相关的光学和电子显微镜（CLEM），作为工具来可视化显微注射分子和他们的真核细胞的亚细胞目标

摘要

CLEM技术已被用于分析超微结构形态的细胞膜，细胞器，通过显微注射的分子和亚细胞结构的影响。这种方法结合了强大的技术，的显微/显微注射，共聚焦荧光显微镜，电子显微镜，允许毫米多纳米的分辨率。此技术是适合于各种各样的应用。

摘要

依赖于复杂的真核细胞中，高稳定，功能不同的膜结合隔间保持必要的生化极性适当的细胞功能。因此，了解的酶，蛋白质和细胞骨架，治理和维护这种生化分离是非常重要的。使用荧光标记的分子定位和/或扰乱细胞内的车厢已经取得了丰富的知识和先进的细胞调控的认识。荧光和共聚焦显微镜成像技术，如确定一个荧光标记的小分子相对简单的位置，但是分辨率非常小的结构受限情况说明^1。

另一方面，电子显微镜揭示了亚细胞形态的细节，以非常高的分辨率，但它的静态特性使得它难以衡量的高度动态的亲精度^2,3 cesses用。因此，光显微镜和电子显微镜对同一样品，被称为的相关光学和电子显微镜^{（CLEM）4,5}的组合，能提供超快荧光成像的双重优点，高分辨率的电子显微镜^6。这种强大的技术已经实施，以研究细胞生物学的许多方面的^5,7。公司自成立以来，这个过程增加了我们的辨别能力，在高分辨率下的亚细胞结构和形态。

在这里，我们提出了一种简化的方法进行快速显微注射，其次是CLEM（ 图1）。显微注射的CLEM程序可以使用，引入特定数量的小分子和/或蛋白直接进入真核细胞的细胞质中，研究了从毫米到纳米多分辨率（ 图2）。该技术是基于显微注射细胞生长的激光蚀刻玻璃网格底部的活细胞菜肴和成像，共聚焦荧光和电子显微镜的盖玻片贴。容易的格子图案，这是很容易转移，以及所关注的细胞，EPON用于固定样品的树脂切片前的电子显微镜分析（ 图3）的细胞的本地化（s）的权益。叠加的荧光灯和EM的图像允许用户确定的亚细胞定位，以及任何形态和/或超微结构的变化引起的显微注射分子的利益（ 图4）。此技术是适合从≤5 s到几个小时，取决于的显微注射样品的性质上的时间点。

方案

1。哺乳动物细胞培养

1. 正常大鼠肾（NRK），永生化宫颈癌（HeLa细胞），或其他适当的哺乳动物细胞系进行培养，在37℃下，5％CO _2，贴住细胞菜肴（ 见表1的任何试剂或光刻的玻璃屏栅盖玻片装置，在该协议中使用）在DMEM +10％FBS和1％青/链霉素。应采取预防措施，以维持一个无菌的环境中工作时，与培养的哺乳动物细胞。
2. 细胞的汇合根据您的实验时间线（0-5小时与 1-2天注射后）应调整至50％〜25％，分别为。

2。显微注射

1. 准备所需的蛋白质，DNA，或小分子中的缓冲液的选择，取决于其细胞培养的顺从，最终体积为〜50微升。惰性荧光染料，如得克萨斯州红色或级联蓝为了纪念显微注射细胞注射染料和荧光探针的选择应该有非重叠的激发和发射波长。您用于显微注射所需的利息的分子的浓度应根据经验来确定，和荧光示踪染料常用在0.5-1.0毫克/毫升。通常情况下，若丹明或另一种荧光团共价连接到您使用市售的试剂盒的兴趣的分子，但是，其它的方法可以根据所使用的检测灵敏度。有关详细信息，请参阅下面关键的考虑因素。
2. 通过0.22μm的离心过滤器，过滤器的注入剂（〜50微升）。离心过滤器是优选的超过真空和/或关联的死体积的注射器过滤。
3. 产生显微注射针，高硼硅玻璃吸液管被拉到燃烧的布朗 - 微普勒以下制造商的指引。另外，显微注射....

讨论

这里介绍的方法能够直接提供纯化的蛋白质，核酸，小分子真核细胞的细胞质中，通过荧光显微镜和电子显微镜的相关性，并能提供超高分辨率分析。使用这种方法是简单而强大的，可以在内部进行，与许多现有的核心设施和/或适当配备的电子显微镜实验室。该技术也适合于活细胞，允许用户监视的动态实时荧光标记的分子，从而可以使用的时间推移显微镜和相关的断层电子显微镜。

所有的实验阶段，应进行初步的实证试验，以确定最佳的融合度，显微注射效率和提供适当数量的注入剂，荧光基团的优化和注入/追踪染料（S），可用性和/或专业知识的电子MICRoscopy分析。定位的CLEM过程的所有步骤中注入的细胞是此协议的关键，因此，建议选择该标本将被记录在两个共焦的可能性增加，细胞生长在盖玻片的中心附近的一个字母数字网格和电子显微镜。为了帮助定位感兴趣的细胞，周围的细胞的相对位置应使用的地标，以帮助定位EM分析过程中的适当的试样。最后，截面厚度应根据所需的测量。 TEM〜70 nm厚的串行部分的建议，而建议EM断层扫描较厚的部分（250-300纳米）。

显微注射的CLEM技术.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
光刻盖玻片和活细胞板	MatTek	P35G-2-14-CGR​​D
德州红	Invitrogen公司	D3329
级联蓝	Invitrogen公司	D7132
罗丹明标记试剂盒	Thermo Scientific的	53002
0.22微米离心过滤单元	密理博	UFC30GV00
高硼硅玻璃吸管	萨特仪器	BF100-50-10
微管牵引机	萨特仪器	型号:P-97	在执行斜坡测试使用程序＃4
FemtoJet显微注射系统	Eppendorf公司	Injectman NI2
盖玻片切削液	MatTek	PDCF OS 30
Technai透射电子显微镜	FEI	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	徕卡	EM UC6