我们介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离质谱结合还原性甲基化化学方法来定量分析赖氨酸甲基化变化的技术。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，表观遗传调控因子已被发现是多种疾病中的关键因素1-3。因此，这些酶成为小分子研究和药物开发的主要靶点4。许多表观遗传调控因子是最近才被发现的，目前仍处于分类过程中。其中一类酶为赖氨酸去甲基化酶，可从组蛋白及其他蛋白质的赖氨酸残基上移除甲基基团。由于这类酶具有新颖性，目前开发用于研究其活性的检测方法还很少。这已成为组蛋白去甲基化酶分类及高通量研究的障碍。目前存在的去甲基化酶检测方法极少，且多数为定性性质，无法同时区分不同的赖氨酸甲基化状态（无甲基、单甲基、双甲基和三甲基）。质谱分析常用于测定去甲基化酶活性，但现有的质谱检测方法并未解决不同甲基化程度的肽段电离效率不同的问题。甲基化肽段的差异性电离使得甲基化状态之间的比较变得困难，且显然无法实现定量分析（图1A）。因此，现有检测方法尚未优化，无法对去甲基化酶活性进行系统全面的分析。
本文介绍一种称为 MassSQUIRM（基于同位素还原性甲基化的质谱定量法）的方法，该方法利用氘代甲醛对胺基进行还原性甲基化，使所有赖氨酸残基均被二甲基化，从而使其成为基本相同的化学物种，因此具有相同的电离效率（图1B）。还原性甲基化后的唯一化学差异在于氢与氘，而这种差异不会影响基质辅助激光解吸电离（MALDI）的电离效率。MassSQUIRM 检测法特异性针对去甲基化反应产物，适用于含有未甲基化、单甲基化或二甲基化赖氨酸的样品。该方法同样适用于产生相同反应产物的赖氨酸甲基转移酶。在此，我们结合还原性甲基化化学与 MALDI 质谱技术，检测 LSD1（一种能够去除二甲基和单甲基基团的赖氨酸去甲基化酶）在合成肽底物上的酶活性5。该检测方法操作简便，任何具备实验室 MALDI 质谱仪或可通过蛋白质组学平台获取该设备的实验室均可开展。该方法具有约 8 倍的动态检测范围，并可轻松扩展至微孔板格式5。
方案
本方案修改自 Blair et al. 6。
1. LSD1 去甲基化实验
- 在终体积为 20 μL 的体系中，将 125 ng 重组 LSD1 与 0.25 μg 二甲基化组蛋白 H3 肽（ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-生物素）在去甲基化酶缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 8.5，50 mM KCl，5 mM MgCl2，5% 甘油）中混合。此外，设置一个不含酶的肽段对照组。该对照组用于第 3 部分，无需进行还原性甲基化。
- 在 37°C 下孵育 2 小时。
- 为收集肽段，向每个样品中加入 8 μL POROS R2 20 微米磁珠，并在室温下振荡 15 分钟。使用前将 1 体积磁珠与 1 体积甲醇混悬，再加入 10 体积的 5% 甲酸 / 0.2% 三氟乙酸进行预处理。
- 通过移液器吸取 20 μL 0.1% 三氟乙酸进入两个 C18 ZipTip 柱尖并推出，对柱尖进行预处理。重复此步骤两次（使用 0.1% 三氟乙酸），然后用 70% 乙腈 / 0.1% 三氟乙酸冲洗四次，最后再用 0.1% 三氟乙酸冲洗四次。
- 通过移液器将两个样品（对照组和去甲基化反应组）加载至预处理后的 C18 ZipTip 柱尖，将磁珠悬液加至柱尖内的 C18 树脂后方，并推动液体穿过柱尖。
- 用 20 μL 0.1% 三氟乙酸洗涤 ZipTip 柱尖两次。
- 用 40 μL 70% 乙腈 / 0.1% 三氟乙酸进行洗脱。
- 使用 SpeedVac 浓缩仪将每次洗脱液完全冻干。
2. 还原性甲基化
本实验方案的此部分内容修改自 Blair et al. 和 Rayment et al.6,7。
- 用 100 μL 的 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重悬去甲基化反应体系。
- 向去甲基化反应体系中加入 8 μL 的 15 mg/mL 二甲胺硼烷。二甲胺硼烷溶于 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，配制成 15 mg/mL 的储存液，需新鲜配制。
- 向去甲基化反应体系中加入 16 μL 的 250 mM 氘代甲醛。250 mM 氘代甲醛通过将储存液用 H2O 稀释制得，需新鲜配制。
- 在 4°C 下孵育 2 小时。
- 重复步骤 2.2、2.3 和 2.4。
- 重复步骤 2.2。
- 在 4°C 下孵育约 15 小时。
- 向去甲基化样品中加入 12.5 μL 的 1 M Tris（pH 7.4），以终止还原性甲基化反应。
3. 基质辅助激光解吸电离质谱
- 将 POROS R2 20 微米珠加入去甲基化反应中，并按照步骤 1.3-1.6 所述方法通过 ZipTip 收集。
注意：将对照品在100 μL、pH 7.4的50 mM磷酸盐缓冲液中重悬，并从第3.1步开始与其他样品同样处理。
- 使用 2 μL 的 33% 饱和 2,5-二羟基苯甲酸将对照组和去甲基化酶反应样品从 ZipTip 上洗脱至 MALDI 样品靶板。配制 33% 饱和 2,5-二羟基苯甲酸的方法：先用 70% 乙腈 / 0.1% TFA 配制 2,5-二羟基苯甲酸的饱和溶液，再用 70% 乙腈 / 0.1% TFA 将其稀释至 33% 饱和浓度。让洗脱后的样品自然干燥并结晶。
- 使用 PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF 质谱仪或可用的高分辨率 MALDI 质谱仪采集质谱数据8,9,10。
- 使用 PerkinElmerSciex TOFworks 软件或质谱仪制造商提供的软件查看质谱图并提取峰面积。
- 通过具备串联质谱功能的可用质谱系统进行 MS2 分析，以确认反应产物。
4. 数据分析
