活体脾脏显微成像：寄生虫运动性与血流的定量分析

摘要

我们展示了利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因疟原虫进行脾脏活体显微成像的方法，并对疟原虫在该器官内的运动性及血流情况进行定量分析。

摘要

活体显微镜技术在实验性啮齿类疟疾模型中的应用，极大地推动了对寄生虫-宿主相互作用的认识 ^1,2因此， 体内 疟原虫在红细胞前阶段的成像研究揭示了其主动进入皮肤淋巴结的过程 ³寄生虫在皮肤中的完整发育过程 ⁴以及肝细胞来源的裂殖子囊形成，以确保裂殖子迁移并释放到血液中 ⁵此外，利用4D成像技术对红细胞内单个寄生虫的发育过程进行了最新记录，这一发现挑战了我们目前对疟疾中蛋白质输出机制的认知。 ⁶因此，活体成像技术极大地改变了我们对关键生物学事件的认知 疟原虫 发育。遗憾的是，由于技术限制，目前尚缺乏对疟原虫动态穿越脾脏过程的研究，脾脏作为主要的淋巴器官，具有高度适应性，可清除受感染的红细胞。

使用小鼠疟疾模型 疟原虫约氏种 在Balb/c小鼠中，我们实施了脾脏的活体成像，报道了在感染非致死性寄生虫株期间，脾脏发生差异性重塑，以及被寄生的红细胞（pRBCs）黏附于红髓中成纤维细胞来源的屏障细胞的现象 P. yoelii 17倍，而非感染的 P. yoelii 17XL 致死寄生虫株 ⁷为得出这些结论，开发了一种使用 ImageJ 免费软件的特定方法，以实现对单个感染性红细胞（pRBC）快速三维运动的表征。通过该方案获得的结果可用于确定寄生虫在脾脏中的运动速度、方向性和滞留时间，这些参数均与黏附特性相关 体内此外，我们报告了使用活体显微镜进行血流定量的方法，以及利用不同染色剂揭示脾脏复杂微循环结构的技术。

伦理声明

所有动物实验均在巴塞罗那大学的动物实验设施中进行，遵循巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（CEE-UB，批准编号 DMAH: 5429）批准的指南和规程。6至8周龄的雌性Balb/c小鼠购自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）。

方案

该方法已用于参考文献⁷所报道的研究中。

1. 用绿色荧光蛋白（GFP）转基因寄生虫感染动物

1. 利用先前报道的P. berghei⁸所用的相同载体、靶向策略和实验方案，构建了P. yoelii–GFP转基因株17XL和17X。这些株系在P. berghei延伸因子1（Pbeef1a）的组成型启动子驱动下表达GFP的突变体3（mutant 3 variant）⁹，可在整个红细胞内发育周期中持续表达GFP，并定位于寄生虫胞质中。
2. 将来自供体小鼠尾血、感染率为5–10%的P. yoelii-GFP转基因株17XL和17X感染红细胞（pRBCs）用PBS稀释后，以每只小鼠5×10⁵个pRBCs的剂量经腹腔注射接种动物，使感染后第3天（p.i.）外周血寄生虫率达到约1%。
3. 在感染后第3天，取小鼠尾血制备血涂片，经吉姆萨（Giemsa）染色后使用100倍油镜在光学显微镜下观察，检测两种寄生虫株感染小鼠的寄生虫率是否一致。通过计算三个视野（每个视野约含300个红细胞）中感染红细胞占总红细胞的百分比来估算寄生虫率。
4. 注射了FITC标记红细胞的对照动物可用于表征这些细胞在正常脾脏中的运动情况。

2. 使用 FITC 标记红细胞并注射至对照动物

1. 通过心脏穿刺采集一只 Balb/c 小鼠的全血 1 ml，加入含乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS 溶液（200 μl，EDTA 浓度为 100 g/L，pH 7.4），通过在室温（RT）下以 300 ×g 离心 5 分钟（min）洗涤红细胞沉淀，并用 PBS/EDTA（EDTA 浓度 0.1 g/L，pH 7.4）重悬。
2. 将 200 μl 红细胞沉淀重悬于 300 μl 含 FITC（10 g/L）的 PBS/EDTA（EDTA 浓度 0.1 g/L，pH 8.0）溶液中，在室温避光条件下轻轻振荡孵育 2 小时。孵育结束后，去除上清液，并用 PBS/EDTA（EDTA 浓度 0.1 g/L，pH 7.4）在室温下以 300 ×g 离心 5 分钟，洗涤细胞共五次。
3. 进行体内实验时，将 10 μl FITC 标记的红细胞沉淀用 200 μl PBS 稀释后，通过静脉注射注入 Balb/c 小鼠体内，以使循环血液中 FITC 标记的红细胞达到 1%。

