在本视频文章中，我们介绍了一种新型方法的使用 离体 急性单纯疱疹病毒Ⅰ型角膜上皮感染模型
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摘要
摘要
单纯疱疹性角膜炎是与单纯疱疹病毒1型（HSV-1）相关的最严重疾病之一。目前，单纯疱疹性角膜炎是发达国家中由角膜病变引起以及与感染相关失明的首要原因。单纯疱疹性角膜炎的典型表现为角膜上皮感染，有时还累及较深的角膜基质和内皮，导致角膜出现瘢痕、变薄和混浊等永久性病理改变1。
角膜HSV-1感染的传统研究采用两种实验模型。体外模型是在培养皿中感染培养的角膜上皮细胞单层，具有操作简便、可重复性高、实验周期短和相对成本较低的优点。另一方面，体内模型则是直接在动物（如兔子或小鼠）的角膜上接种病毒，虽能提供高度复杂的生理系统，但成本较高、实验周期较长，需要动物饲养管理，且变异性更大。
在本视频文章中，我们详细演示了一种新的角膜上皮 HSV-1 感染的离体（ex vivo）模型，该模型结合了体外（in vitro）和体内（in vivo）模型的优势。该离体（ex vivo）模型利用在培养条件下器官型维持完整的角膜，并用 HSV-1 进行感染。使用该离体（ex vivo）模型可得出高度符合生理状态的结论，同时成本相对较低，所需时间投入与体外（in vitro）模型相当。
方案
所有试剂和设备均为无菌购买，或在操作前进行灭菌处理。本文描述了从预先摘除的眼球开始建立离体（ex vivo）模型的步骤。在我们的实验中，使用来自年轻（8–12周龄）白化兔的完整新鲜眼球（Pel-Freez Biologicals，Rogers，AR）。此外，我们还使用从当地眼库获得的人角膜。如果自行进行眼球摘除操作，请注意避免在操作过程中损伤角膜或角膜缘。兔眼球摘除的操作方案可参见其他文献2。
第1部分：角巩膜片的切除
- 用 PBS 润湿一条窄条纱布，包裹在眼球周围，以便在操作过程中固定眼球。
- 使用锋利的手术刀在距角膜缘约 0.5 cm 的巩膜处做一斜向切口。
- 使用锋利的剪刀扩大切口，并完整切除角巩膜瓣。
- 一旦分离出角巩膜瓣，用镊子夹住巩膜边缘，轻轻剥离虹膜。注意避免损伤内皮或对角膜施加过度应力。
第2部分：角膜类器官培养的建立
- 将离体角膜在添加了非必需氨基酸（1X）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素（200 U/ml）和链霉素（200 μg/ml）的最低必需培养基（MEM）中进行培养。如有必要，也可加入两性霉素等抗真菌剂。
- 在培养基中配制1%琼脂糖溶液，并保持在55 °C备用。
- 用含有青霉素（200 U/ml）和链霉素（200 μg/ml）的无菌PBS彻底冲洗角膜。
- 将角膜上皮面朝下放置于无菌斑点板的一个孔中。
- 向角膜的内皮凹面加入含琼脂糖的培养基，刚好填满即可。静置约1分钟，使琼脂糖凝固。
- 将带有支撑凝胶支架的角膜上皮面朝上转移至35 mm组织培养皿中，并加入培养基覆盖上皮表面。
- 角膜可按此方法培养超过一周，每48小时更换一次培养基。
第3部分：HSV-1感染及实验药物治疗
- 将含有适量病毒的1 ml培养基加入35 mm组织培养皿中。我们通常以每角膜1×104 PFU的KOS株HSV-1进行感染。病毒原液滴度通过在CV-1单层细胞上进行蚀斑测定确定。
- 将角膜与琼脂糖支架一起，上皮面朝下放入含病毒的培养基中。
- 将角膜置于组织培养孵箱中，间歇性轻轻摇动（每10–15分钟一次），感染1小时。
- 感染1小时后，吸除含病毒培养基，并用PBS冲洗2–3次，以去除残留的病毒颗粒。
- 将角膜放回原位，并加入新鲜培养基覆盖上皮表面。
- 根据实验性质，可在感染前或感染后开始实验处理。
- 每48小时更换一次培养基。
第4部分：样本采集
- 空斑分析用培养基。 充分混匀培养基，并立即用于空斑分析；若需在不同时间点收集样品，则可将培养基储存于 -80 °C 备用。
- 角膜上皮来源的 DNA、RNA、蛋白质或细胞
- 移除琼脂糖支架，并用 PBS 充分冲洗角膜。
- 从角膜上切除巩膜组织环，以确保仅收集角膜上皮材料。
- 使用手术刀将角膜上皮细胞刮入适当的缓冲液中，具体缓冲液根据待分离的物质类型而定。分离 DNA 和 RNA 时，我们分别使用 DNeasy 血液与组织试剂盒和 RNeasy Mini 试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）。收集蛋白裂解物时，我们使用 Laemmli 缓冲液。进行角膜上皮细胞流式细胞术分析时，我们先将角膜在少量胰蛋白酶中预孵育以松解细胞，然后用手术刀将细胞从组织上剥离至胰蛋白酶溶液中。由于刮取角膜上皮所获得的组织量并不一致，因此在样品分析时必须设置适当的对照。在 qRT-PCR 中，我们使用 18S rRNA 作为参考转录本；在 qPCR 中使用 GAPDH 作为参考基因；在 Western blot 中使用核仁素（nucleolin）作为上样对照。
- 用于免疫组织化学或免疫荧光的组织样品
- 移除琼脂糖支架，并用 PBS 充分冲洗角膜。
- 根据实验目的，按照视频所示方法将角膜制成石蜡包埋组织块或冷冻组织块。我们采用标准流程制备角膜组织切片。
代表性结果
研究组织培养细胞的大多数方法均可轻松适用于HSV-1感染的角膜 离体. 此处展示的是适用于研究HSV-1感染的几种最常用技术的代表性结果——qPCR（图1D），qRT-PCR（图 1B），蛋白质印迹（Western blot）图1F），噬斑测定（图1C）以及组织免疫荧光（图1E).
