构建用于递送负载干细胞的壳聚糖微球的胶原水凝胶

摘要

目前干细胞治疗面临的主要障碍之一是确定将这些细胞递送至宿主组织的最有效方法。在此，我们描述了一种基于壳聚糖的递送方法，该方法操作简便且效率高，同时能够维持脂肪来源干细胞的多向分化潜能。

摘要

多能干细胞已被证明在再生医学领域具有极高的应用价值^1-3然而，为了有效地将这些细胞用于组织再生，必须考虑多个变量，包括植入部位的总体积和表面积、组织的机械特性以及组织微环境，后者涉及血管化程度和细胞外基质的组成成分。因此，用于递送这些细胞的材料必须具有明确化学组成的生物相容性，同时保持与宿主组织相仿的机械强度。这些材料还必须允许氧气和营养物质透过，以提供有利于细胞黏附和增殖的微环境。壳聚糖是一种具有良好生物相容性的阳离子多糖，易于进行化学修饰，并具有高亲和力以结合 体内 大分子^4-5壳聚糖模拟细胞外基质中的糖胺聚糖组分，使其能够作为细胞黏附、迁移和增殖的基质。在本研究中，我们采用微球形式的壳聚糖将脂肪源性干细胞（ASC）递送至基于胶原蛋白的三维支架中⁶. 针对孵育时间和细胞密度确定了理想的细胞与微球比例，以实现可负载细胞数量的最大化。一旦脂肪来源干细胞（ASC）接种到壳聚糖微球（CSM）上，即可将其包埋于胶原支架中，并可在体外培养中长期维持。总之，本研究提供了一种将干细胞精确递送至三维生物材料支架中的方法。

方案

1. 分离脂肪来源的干细胞（ASC）

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。

1. 按照先前所述方法⁶，分离大鼠肾周和附睾周围脂肪组织，并用含1%胎牛血清（FBS）的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤。
2. 将组织切碎，取1–2 g转移至含有25 mL含1% FBS的HBSS的50 mL离心管中，于室温下以500 g离心8分钟。
3. 收集漂浮的脂肪组织层，转移至125 mL锥形瓶中，加入25 mL HBSS中的II型胶原酶（200 U/mL），在37 °C下于旋转摇床（125 rpm）中消化45分钟。
4. 小心移除液体部分（位于油层和脂肪组织层下方），依次通过100 μm和70 μm的尼龙筛网过滤。将滤液于室温下以500 g离心10分钟，吸除上清液，并用25 mL HBSS将沉淀物洗涤两次。
5. 将细胞沉淀重悬于50 mL生长培养基（MesenPRO RS基础培养基）中，该培养基添加了MesenPRO RS生长补充剂、抗生素-抗真菌剂（100 U/mL青霉素G、100 μg/mL硫酸链霉素和0.25 μg/mL两性霉素B）以及2 mM L-谷氨酰胺，然后将细胞悬液分装至两个T75培养瓶中（每瓶25 mL）。
6. 将ASC在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中培养（所有实验均使用第2–4代ASC）。

2. 制备壳聚糖微球（CSM）

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

1. 采用水包油乳化法结合离子凝聚技术制备CSM，具体步骤依据我们先前的方案⁶。将6 mL含3%w/v壳聚糖的水溶液（溶于0.5 M乙酸中）在100 mL油相混合物中乳化，油相由大豆油、正辛醇（1:2 v/v）及5%的失水山梨醇单油酸酯（Span 80）乳化剂组成；使用顶置搅拌器（1700 rpm）和磁力搅拌器（1000 rpm）同时反向搅拌。这种双重搅拌方式可确保在交联发生前形成的胶束保持悬浮状态，不会沉降至容器底部。此外，磁力搅拌子有助于在胶束形成和固化过程中防止壳聚糖聚集。
2. 持续搅拌混合物约1小时，直至形成稳定的水包油乳液。每15分钟加入1.5 mL溶于正辛醇的1% w/v氢氧化钾溶液，共加入4小时（总计24 mL），以启动离子交联反应。
3. 交联反应完成后，缓慢倾去含有CSM的油相，并立即将微球加入100 mL丙酮中。用丙酮反复洗涤微球，直至完全去除油相。
4. 将回收的微球置于真空干燥器中干燥，并直接进行分析，无需进一步处理。采用粒径分析仪测定CSM的平均粒径、每毫克比表面积及单位立方体积。
5. 后续实验前，用无菌水洗涤CSM三次，以去除残留盐分，并用无水乙醇进行灭菌处理。