3. 手术操作

1. 根据动物体重，配制每剂含100 mg/kg氯胺酮（Ketamine）和5 mg/kg咪达唑仑（Midazolam）的可注射麻醉剂。通过腹腔注射给予小鼠一剂麻醉剂。每30分钟追加半剂量，以维持小鼠全程麻醉状态。
2. 保持小鼠体温，并在操作前通过夹捏足垫确认小鼠已完全麻醉（通常在5–20分钟后）。
3. 为便于实验过程中进行静脉给药，使用27G套管针穿刺小鼠尾静脉。通过注入20–50 μl生理盐水缓冲液确认针头在静脉内的位置正确，并用胶带固定。若发生堵塞，应在该静脉上游重新进行套管置入。注意避免引入气泡。
4. 在动物左侧背部皮肤和肌肉上做一小切口，暴露脾脏下部。将脾脏置于呼吸运动最小的部位，并在其暴露表面滴加PBS，以清除小鼠毛发并保持组织湿润。
5. 使用氰基丙烯酸酯胶水（Loctite 3秒胶）将一块60×24 mm的盖玻片密封固定于脾脏周围的皮肤上，以便观察。

4. 脾脏中活体寄生虫的成像

1. 使用配备有温控孵育系统的 Leica TCS-SP5 共聚焦显微镜（Leica Microsystems，德国海德堡）、APO 63 倍甘油浸没物镜（数值孔径 1.3）、8000 行/秒谐振扫描器以及氩离子激光器（488 nm）和 HeNe 激光器（594 nm，633 nm）进行活体显微成像实验。根据表 1 所列探针的需要，可能还需使用其他激光器，例如蓝色二极管激光器（405 nm）和二极管泵浦固体激光器（561 nm）。
2. 将动物放置在显微镜载物台上，使覆盖有盖玻片的脾脏朝下对准物镜。可选使用 20 倍物镜观察脾脏微循环结构的整体视图。红细胞反射对比度有助于后续在更高放大倍数下选择不同的成像感兴趣区域。
3. 利用组织自发荧光，通过 63 倍甘油浸没物镜聚焦选定的感兴趣区域。可观察到表达 GFP 的寄生虫穿过脾脏的不同区域。
4. 荧光信号在两个不同通道中记录（FITC/GFP 的激发/发射波长为 488/505–580 nm，组织自发荧光为 488/570–630 nm），针孔设置为 3.0 爱里单位。红细胞反射信号（488/480–495 nm）结合用于标记血流系统的荧光染料（见表 1），可用于获取成像区域及下文所述血流实验中的额外信息。
5. 由于器官具有三维结构，以 8 kHz 的速度采集覆盖 8 μm 深度的五个 Z 轴层析图像，以生成时长为 1.5 分钟的视频。
6. 记录脾脏不同区域的视频，用于定量分析。

5. 脾脏微血管的活体显微观察及血流测量的图像采集

1. 在实验过程中，可将溶于等渗盐水中的活体荧光探针经尾静脉注射，用于血管系统的成像，并深入了解脾脏结构。表1¹⁰列出了探针及其应用。
2. 为用荧光葡聚糖标记血管系统，将1 mg Texas Red标记的70 kDa葡聚糖溶解于100 μl生理盐水中进行配制。
3. 通过已插管的尾静脉将荧光葡聚糖注射至待成像动物体内。
4. 通过光学视野旋转（不影响扫描速度）使血管呈水平方向，与激光扫描方向一致。在血管中央管腔中使用xy和xt线扫描模式。采用双向扫描，线平均为32，扫描速度为8 kHz，获得512×512像素的图像。
5. 在三个不同通道上采集血管图像（激发/发射波长分别为488/505-580 nm、594/605-660 nm、488/480-495 nm，对应FITC/GFP、葡聚糖–Texas Red和红细胞反射）。
6. 采集不同直径血管以及心动周期不同阶段的图像，以校正血流波动。在这些图像中，运动细胞产生的条纹将用于量化血流速度¹¹。

