 (CNTF)
脊髓解剖与维持液
- L-15
- 10% 胎牛血清
- 1% 青霉素-链霉素
将卵在37-38°C下孵育。用70%乙醇对解剖工具和Sylgard解剖皿进行灭菌。解剖皿和工具也可在紫外线下灭菌过夜。
1. 磁珠准备
- 将珠子放入含有1 ml无菌PBS的微量离心管中，混匀，静置直至珠子沉降至管底。
- 待珠子沉降后，吸除上清液，用PBS重复洗涤数次，并重新悬浮于PBS中。
- 在室温下，用纯化的蛋白（用PBS稀释）或仅用PBS（对照）孵育珠子1小时。
- 用PBS冲洗珠子后，将其保存在24孔板中，每孔加入1 ml PBS，直至用于胶原蛋白实验。
2. 前庭耳蜗神经节解剖
- 在E4期将胚胎从蛋中取出，并置于含有鸡林格氏液的培养皿中，以去除胚胎膜。
- 将胚胎置于内衬Sylgard©的培养皿中，皿内盛有冷的HBSS，并将胚胎侧放，使耳泡朝上。使用解剖针将胚胎固定在培养皿中。
- 使用两枚解剖针，在管道囊下方紧邻的皮肤处做一水平切口，位置大约在与耳蜗管相接处。在螺旋神经节（SAG）的前侧和后侧分别做垂直切口。用镊子或解剖针提起并移除由这三个切口所围成的皮肤瓣。
注意：SAG位于耳囊的前腹侧边缘，大致介于背侧囊（在明场透射照明下清晰可见）与腹侧耳蜗管之间；耳蜗管向腹内侧延伸，被咽弓遮挡而难以观察。在Hamburger-Hamilton分期23–25期之间的E4阶段，耳蜗管逐渐伸长，其背腹向尺寸将逐步增加。 - 将耳囊向后牵拉，使其与SAG分离。用解剖针拨开SAG周围的组织，并使用#55镊子小心地将SAG从胚胎上取下。去除SAG上附着的大块间充质组织及突出的神经束。
- 使用宽口移液枪头将外植体转移至含有0.5 ml SAG外植体保存培养基的24孔板中。外植体可在冰上或室温下保存最多4小时。
3. 脊髓解剖
- 从卵中取出E6胚胎，放入盛有鸡林格氏液的培养皿中。去除头部和胚胎膜。
- 将躯体置于含有冷脊髓分离培养基的Sylgard©解剖皿中。将胚胎“腹面朝下”放置，尾部朝向操作者。用解剖针穿过每个肢芽及前端固定胚胎。
- 使用镊子和/或解剖针，小心地从腹侧方向剥离皮肤和组织，直至暴露出脊髓的背侧表面。
- 用解剖针沿脊髓全长从后向前切开脊髓背侧中线。此操作会使脊髓左右两侧分开，形成“开放式书本”状结构。
- 从侧向去除周围组织，以分离脊髓并暴露背根神经节（DRG）。用解剖针或镊子在脊髓与背根神经节之间轻轻摩擦，去除背根神经节和脑膜。
- 用镊子夹住脊髓最尾端，向上并远离操作者方向提起，将脊髓从躯体上取下。清除残留的背根神经节和脑膜。
- 用镊子夹住脊髓一端（或用针将其固定在皿中），使用Vannas剪刀沿腹侧中线剪开，将脊髓纵向切成两半。
- 用镊子夹住外植体一端以固定组织，使用Vannas剪刀沿组织长度方向切割出小块外植体（长度100–500 µm）。室管膜板可识别为外植体一侧边缘处透明的组织增厚区域。
- 使用宽口移液吸头将外植体转移至含有0.5 ml冷分离培养基的24孔板中。将外植体置于冰上以维持组织活性，可保存长达4小时。
4. 利用纯化蛋白进行外植体培养以检测神经突的反应性
- 根据制造商说明书，在冰上用15 ml锥形管配制1.5 mg/ml的胶原蛋白溶液。
- 使用pH指示试纸确认胶原蛋白溶液的pH值为7–7.4。通过每次添加1 μl NaOH调节pH值。