图1. HSV-1感染角膜的分析 离体.（A） 示意图展示 离体 急性角膜上皮HSV-1感染模型 （B-F） 采用本视频文章所述方法感染的角膜分析。摘除的兔角膜以1x104 KOS株HSV-1的PFU/角膜，在有（PAA）或无（Mock）磷ono乙酸（phosphonoacetic acid）存在下培养400 μg/ml一种已知的HSV复制抑制剂。 （B） 在指定时间点收集总RNA，使用针对HSV-1聚合酶的引物通过qRT-PCR检测病毒转录水平。以针对18S rRNA的引物作为参考。n=3。误差条表示±标准误。 (C) 在感染后48小时收集培养基，通过CV-1单层细胞的蚀斑实验评估感染性病毒颗粒的产生。 (D) 在感染后48小时收集总DNA，并使用针对HSV-1基因组的引物通过qPCR检测病毒基因组复制情况。以针对GAPDH的引物作为参考。n=3。误差条表示±标准误。 (E) 经模拟处理的角膜在感染后48小时被快速冷冻，切片后通过间接免疫荧光法检测感染上皮中病毒早期蛋白（ICP8）的存在。细胞核用Höchst 33258复染。 (F) 在感染后48小时收集蛋白裂解液，通过Western blot检测病毒蛋白（ICP0）的表达水平。使用BCA法测定以确保各样品上样量一致。hpi = 感染后小时数。
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讨论
在本视频文章中，我们介绍了一种在ex vivo模型中研究急性角膜上皮HSV-1感染的方法。ex vivo模型是介于in vitro与in vivo模型之间的一个有效过渡环节，因其能够对细胞培养结果进行符合生理条件的验证，从而减少所需开展的动物实验数量。此外，ex vivo模型为在完整的人类角膜中研究上皮性疱疹病毒感染提供了独特且不可替代的机会。使用该模型时，需考虑以下几点：
- 需要强调的是，本视频文章所述方法并非用于模拟疱疹性角膜炎，而是一种急性角膜上皮HSV-1感染的模型。疱疹性角膜炎是由多种混杂过程共同作用的结果，包括病毒感染、炎症反应以及宿主对病毒的免疫应答。抗原特异性的CD4+和CD8+ T细胞反应在疱疹性角膜炎的发病机制中起着重要作用，但本模型无法再现这一过程，因为离体角膜不会受到免疫系统细胞的浸润。因此，该模型不会形成典型的上皮树枝状溃疡，也缺乏疱疹性间质性角膜炎中常见的间质受累3。因此，在ex vivo模型...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
特拉华河谷狮子会眼科库对本工作的支持极为宝贵。抗ICP8的鼠源单克隆一抗由大卫·克尼佩博士（哈佛医学院）惠赠。我们还感谢斯蒂芬·詹宁斯博士（费城德雷塞尔大学医学院）和彼得·莱布森博士（威尔斯眼科研究所）提供的有益讨论和专业指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基（MEM） | 美迪特公司 | 10-010-CV | |
| 非必需氨基酸（100倍溶液） | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-谷氨酰胺 | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| 青霉素G钠盐 | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| 琼脂糖 | Invitrogen | 15510-027 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 实验室制备 | N/A | |
| 胰蛋白酶EDTA（1×） | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒 | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli缓冲液 | 实验室制备 | N/A | |
| 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 | |
| 幼年兔全眼 | Pel-Freez 生物制品公司 | 41211-2 | |
| 人角膜与完整眼球 | 本地供应商 | N/A | |
| 12孔瓷质点滴板 | Avogadro’实验室用品 | 1877 | |
| 35 mm 组织培养皿 | Falcon BD | 353001 | |
| 6孔细胞培养板 | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold 中号模具 | Tissue-Tek | 4566 |
参考文献
- Kaye, S., Choudhary, A. Herpes simplex keratitis. Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).
- Holmberg, B. J. Enucleation of exotic pets. Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. Corneal gene therapy. J. Control Release. 124, 107-133 (2007).
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44(2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
- Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
- Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).
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重印与许可