6. 使用 ImageJ 软件进行图像处理及寄生虫运动能力的定量分析

1. 使用 ImageJ 软件（版本 1.39o，Wayne Rasband，NIH，www.macbiophotonics.ca）生成的图像序列创建实时视频。
2. 在 ImageJ 中打开“.lif”文件，保持“xyzct”序列并分离各通道。
3. 从元数据文件中记录一些有用信息：dblvoxelX-体素宽度、dblvoxelY-体素高度、dblvoxelZ-体素深度，以及连续 Z 帧之间和图像堆栈之间的时间帧间隔。这些信息将用于校准。
4. 从 GFP 标记的寄生虫图像（通道 1）中减去自发荧光信号（通道 2）。使用高斯模糊滤波器（Gaussian Blur=1）对图像进行滤波处理。请注意，在发表文章中使用高斯模糊滤波器必须予以声明。将文件保存为“animal1_m1_substract.seq”。
5. 生成一个以 Z 轴编码颜色的视频作为支持材料，用于对寄生虫运动能力的定量分析，该视频有助于快速移动颗粒的单粒子识别以及 Z 轴运动特征的表征。
6. 将图像堆栈转换为 5D 图像，其中第三维为 Z 轴，第四维为时间。为每个 Z 层赋予不同颜色并进行叠加。
7. 对所有时间帧中的 Z 层使用最大强度投影，生成 Z 编码颜色视频。保存为“animal1_m1_Z_color.avi”。
8. 根据颗粒在视频前 10 个时间帧中出现的停留帧数（从 1 到 10）对所有出现的颗粒进行分类和标记。在每个视频中，将按照获得的比例追踪 20 个颗粒。总共将从 3 只动物中量化 120 个寄生虫，每只动物使用代表脾脏不同区域的六段视频。
9. 报告所有待量化颗粒在每个 Z 层以及整个视频中的停留帧数。
10. 使用 MTrackJ 插件（由 E. Meijering 编写）对颗粒进行四维（x, y, z, t）手动追踪。将文件“animal1_m1_substract.seq”作为 5D 图像打开，并根据先前记录的像素宽度、高度、深度（单位：μm）和堆栈时间间隔（单位：秒）设置图像属性。配置追踪参数如下：“跳转到下一时间点”和“应用局部光标亮度质心/25×25 像素”。显示设置配置如下：“显示起点”、“显示图像”、“显示当前轨迹”、“仅显示当前通道中存在的轨迹”、“仅显示当前时间点的轨迹点”。
11. 为每个颗粒添加一条轨迹。仅当 Z 轴位移大于 6 μm（pRBC 的平均直径）时，才视为存在 Z 轴方向的运动。对每个颗粒最多追踪 100 个帧。
12. 将从轨迹中测得的 x、y、z 和 t 坐标保存为“animal1_m1_p1”.xls。
13. 位移（D=SQRT((x_final-x_initial)²+(y_final-y_initial)²+(z_final-z_initial)²)）；路径长度（P=Σ_n=0→final SQRT((x_n+1-x_n)²+(y_n+1-y_n)²+(z_n+1-z_n)²)），其中 n 表示每次追踪的位置；平均速度和停留时间可根据已校准的 x, y, z, t 坐标数据计算得出。颗粒的运动方向性定义为位移与路径长度的比值，比值接近 1 表示定向运动，比值接近 0 表示受限运动¹²。随附提供了计算模板。

7. 血流量的体积计算

1. 体积血流量估算公式为 Q=V*π*D_v²/4，其中 V 为红细胞在横截面上的速度，D_v 为血管管腔直径¹¹。
2. 为计算 V，使用 ImageJ 软件测量每张 xt 图像中五条显示明亮反射（红细胞）的粒子轨迹角度（θ），以及四条显示绿色荧光（pRBC-GFP）的粒子轨迹角度（θ）；在 xy 图像上测量血管管腔直径。
3. 随后将速度表示为 V=1/tan(θ)*D_e/D_v，以对红细胞直径（D_e=6 μm）和血管管腔直径进行归一化处理。
4. 需定量分析至少三条不同直径的血管，每条血管至少五张 xt 图像。