3. 测定 CSM 中游离氨基的数量

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。

1. 采用Bubins和Ofner⁷的三硝基苯磺酸（TNBS）法测定离子交联后CSM中游离氨基的数量。将5 mg微球与1 mL含0.5% TNBS的溶液置于50 mL玻璃试管中，在40 °C下孵育4 h，随后加入3 mL 6N HCl，在60 °C下水解2 h。
2. 将样品冷却至室温，加入5 mL去离子水和10 mL乙醚，萃取游离的TNBS。
3. 取5 mL水相部分，于水浴中在40 °C加热15 min以蒸发残留的乙醚，冷却至室温后，用15 mL水稀释。
4. 使用分光光度计在345 nm处测定吸光度，以不含壳聚糖的TNBS溶液作为空白对照，并以用于制备CSM的壳聚糖样品测定总氨基数量，据此估算CSM相对于壳聚糖的游离氨基数量。

4. 在 CSM 中加载 ASC

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。

1. 将第 2.5 节中 5 mg 无菌 CSM 用无菌 HBSS 过夜平衡，并加入到 8-μm 孔径的膜培养板插件（24 孔板）中。
2. 待 CSM 沉降至膜上后，小心吸除 HBSS，并在插件内侧加入 300 μL 生长培养基，外侧加入 700 μL 生长培养基。
3. 将 ASC 以适当浓度（1 × 10⁴ 至 4 × 10⁴）重悬于 200 μL 生长培养基中，接种至培养板插件内的 CSM 上。接种后，培养插件内的培养基终体积为 500 μL。
4. 将接种有 ASC 的 CSM 在 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育 24 小时。

5. 测定 CSM 中 ASC 的载量百分比和细胞活力

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。

1. 孵育结束后，将载有 ASC 的 CSM 收集到无菌的 1.5 ml 微量离心管中，注意不要扰动已迁移至小室膜内的细胞。
2. 去除残留培养基，向管中加入 250 μL 新鲜生长培养基。
3. 向每管中加入 25 μL MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐] 溶液（5 mg/mL），在 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育 4 小时。
4. 孵育结束后，吸去培养基，加入 250 μL 二甲基亚砜，涡旋混合 2–5 分钟以溶解甲臜复合物。
5. 将 CSM 在 2700 x g 下离心 5 分钟，测定上清液在 570 nm 处的吸光度，以 630 nm 为参比波长。
6. 根据已知数量的活 ASC 所获得的吸光度值，确定与 CSM 相关的细胞数量。

6. 表征含 ASC-CSM 的胶原凝胶

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。

1. 将负载ASC的CSM（5 mg，约含2 × 10⁴个细胞）与来自大鼠尾腱的I型胶原蛋白（7.5 mg/mL）混合，胶原蛋白提取方法参照Bornstein⁸所述，随后用2 N NaOH调节pH至6.8，诱导纤维化。
2. 将纤维化的胶原蛋白-ASC-CSM混合物加入12孔板中，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育30分钟。
3. 待完全纤维化后，将胶原蛋白-ASC-CSM凝胶在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中继续孵育最多14天。
4. 使用标准显微镜技术观察细胞从CSM向凝胶中的释放与迁移情况。

7. 代表性结果

在本研究中，我们开发了一种 体外 将干细胞从壳聚糖微球（CSM）递送至胶原凝胶支架的策略。制备了具有均匀尺寸（直径175–225 μm）和组分的多孔CSM，并用作细胞载体（图2）。将ASC与CSM共孵育后，细胞在2 x 10的浓度下贴壁⁴ 细胞/5 mg CSM。细胞能够在微球表面铺展，并将伪足伸入微球的多孔缝隙中（图3）。一旦将载有细胞的 CSM 与胶原凝胶混合，细胞即开始迁移进入凝胶中（图4).

表1. 壳聚糖与胶原蛋白在干细胞递送系统中应用的生物学优势。

图 1. 示意图展示 ASC-CSM 负载胶原支架双重用途的整体策略。图 2、图 3 和图 4 在示意图中进行了标注，以帮助解读图像内容。

图2. 示意图展示将干细胞接种到壳聚糖微球上的过程。该过程涉及在具有8-μm孔径的膜培养板插入物中将ASC与CSM进行共培养。24小时后，将微球从插入物中取出，即可用于包埋至生物材料基质中。

图3. 负载ASC的CSM的形态学表征。图A显示了负载ASC的CSM的光学显微图像，而图B展示了同一视野叠加共聚焦荧光显微镜图像的结果。ASC预先用钙黄绿素AM（绿色）孵育标记。图C为未负载细胞的微球的扫描电镜图像，图D显示细胞附着在微球表面（星号所示）。图E的透射电镜图像展示了未负载细胞微球的横截面，可见微球内部存在大量孔隙和裂隙。图F显示微球横截面中细胞（箭头所示）附着于孔隙结构，并向裂隙中延伸出丝状伪足。原始放大倍数：A & B = 70X；C = 500X，D = 2,000X；E & F = 2,500X。