- 为了补偿使用重甲醛（图1B）所引起的同位素重叠，测定对照样品（未进行还原性甲基化）中13C2和13C4同位素峰面积（A）相对于单一同位素峰的比值（图2A）。
公式1：A13C2/A12C = r1
公式2：A13C4/A12C = r2
这将得到在您的实验条件和质谱仪下，肽段处于这些同位素状态的特异性比值（r1 和 r2）。 - 在去甲基化酶反应样品中，使用以下公式中的 r1 和 r2 值，定量各修饰状态下肽段的相对含量（图2B）：
公式3：H3K4me2 = A1
公式4：H3K4me = A2 - r1(A1)
公式5：H3K4 = A3 - r2(A1) - [r1(A2 - r1(A1))]
5. 代表性结果
利用LSD1，我们展示了MassSQUIRM在定量赖氨酸去甲基化反应中的有效性。如实验方案部分所述，我们使用125 ng的LSD1和0.25 μg二甲基化组蛋白H3肽（ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-生物素）进行了去甲基化酶反应。对照组和去甲基化酶反应样品均经过还原性甲基化处理，并进行MALDI质谱分析。未进行还原性甲基化的对照反应显示出该肽典型的同位素峰簇，并为公式1和公式2提供了峰面积（图2A）。去甲基化酶反应的质谱图则为公式3至公式5提供了峰面积（图2B）。根据对照组和去甲基化酶反应的峰面积计算，我们确定LSD1催化该肽生成如下反应产物：33.7%的Lys4二甲基化形式、42.3%的Lys4单甲基化形式以及24%的Lys4未甲基化形式。有关LSD1去甲基化酶活性的完整分析及抑制剂研究，请参见Blair et al. 6。请注意，改变反应时间、酶浓度和底物浓度等变量可实现对酶活性的深入分析。
图1. MassSQUIRM 方法概述。（A）组蛋白 H3 的一个N端肽段在赖氨酸4位点可处于未甲基化（绿色）、单甲基化（红色）或双甲基化（蓝色）状态。每种肽段化学组成的差异导致离子化效率不同，从而使定量分析变得复杂。（B）还原性甲基化将所有赖氨酸残基转化为双甲基化状态，使所有肽段的离子化行为趋于一致。在还原性甲基化反应中使用重甲醛可保留原始甲基化状态的信息。空心圆圈表示轻甲基化，实心圆圈表示重甲基化。 修改自 Blair et al. 20116。
图 2. MassSQUIRM 可用于定量差异甲基化的肽段。（A）采用质谱分析二甲基化合成组蛋白 H3 肽段（ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-生物素），并在方程 1 和方程 2 中将各峰相对于单一同位素峰的峰强比值记为 r1 和 r2。（B）将相同的合成肽段在去甲基化缓冲液中与 125 ng LSD1 于 37°C 孵育两小时，随后进行 MassSQUIRM 分析。重叠峰组成的混合峰群代表了三种不同的甲基化状态，如图 1B 所示。单一同位素峰下的面积分别记为 A1、A2 和 A3，并用于方程 3 至方程 5 的计算。空心圆圈表示轻度甲基化，实心圆圈表示重度甲基化。改编自 Blair 等，20116。
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讨论
MassSQUIRM 是一种经济且定量的方法，用于全面分析参与单甲基化和二甲基化过程的赖氨酸去甲基化酶的活性。MassSQUIRM 不仅能够定量反应产物，还能定量反应中间体。该检测方法可作为研究 LSD1 及其他组蛋白去甲基化酶作用机制的有力工具。它还将有助于对许多新发现的赖氨酸去甲基化酶（如 PHF8）进行分类，并可适用于某些甲基转移酶的研究。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢UAMS蛋白质组学中心提供的质谱技术支持。本项目的资助来自美国国立卫生研究院（NIH）基金项目P20RR015569、P20RR016460和R01DA025755。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LSD1 | BPS 生物科学 | 50100 | |
| H3K4me2-生物素化肽段 | 实验室制备 | 无 | |
| POROS R2 20 微米珠 | 应用生物系统公司 | 1-1129-06 | |
| C18 ZipTip | EMD Millipore | ZTC18M | |
| 三氟乙酸（TFA） | 赛默飞世尔科技公司 | 28904 | |
| 乙腈 | Fisher Scientific | A996 | |
| 2,5-二羟基苯甲酸 | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| 硼烷二甲胺 | Sigma-Aldrich | 180238 | |
| 同位素偏重 d2-甲醛 | 剑桥同位素实验室 | DLM-805-20 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| MgCl₂2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| 甘油 | Fisher Scientific | G33 | |
| 甲酸 | Fluka | 06440 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A452 | |
| Na-磷酸盐 | Fisher Scientific | BP329 | |
| SpeedVac 浓缩仪 | 天才 | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF 质谱仪和 TOFworks 软件 | 珀金埃尔默股份有限公司 | 无 |
参考文献
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
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重印与许可