8. 统计分析

1. 进行统计分析时，将方向性、平均速度和停留时间绘制成密度分布图，并在 STATA（IC10）中使用中位数相等性检验来评估两条寄生虫株系之间的差异。

9. 代表性结果

对脾脏中表达GFP的寄生虫进行活体成像，揭示了两种寄生虫株在运动能力上的差异。对单个寄生虫运动参数的定量分析表明，感染17X株的小鼠体内寄生虫速度降低、运动方向性缺失且停留时间延长。此外，不同菌株之间的血管内体积血流量未见显著差异⁷。技术操作流程见图1A。图1B展示了注射了FITC标记红细胞的小鼠正常脾脏的整体图像，其中分别对红髓区域和血管进行了局部放大（图1B，放大图1和2）。通过共同注射70 kDa Dextran-Texas Red及利用红细胞反射对比成像，可清晰显示血管结构。表1总结了其他可用的荧光染料，可用于获取被成像器官的相关信息，例如Hoechst（图1C、1D）。

17XL 和 17X 菌株寄生虫的实时成像结果分别展示于影片 1 和影片 2 中，其中一些 17X 感染的红细胞（影片 2）表现出滚动环状行为。通过 Z 编码彩色图像对单个寄生虫进行追踪，实现了对运动参数的定量分析。图 2A 显示了一个 Z 编码彩色图像堆栈的 Z 投影，其中被圈出的颗粒在不同焦平面上移动。图 2B 和 2C 分别代表 17X 和 17XL 感染中不同寄生虫的运动轨迹。所有被定量颗粒的方向性和停留时间结果分别以寄生虫群体的密度分布图形式展示于图 2D 和 2E 中。为了利用活体显微镜监测脾脏中的血流，通过测量血管中央管腔在 xt 图像中由红细胞运动产生的条纹来计算流速¹¹。图像显示了血管的 xy 扫描（图 2F）及其对应的 xt 线扫描图（图 2G）。

荧光探针	定位	单光子激发（nm）	双光子激发（nm）	检测发射波长（nm）	用量/小鼠体重
Hoechst 33342	可穿透细胞膜的DNA结合探针。静脉注射后可标记所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核。	405	800	410-480	12.5 g/Kg
碘化丙啶	不可穿透细胞膜的DNA结合探针。可标记细胞膜受损细胞（凋亡和坏死细胞）的细胞核。	561	800	570-650	250 mg/Kg
70,000 分子量葡聚糖-荧光素（FITC，德克萨斯红）	液相示踪剂，可增强血浆对比度。	FITC 488 Texas Red 594	800	500-540 600-650	50 mg/Kg
荧光素钠	大分子液相白蛋白示踪剂，可增强血浆对比度。	488	800	500-540	2 mmol/Kg
伊文思蓝	大分子液相白蛋白示踪剂，可增强血浆对比度。	633	nd	645-700	20 mg/Kg
罗丹明R6	活体探针，可在活性线粒体中积累。静脉注射后可标记内皮细胞和循环白细胞。	561	800	570-650	25 mg/Kg
Fluospheres- 1微米直径	可被具有吞噬活性的细胞摄取的微球。	488	800	500-540	nd
Alexa488标记的纤维蛋白IIβ链特异性抗体	可标记纤维蛋白IIβ链的探针	488	800	500-540	0.3 mg/Kg

表1. 活体显微镜用荧光探针。可用于体内标记脾脏、具有不同定位特性的活体荧光染料。表中提供了适用于单光子（或双光子显微镜）的激发/发射（Exc/em）波长范围。所示剂量需溶于0.1–0.2 ml生理盐水缓冲液中，并通过小鼠尾静脉注射。[nd：本研究中未确定]

图1. 脾脏活体显微成像。A. 配备一只小鼠的 Leica TCS-SP5 共聚焦显微镜，小鼠被放置在显微镜载物台上，其脾脏下部暴露并用盖玻片密封。B. 注射了FITC标记的红细胞和70 kDa德克斯特兰-德克萨斯红（Dextran-Texas Red）以显示血管系统的非感染动物脾脏代表性区域图像。图中显示反射信号（黄色）、德克斯特兰（蓝色）和FITC标记的红细胞（绿色）。白色框内的放大区域分别代表开放循环（1）和闭合循环（2）区域。开放循环(C)和闭合循环(D)用70 kDa德克斯特兰（红色）和Hoechst 33342（蓝色）染色。