- 使用宽口移液器吸头将外植体转移至24孔板中，并吸除多余液体。每个孔中可培养多个外植体，但彼此之间应至少间隔500 μm。
- 向含有外植体的孔中加入0.5 ml胶原蛋白溶液。将外植体置于孔的底部表面。务必在进行下一个孔之前确保每个培养物完全固定，因为胶原蛋白在室温下会开始聚合。
- 将培养板置于37°C载物台加热器上加热30–45分钟，以使胶原蛋白聚合。当胶原蛋白聚合后，其外观将类似于凝胶。
- 加入0.5 ml预热的外植体培养基，培养基中添加纯化的蛋白质（用PBS稀释）或PBS（对照），并在37°C、5% CO2条件下培养。24小时后应可观察到对神经突生长的影响。
注意：我们已使用相同方案将SAG外植体培养至42小时。
5. 利用蛋白质包被的微珠进行外植体共培养以检测神经突定向生长
- 从外植体培养步骤 4.1–4.4 开始。
- 使用移液器将 1–5 个珠子从 PBS 转移至含有胶原蛋白溶液和外植体的孔中。
- 用镊子将珠子放置在距离外植体边缘 50–500 μm 的位置。
- 将培养板置于 37°C 的载物台加热器上 30–45 分钟，使胶原蛋白聚合。在胶原蛋白聚合过程中，组织或珠子可能会发生移位。在前 5 分钟内检查培养物，并重新调整组织和珠子的位置。
- 向每孔加入 0.5 ml SAG 培养基，于 37°C 培养 24 小时。
6. 通过免疫组织化学法观察神经突生长
- 用 PBS 清洗细胞培养物，并在室温下用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定 1 小时。
- 用聚四氟乙烯微量刮刀的圆头沿凝胶边缘划动，使凝胶脱离孔壁。在孔内对凝胶进行免疫染色。用 PBS 多次清洗。
- 加入 0.5 ml 封闭液（含 10% 小牛血清、0.1% Triton X-100 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS），于 4°C 过夜孵育。
- 加入 0.5 ml 一抗（抗 β-微管蛋白抗体，用封闭液按 1:500 稀释），于 4°C 过夜孵育。
- 用 PBS 多次清洗。加入 0.5 ml 二抗（Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG2b 抗体，按 1:500 稀释），于 4°C 过夜孵育。从本步骤开始，由于二抗对光敏感，需将培养板置于避光环境或用铝箔包裹。
- 用 PBS 多次清洗，随后将样品置于 PBS 中，于 4°C 保存，可保存长达一周。
7. 代表性结果
图1. 纯化的NT-3及NT-3包被微珠对E4鸡胚螺旋神经节外植体神经突起促进作用的代表性结果。 SAG神经元胞体和神经突使用β-Tubulin进行免疫染色，并在共聚焦显微镜下用10倍物镜成像。24小时后 体外，与对照组（1A）相比，在细胞培养基中添加100 ng/ml纯化的人源NT-3后，SAG外植体表现出更显著的神经突生长（1B）。为验证NT-3的局部作用，将SAG神经元与浸有100 ng/ml NT-3的微珠共培养，结果显示，朝向微珠一侧的外植体神经突生长更长、更密集，而相对侧则生长较少（1D），且明显优于浸有PBS的微珠对照组（1C）。比例尺 = 200 μm.
