CLEM 技术已应用于分析经显微注射分子影响的膜、细胞器及亚细胞结构的超微形态。该方法结合了显微操作/显微注射、共聚焦荧光显微镜和电子显微镜等强大技术，可实现从毫米到多纳米级别的分辨率。该技术适用于多种不同的应用。
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摘要
摘要
真核细胞依赖于复杂、高度调控且功能各异的膜结合区室，这些区室维持了细胞正常功能所必需的生化极性。因此，理解酶、蛋白质和细胞骨架组分如何调控并维持这种生化分隔至关重要。利用荧光标记分子定位和/或干扰细胞内区室的研究已获得了大量知识，推动了人们对细胞调控机制的理解。荧光显微镜和共聚焦显微镜等成像技术使得确定荧光标记小分子的位置相对简便，然而对非常微小结构的分辨能力仍然有限1。
另一方面，电子显微镜能够以极高的分辨率揭示亚细胞结构的形态细节，但其静态特性使得精确测量高度动态的过程变得困难2,3。因此，将同一样品的光学显微镜与电子显微镜相结合的技术，即相关联的光镜与电镜技术（Correlative Light and Electron Microscopy, CLEM）4,5，兼具了快速荧光成像和电子显微镜高分辨率的双重优势6。这一强大技术已被应用于细胞生物学多个方面的研究5,7。自问世以来，该方法显著提升了我们在高分辨率下识别亚细胞结构与形态的能力。
本文介绍了一种简化的快速显微注射结合关联显微技术（CLEM）的操作方法（图1）。该显微注射CLEM流程可用于将特定数量的小分子和/或蛋白质直接导入真核细胞的细胞质中，并可在从毫米到多纳米分辨率的尺度上研究其效应（图2）。该技术基于在激光刻蚀的玻璃网格盖玻片上培养细胞，盖玻片固定于活细胞培养皿底部，随后对细胞进行显微注射，并利用共聚焦荧光显微镜和电子显微镜进行成像。网格图案有助于定位目标细胞，该网格可随目标细胞一起完整转移至用于样品固定的Epon树脂中，便于电镜分析前的包埋与切片（图3）。通过叠加荧光图像与电镜图像，使用者可确定目标分子在细胞内的亚细胞定位，以及其引起的任何形态学和/或超微结构变化（图4）。该技术适用于从≤5秒至数小时不等的时间点，具体取决于所注射样品的性质。
方案
1. 哺乳动物细胞培养
- 正常大鼠肾细胞（NRK）、永生化宫颈癌细胞（HeLa）或其他合适哺乳动物细胞系在以下条件下培养： 37°C，5% CO₂2，置于活细胞培养皿中经光刻蚀处理的网格盖玻片上（参见 表1 在 DMEM + 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素中进行本方案所用的任何试剂或仪器的处理。操作培养的哺乳动物细胞时，应采取预防措施以维持无菌环境。
- 根据您的实验时间线（0-5 小时） 与 注射后1-2天，细胞融合度应分别调整至约50%或约25%。
2. 显微注射
- 根据目标分子对细胞培养的兼容性，选择合适的缓冲液配制所需蛋白质、DNA 或小分子，最终体积约为 50 μl。加入惰性荧光染料（如德克萨斯红或瀑布蓝）以标记显微注射的细胞；注射用染料与荧光探针的选择应确保激发波长和发射波长不重叠。待注射分子所需浓度需通过实验确定，荧光示踪染料通常使用浓度为 0.5–1.0 mg/ml。通常使用商业试剂盒将罗丹明或其他荧光团共价连接至目标分子上，但也可根据检测灵敏度选择其他检测方法。更多信息请参见下文的“关键注意事项”。
- 将注射液（约 50 μl）通过 0.22 μm 离心滤器过滤。相比真空或注射器过滤，离心滤器更优，因其可避免死体积....
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讨论
本文介绍的方法可实现将纯化的蛋白质、核酸或小分子直接递送至真核细胞胞质，并通过荧光显微镜与电子显微镜的联合分析，实现超高分辨率的成像研究。该方法操作简便且结果可靠，可在具备常规核心设施和/或配备适当设备的电子显微镜实验室中自主完成。该技术同样适用于活细胞实验，允许用户实时监测荧光标记分子的动态行为，因此可与延时显微镜结合使用，并与断层电子显微镜进行关联分析。
在实验的各个阶段，均应进行初步的实证试验，以确定最佳的细胞融合度、显微注射效率和注射物适量递送、荧光染料及注射/示踪染料的优化，以及透射电镜分析所需的设备条件或专业技术的可及性。在整个CLEM流程的每一步中准确定位已注射的细胞对本方案至关重要，因此建议选择生长在盖玻片中心区域带有字母数字网格的细胞，以提高样品在共聚焦显微镜和电子显微镜下均能被成功记录的可能性。为便于定位目标细胞，在电子显微镜分析过程中应利用周围细胞的相对位置作为解剖标志，辅助识别特定样本。最后，切片厚度应根据所需的测量目的进行调整。进行透射电子显微镜（TEM）观察时，推荐使用约70 nm的连续超薄切片；而进行电子显微镜断层成像时，则推荐使用较厚的切片（约250.......
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致谢
我们感谢Alto实验室成员提供的有益讨论。我们还感谢德克萨斯大学西南医学中心分子与细胞影像中心的Chris Gilpin博士、Tom Januszewski和Laurie Mueller，感谢他们提供的专业技术支持与建议。我们还感谢Xionan Dong博士对本文手稿的审阅。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI083359（资助给N.M.A.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 光–带盖玻片的活细胞培养板 | MatTek 公司 | P35G-2-14-CGRD | |
| 德克萨斯红 | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| 罗丹明标记试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司 | 53002 | |
| 0.22 μm 离心过滤单元 | EMD Millipore | UFC30GV00 | |
| 硼硅酸盐玻璃移液管 | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 型微操作仪 | 完成梯度测试后使用程序#4 |
| FemtoJet 显微注射系统 | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| 盖玻片去除液 | MatTek 公司 | PDCF OS 30 | |
| Technai 透射电子显微镜 | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| 超微切片机 | Leica Microsystems | EM UC6 |
参考文献
- Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. Advances in microscopy techniques. Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).
- Giepmans, B. N. Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy. Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).
- Mayhew, T. M.,....
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重印与许可