图2. 寄生虫运动性与血流的定量分析。A-C。通过使用颜色编码的图像处理，可实现对四维（4D）粒子运动的定量分析。A. 利用Z编码彩色图像的深度信息进行追踪，图像以五个不同深度的最大强度投影表示。白色矩形代表同一粒子在某一时间点不同Z位置。不同位置是由于采集不同Z层面图像之间存在时间间隔所致。深度编码：黄色（0 μm）、橙色（2 μm）、粉红色（4 μm）、蓝色（6 μm）、绿色（8 μm）。B, C. 粒子运动的时间投影，每个时间区间以不同颜色表示：灰色（0–2.4 秒）、青色（2.4–4.8 秒）、洋红色（4.8–7.0 秒）、红色（7.0–9.4 秒）和黄色（9.4–11.8 秒）。白色线条表示使用MTrackJ对17X（11.8 s）(B) 和17XL（4.8 sec）(C) GFP寄生虫粒子的手动4D追踪结果。D,E. GFP粒子按方向性值(D) 和停留时间(E) 的密度分布。数据来自三次独立实验，包括每种寄生虫株系各120个粒子以及100个FITC标记的红细胞，采用中位数相等性检验进行分析。17X/17XL/FITC-红细胞的中位数分别为0.53/0.75/0.85 (D) 和4.61/0.67/0.9 秒(E)。两种寄生虫株系在(D) 和(E) 中的差异具有统计学显著性（P < 0.001）。FITC标记红细胞与17XL寄生虫之间的差异无统计学显著性（P > 0.05）。F,G. 脾脏血流测量。来自同一血管中央管腔（白线）线扫描的xy图像(F) 和xt图像(G) 的表示。脾脏血管显示含有70 kDa葡聚糖（红色）、感染性红细胞（绿色）以及红细胞反射信号（蓝色）的血浆。

视频 1 和 2。 小鼠脾脏感染 17XL (1) 或 17X (2) GFP 转基因寄生虫后在 10% 寄生率下的延时活体显微镜图像（Z 轴最大投影）。寄生虫和组织的自发荧光分别显示为绿色和红色。比例尺为 10 μm，时间间隔单位为秒。
点击此处观看视频 1。
点击此处观看视频 2。

讨论

在该啮齿类疟疾模型中实施脾脏活体显微技术，使得研究疟原虫动态通过这一器官成为可能，而此前由于技术限制，该器官一直被视为一个“黑箱”。本文投入了大量努力，以建立一种定量方法，可在单个及群体水平上对不同疟原虫株系进行比较分析。与先前在疟疾研究中已成像的其他组织和细胞相比^3,5，对红细胞内期疟原虫（pRBCs）通过脾脏过程的成像需考虑该器官的三维结构与区室化特征、存在快慢不同的多种循环系统¹³，以及红细胞高速流动的特性。为此，我们开发了一种特定方法，利用在线可获取的 ImageJ 软件，实现单个疟原虫的追踪、运动性分析以及群体水平上不同株系间的比较。然而，在此背景下仍需开发能够自动识别并追踪单个疟原虫的软件工具。值得注意的是，用于描述疟原虫运动性的参数此前已在其他研究中用于报告淋巴细胞在体内的募集与黏附行为in vivo^12,14,15。因此，该方法学及参数可被视为研究疟疾中黏附现象的 in vivo 新工具。未来，我们将利用该技术，通过成像表达荧光报告基因的转基因小鼠中不同细胞类型的感染过程，深入探究疟原虫与脾脏细胞相互作用的免疫生物学机...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leica TCS-SP5 共聚焦显微镜	Leica Microsystems	TCS-SP5 序列号 5100000419
氯胺酮（Ketolar 50 mg/ml）	Pfizer Pharma GmbH	631028
咪达唑仑 15 mg/3 ml	Normon	838193
70,000 分子量的葡聚糖，偶联德克萨斯红	Molecular Probes, Life Technologies	D1830
异硫氰酸荧光素，异构体 I (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	H1399
吉姆萨染液	Sigma-Aldrich	GS1	工作液为蒸馏水中稀释成 10%
乐泰 3 秒胶	Loctite	9975-0880