方法文章

活体脾脏显微成像：寄生虫运动性与血流的定量分析

DOI：

10.3791/3609

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2012年1月14日

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1Department of poverty related diseases, Barcelona Centre for International Health Research, 2Confocal Microscopy Unit, University of Barcelona- Scientific and Technological Centers, 3Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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我们展示了利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因疟原虫进行脾脏活体显微成像的方法，并对疟原虫在该器官内的运动性及血流情况进行定量分析。

摘要

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活体显微镜技术在实验性啮齿类疟疾模型中的应用，极大地推动了对寄生虫-宿主相互作用的认识 1,2因此， 体内 疟原虫在红细胞前阶段的成像研究揭示了其主动进入皮肤淋巴结的过程 3寄生虫在皮肤中的完整发育过程 4以及肝细胞来源的裂殖子囊形成，以确保裂殖子迁移并释放到血液中 5此外，利用4D成像技术对红细胞内单个寄生虫的发育过程进行了最新记录，这一发现挑战了我们目前对疟疾中蛋白质输出机制的认知。 6因此，活体成像技术极大地改变了我们对关键生物学事件的认知 疟原虫 发育。遗憾的是，由于技术限制，目前尚缺乏对疟原虫动态穿越脾脏过程的研究，脾脏作为主要的淋巴器官，具有高度适应性，可清除受感染的红细胞。

使用小鼠疟疾模型 疟原虫约氏种 在Balb/c小鼠中，我们实施了脾脏的活体成像，报道了在感染非致死性寄生虫株期间，脾脏发生差异性重塑，以及被寄生的红细胞（pRBCs）黏附于红髓中成纤维细胞来源的屏障细胞的现象 P. yoelii 17倍，而非感染的 P. yoelii 17XL 致死寄生虫株 7为得出这些结论，开发了一种使用 ImageJ 免费软件的特定方法，以实现对单个感染性红细胞（pRBC）快速三维运动的表征。通过该方案获得的结果可用于确定寄生虫在脾脏中的运动速度、方向性和滞留时间，这些参数均与黏附特性相关 体内此外，我们报告了使用活体显微镜进行血流定量的方法，以及利用不同染色剂揭示脾脏复杂微循环结构的技术。

伦理声明

所有动物实验均在巴塞罗那大学的动物实验设施中进行，遵循巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（CEE-UB，批准编号 DMAH: 5429）批准的指南和规程。6至8周龄的雌性Balb/c小鼠购自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）。

方案

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该方法已用于参考文献7所报道的研究中。

1. 用绿色荧光蛋白（GFP）转基因寄生虫感染动物

  1. 利用先前报道的P. berghei8所用的相同载体、靶向策略和实验方案，构建了P. yoelii–GFP转基因株17XL和17X。这些株系在P. berghei延伸因子1（Pbeef1a）的组成型启动子驱动下表达GFP的突变体3（mutant 3 variant）9，可在整个红细胞内发育周期中持续表达GFP，并定位于寄生虫胞质中。
  2. 将来自供体小鼠尾血、感染率为5–10%的P. yoelii-GFP转基因株17XL和17X感染红细胞（pRBCs）用PBS稀释后，以每只小鼠5×105个pRBCs的剂量经腹腔注射接种动物，使感染后第3天（p.i.）外周血寄生虫率达到约1%。
  3. 在感染后第3天，取小鼠尾血制备血涂片，经吉姆萨（Giemsa）染色后使用100倍油镜在光学显微镜下观察，检测两种寄生虫株感染小鼠的寄生虫率是否一致。通过计算三个视野（每个视野约含300个红细胞）中感染红细胞占总红细胞的百分比来估算寄生虫率。
  4. 注射了FITC标记红细胞的对照动物可用于表征这些细胞在正常脾脏中的运动情况。

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讨论

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在该啮齿类疟疾模型中实施脾脏活体显微技术，使得研究疟原虫动态通过这一器官成为可能，而此前由于技术限制，该器官一直被视为一个“黑箱”。本文投入了大量努力，以建立一种定量方法，可在单个及群体水平上对不同疟原虫株系进行比较分析。与先前在疟疾研究中已成像的其他组织和细胞相比3,5，对红细胞内期疟原虫（pRBCs）通过脾脏过程的成像需考虑该器官的三维结构与区室化特征、存在快慢不同的多种循环系统13，以及红细胞高速流动的特性。为此，我们开发了一种特定方法，利用在线可获取的 ImageJ 软件，实现单个疟原虫的追踪、运动性分析以及群体水平上不同株系间的比较。然而，在此背景下仍需开发能够自动识别并追踪单个疟原虫的软件工具。值得注意的是，用于描述疟原虫运动性的参数此前已在其他研究中用于报告淋巴细胞在体内的募集与黏附行为in vivo12,14,15。因此，该方法学及参数可被视为研究疟疾中黏附现象的 in vivo 新工具。未来，我们将利用该技术，通过成像表达荧光报告基因的转基因小鼠中不同细胞类型的感染过程，深入探究疟原虫与脾脏细胞相互作用的免疫生物学机.......

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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我们特别感谢 S. Graewe 和 V. Heussler 在疟原虫活体显微镜技术方面的初期培训和持续指导，感谢 J. Burns 捐赠 GFP 转基因寄生虫，感谢 A. Bosch（巴塞罗那大学细胞与分子生物学中心成像平台，IDIBAPS）在图像分析与定量方面的协助，以及 P. Astola 提供的技术支持。我们感谢 R. Tous 和 I. Caralt 在视频制作方面的贡献。MF 获得了加泰罗尼亚自治区研究生奖学金的资助。HAP 是 ICREA 研究教授。HAP 实验室的工作由欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号 N° 242095、西班牙加泰罗尼亚私人性质的 CELLEX 基金会以及西班牙科学与创新部（SAF2009-07760）共同资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Leica TCS-SP5 共聚焦显微镜Leica MicrosystemsTCS-SP5 序列号 5100000419
氯胺酮（Ketolar 50 mg/ml）Pfizer Pharma GmbH631028
咪达唑仑 15 mg/3 mlNormon838193
70,000 分子量的葡聚糖，偶联德克萨斯红Molecular Probes, Life TechnologiesD1830
异硫氰酸荧光素，异构体 I (FITC)Sigma-AldrichF7250
H–chst 33342Sigma-AldrichH1399
吉姆萨染液Sigma-AldrichGS1工作液为蒸馏水中稀释成 10%
乐泰 3 秒胶Loctite9975-0880

参考文献

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  1. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
  2. Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).

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重印与许可

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GFP ImageJ

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