本文描述了一种逐步定植方法，以进一步评估其对宿主肝脏代谢的影响。通过基于核磁共振（NMR）的代谢谱分析，无创监测微生物共代谢产物在尿液中的排泄情况，以评估定植过程；同时，通过对完整肝组织活检样本进行高分辨率魔角旋转（HR MAS）NMR代谢谱分析，评估肝脏代谢状态。
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摘要
摘要
众所周知，肠道细菌对宿主稳态具有重要贡献，可提供多种益处，例如免疫保护和维生素合成。它们还为宿主提供大量营养物质，使这一生态系统成为至关重要的代谢器官。随着越来越多证据表明肠道菌群与代谢综合征之间存在关联，阐明宿主与其肠道微生物群之间的代谢相互作用，已成为现代生物学面临的重要挑战之一。1-4
定植（也称为正常化过程）是指微生物在原本无菌的动物体内建立的过程。虽然这一过程在出生时自然发生，但也常用于成年无菌动物，以控制其肠道菌群生态系统，并进一步确定其对宿主代谢的影响。控制定植过程的常用方法是采用灌胃法，使用单一或混合的微生物。该方法会导致快速定植，但其缺点是极具应激性5。因此，有必要尽量减少应激反应，并获得较慢的定植过程，以便逐步观察细菌定植对宿主代谢的影响。
在本文中，我们描述了一种利用非破坏性代谢谱分析技术，在逐步定植过程中评估肝脏代谢变化的方法。我们建议通过基于1H核磁共振（NMR）的代谢谱分析，检测尿液中微生物共代谢产物的排泄情况，来监测肠道微生物的定植过程。该方法能够评估肠道微生物活性的稳定性，而不仅仅局限于通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）监测粪便细菌来评估肠道微生物生态系统是否稳定建立6。定植过程在常规开放环境中进行，通过使用被常规动物污染的脏垫料启动，这些常规动物将作为对照组。由于啮齿类动物具有食粪行为，因此可实现均匀的微生物定植，正如先前研究所描述的那样7。
利用1H高分辨率魔角旋转核磁共振波谱法，可直接从完整的肝活检组织中测定肝脏代谢谱。该半定量技术能够在不破坏细胞结构的前提下，快速评估甘油三酯、葡萄糖和糖原等主要代谢物，从而进一步估算定植过程与肝脏代谢之间复杂的相互作用7-10。该方法也可应用于任何组织活检样本11,12。
方案
1. 无菌动物的定植与样品采集
- 将无菌动物从隔离器中取出，并安置于常规饲养室中，笼具前方放置过滤装置，这些动物将作为对照组（图1）。
- 取对照组常规饲养笼中3日龄的垫料一半，与无菌动物的垫料混合。每次更换垫料时，须保留1/3的脏垫料，以维持一定的细菌水平（至少保留3天）。
- 将小鼠置于1.5 mL微量离心管上方，通过轻柔按摩腹部促进排尿，收集尿液。立即用液氮速冻，并在至少-40°C条件下保存，直至进行核磁共振（NMR）分析。使用5 mm NMR探头进行检测时，至少需要20 μL样本体积，但建议使用30 μL以提高代谢谱分析的质量。
- 动物安乐死时不应使用任何麻醉剂，以避免因麻醉化合物在肝脏中的代谢而干扰NMR共振信号（例如，可采用颈椎脱位法，并通过放血确认死亡）。
2. 肝脏活检样本采集建议
- 请勿使用含酒精的任何产品，以避免污染。仅用水或生理盐水清洗工具。
- 切勿穿刺胆囊。若发生胆汁泄漏，应立即用水或生理盐水冲洗组织。
- 如图2所示，从左叶采集肝活检样本（约15–50 mg）。为确保活检可重复性，应始终在左叶中心区域取样，避免周边较薄的组织区域。
- 立即用液氮速冻活检样本，并在进行核磁共振（NMR）分析前于-80°C保存。
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种在开放环境中进行逐步定植的方法，旨在通过完整活检组织的1H HR MAS NMR谱分析进一步研究肠道微生物群对肝脏代谢的影响。文献中已报道多种定植方法。对动物进行特定微生物群定植的最常用方法包括口服灌胃或使用被污染的饮用水19,20。粪便接种也可用于定植，如先前所述21。本文所介绍的定植方法源自Koopman JP等人于1986年描述的一种“标准化”无菌动物的方法22。在该研究中，作者将一只正常的常规饲养动物放入隔离器中与无菌动物共同饲养。然而，并非总能将动物持续饲养在隔离器内，特别是在定植过程中需要对动物进行操作时（若需采集样本则尤为困难）。因此，另一种选择是将原无菌动物与作为对照的常规饲养动物所污染的垫料一同饲养于常规开放环境中。该方法使得为实现定植而进行的动物操作最少化，从而相比口服灌胃显著降低了动物应激。此外，该方法可实现更接近自然过程的渐进式肠道定植，并使同笼饲养的动物获得均一的微生物定植，这一点已通过微生物DNA图谱的DGGE（变性梯度凝胶电泳）分析得到证实（参见Claus等人7的补充材.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
所有用作示例的核磁共振谱图均来自一项先前已发表的研究7，该研究由雀巢公司提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 特定试剂与仪器列表： | |||
| 2.5 mm 微量管 | New Era | NE-H5/2.5-V-Br | |
| 1.7 mm 毛细管 | Sigma-Aldrich | NORS175001 | |
| 毛细管适配器 | New Era | NE-325-5/1.7 | |
| 提取棒 | New Era | NE-341-5 | |
| HR-MAS 转子 BL4，配有 50 μL 球形聚四氟乙烯垫片套件 | Bruker Corporation | HZ07213 | |
| 50 μL 插件工具包 | Bruker Corporation | B2950 | |
| Advance III 600 MHz NMR | Bruker Corporation | ||
| 1H HR MAS NMR 固体探头 | Bruker Corporation | ||
| 氘代水 99.9% | Sigma-Aldrich | 530867-1L | |
| 3-(三甲基硅基)丙酸-d4 (TSP) | Sigma-Aldrich | 269913 |
参考文献
- Cani, P. D., Delzenne, N. M. Gut microflora as a target for energy and metabolic. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. ....
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