图2. 纯化的Wnt5a及Wnt5a包被微珠对E6鸡胚脊髓神经突生长促进作用的代表性结果。 脊髓外植体经β-Tubulin免疫染色后，使用共聚焦显微镜成像。在添加纯化小鼠Wnt5a（400 ng/ml）培养24小时后，鸡胚脊髓外植体的神经突生长较未添加Wnt5a的对照组（2A）明显增强（2B）。将浸泡于500 ng/ml Wnt5a的微珠置于距脊髓外植体边缘300–500 μm处，亦可促进神经突生长（2D），相较于对照组培养（2C）效果显著。此前已有研究报道使用表达Wnt5a的细胞进行共培养可获得类似结果8。比例尺 = 200 μm。
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讨论
我们介绍了一种在无血清条件下分离和培养鸡胚E4期螺旋神经节（SAG）及E6期脊髓外植体的方法。目前，本实验室正利用该方法研究多种分泌型配体对SAG神经元存活及神经突起生长的影响。本实验方案的新颖之处在于采用无血清系统培养外植体，并使用浸透生长因子的琼脂糖珠研究其对SAG神经突起生长的作用。类似我们所用的琼脂糖珠方法已有文献报道用于鸡胚脊髓研究10。传统上，琼脂糖珠常用于经典轴突导向因子和形态发生素的相关研究。在此，我们证明该琼脂糖珠检测法也可用于研究神经营养因子（或其他生长因子）对神经突起生长的影响（图1）。
该实验流程中存在一些关键步骤，可能需要根据不同应用进行修改或优化。这些步骤也是在实验看似不成功时进行故障排查的重要变量。首先，在培养基中添加了神经营养因子-3（Neurotrophin-3, NT-3）、睫状神经营养因子（Ciliary Neurotrophic factor, CNTF）以及ITS（胰岛素、转铁蛋白、硒）以促进SAG神经元的存活并增强神经突起的生长6,8。在脊髓组织实验中也加入了这些生长因子，目的是在与SAG外植体...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目RO1DC002756和普渡研究基金会资助。我们感谢Doris Wu和Wiese Chang在实验方面的建议，以及Rodney McPhail在图表制作方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖显微镜 | 我们使用配备明场底座照明的 Leica M80 体视显微镜 | ||
| 载玻片加热板 | C.S. E. | 胶原蛋白聚合 | |
| 鸡胚孵育器 | |||
| 37°C/5% CO2 湿润细胞培养孵育箱 | |||
| 涂有 Sylgard© 的培养皿 | |||
| 24 孔细胞培养板 | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont 镊子 | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont 镊子 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 不锈钢解剖针 | Fine Science Tools | 26002-10 | 胚胎固定，精细解剖 |
| Moria 穿孔勺 | Fine Science Tools | 10370-17 | 胚胎收获/转移 |
| 200 μl 宽口移液器吸头 | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | 组织块转移 |
| E4 和 E6 阶段的鸡胚蛋 | |||
| 鸡林格氏液（Chick Ringer’s solution） | 胚胎收获 | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG 解剖 |
| L15 培养基 | Sigma-Aldrich | L5520 | 脊髓解剖用培养基 |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | 脊髓解剖用培养基 |
| Vannas 剪刀 | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | 脊髓解剖 |
| 大鼠尾胶原 I 型 | BD Biosciences | 354249 | 组织块培养 |
| 10X PBS（无菌） | 用于中和胶原液 | ||
| 1N NaOH（无菌） | 用于中和胶原液 | ||
| 蒸馏水（无菌） | 用于中和胶原液 | ||
| pH 指示试纸（6.0–8.1） | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | 检测胶原液 pH 值 |
| 15 ml 锥形离心管 | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl 宽口移液器吸头 | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | 用于移取胶原液 |
| DMEM/F12 培养基 | Sigma-Aldrich | D8437 | 组织块培养用培养基 |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | 培养基添加剂 |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | 培养基添加剂 |
| CNTF（大鼠） | Sigma-Aldrich | C3835 | 培养基添加剂 |
| NT-3（人源） | Sigma-Aldrich | N1905 | 培养基添加剂 |
| 纯化小鼠 Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue 凝胶珠 | Bio-Rad | 153-7302 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 固定 |
| PBS | 冲洗 | ||
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | 封闭液 |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | 封闭液 |
| 小牛血清 | Invitrogen | 16170-078 | 封闭液 |
| 小鼠单克隆 IgG2b 抗-β 微管蛋白 1+II 抗体 | Sigma-Aldrich | T8535 | 标记细胞体和神经突 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗-–小鼠 IgG2b 抗体 | Invitrogen | A21141 | 检测 β 微管蛋白抗体 |
| 聚四氟乙烯微型刮勺 | VWR international | 57949-033 | 从孔板中释放胶原凝胶 |
参考文献
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. ernhardH. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
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