图 4. ASC 从 CSM 迁移进入三维胶原支架。图 A 和 B 显示了第 3 天细胞从微球体迁移至胶原基质中的 CSM 情况（A，箭头所示）。图 B 显示了培养 12 天后的类似情况。透射电子显微镜（TEM）图像见图 C、D 和 E。图 C 和 D 中的星号表示被横切的微球体，细胞正从微球体向外迁移（箭头所示）。图 E 为图 D 的高倍放大图像，显示细胞丝状伪足附着于胶原原纤维（插图）。原始放大倍数：A&B = 100×；C&D = 6,000×；E = 20,000×，插图 = 150,000×。

图 5. 示意图展示 CSM 在再生医学和药物递送中的广泛应用。

讨论

基于干细胞的治疗面临的一个主要障碍是开发出将细胞高效递送至特定修复区域的方法。由于患者之间的个体差异，以及组织类型、损伤面积和深度的不同，干细胞的递送方法必须根据具体情况进行个体化确定。尽管将干细胞包埋于基质中并递送至损伤部位似乎是组织工程中合乎逻辑的下一步策略，但仍存在一些技术难题。其中包括包埋细胞与基质的黏附能力，以及能否提供一种生物相容性良好的微环境，使细胞能够黏附、增殖并重建适宜的微环境，从而避免失巢凋亡（anoikis）^9-10。该过程要求细胞上调其基质重塑相关机制，而这一过程可能需要数天时间才能完成，之后才能实现干细胞的增殖、迁移和分化等理想细胞行为。为克服这些问题，我们开发了一种方法：在将干细胞嵌入合适的基质以修复受损组织之前，预先将其负载于壳聚糖微球（chitosan microspheres, CSM）上。利用我们独特的离子交联方法制备微球，该方案可使>90%的微球直径控制在175–225 μm范围内，从而形成一种理想的微米级细胞载体。更重要的是，交联后的微球仍保持正电荷，这非常有利于细胞的黏附。这些微球特性使得干细胞能够快速黏附至CSM表面。一旦黏附，这些负载干细胞的微球在支架（如胶原蛋白...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
汉克斯平衡盐溶液 (HBSS)	GIBCO, by Life Technologies	14175	耗材
胎牛血清	Hyclone	SH30071.03	耗材
II型胶原酶	Sigma-Aldrich	C6685	耗材
70-μm 尼龙筛网滤器	BD Biosciences	352350	耗材
100-μm 尼龙筛网滤器	BD Biosciences	352360	耗材
MesenPRO 生长培养基系统	Invitrogen	12746-012	耗材
L-谷氨酰胺	GIBCO, by Life Technologies	25030	耗材
T75 组织培养瓶	BD Biosciences	137787	耗材
壳聚糖	Sigma-Aldrich	448869	耗材
乙酸	Sigma-Aldrich	320099	耗材
正辛醇	Acros Organics	150630025	耗材
司盘-80	Sigma-Aldrich	S6760	耗材
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	P1767	耗材
丙酮	Fisher Scientific	L-4859	耗材
乙醇	Sigma-Aldrich	270741	耗材
三硝基苯磺酸	Sigma-Aldrich	P2297	耗材
盐酸	Sigma-Aldrich	320331	耗材
乙醚	Sigma-Aldrich	472-484	耗材
8-μm 组织培养板插件	BD Biosciences	353097	耗材
1.5 ml 微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129	耗材
MTT试剂	Invitrogen	M6494	耗材
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8779	耗材
Qtracker 细胞标记试剂盒 (Q tracker 655)	Molecular Probes, Life Technologies	Q2502PMP	耗材
I型胶原蛋白	Travigen	3447-020-01	耗材
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045	耗材
12孔组织培养板	BD Biosciences	353043	耗材
离心机	Eppendorf	5417R	设备
轨道摇床	New Brunswick Scientific	C24	设备
含5% CO2的加湿培养箱	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Model 370	设备
顶置式搅拌器	IKA	Visc6000	设备
磁力搅拌器	Corning	PC-210	设备
真空干燥器	-	-	设备
粒径分析仪	Malvern Instruments	STP2000 Spraytec	设备
水浴锅	Fisher Scientific	Isotemp210	设备
分光光度计	Beckman Coulter Inc.	Beckman Coulter DU800UV/可见光分光光度计	设备
涡旋振荡器	Diagger	3030a	设备
酶标仪	Molecular Devices	SpectraMax M2	设备
光学/荧光显微镜	Olympus Corporation	IX71	设备
共聚焦显微镜	Olympus Corporation	FV-500 激光扫描共聚焦显微镜	设备
扫描电子显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Leo 435 VP	设备
透射电子显微镜	JEOL	JEOL 1230	设备