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锁定核酸流式细胞术-荧光原位杂交（LNA flow-FISH）：一种用于细菌小RNA检测的方法

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DOI：

10.3791/3655

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2012年1月10日

 , 
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

本文内容

摘要

本文描述了一种新型高通量方法，该方法利用锁核酸探针和流式细胞术-荧光原位杂交技术，实现对单个细菌细胞中小RNA和mRNA表达的检测及相对定量。

摘要

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于在细胞环境中检测和定位特定核酸序列的强大技术。为了提高通量，FISH 可与流式细胞术（flow cytometry）结合，形成流式FISH（flow-FISH），从而实现对数千个单个细胞中靶向核酸序列的检测。因此，与基于裂解液或群体样本的核酸检测方法相比，flow-FISH 具有明显优势，因为每个细胞都被视为独立的观测单位，从而允许进行更强大的统计分析和方差分析。这些特性促使 FISH 和 flow-FISH 方法被广泛应用于多种不同领域，其有效性已在端粒长度测定1,2、细胞鉴定与基因表达分析3,4、感染细胞中病毒增殖的监测5以及细菌群落分析与计数6中得到成功验证。

传统上，FISH 和 flow-FISH 方法的特异性依赖于 DNA 寡核苷酸探针。然而近年来，使用核酸类似物替代 DNA 寡核苷酸探针作为 FISH 和 flow-FISH 探针，显著提高了两种技术的灵敏度和特异性，这主要归因于这些类似物与天然核酸结合时具有更高的熔解温度（Tm）7,8。锁核酸（Locked nucleic acid, LNA）探针是一类含有 LNA 核苷酸的核酸类似物，这些核苷酸被穿插在 DNA 或 RNA 序列中9,10。已有研究表明，LNA 探针与 flow-FISH 联用时优于传统的 DNA 探针7,11，并已成功用于检测真核生物的 mRNA12 以及哺乳动物细胞中的病毒 RNA5。

本文进一步拓展了这一能力，描述了一种LNA流动-荧光原位杂交（flow-FISH）方法，可实现对细菌细胞中RNA的特异性检测（图1）。具体而言，我们关注的是小非编码调控RNA（sRNA）的检测，近年来sRNA引起了广泛关注，因其已被发现作为关键调控元件参与多种重要的细胞过程13。然而，目前可用于研究sRNA的工具仍十分有限，而在细菌细胞中检测sRNA所面临的挑战，部分原因在于sRNA分子本身尺寸较小（通常为50–300个核苷酸长度）、丰度较低，以及在操作具有不同细胞膜结构的微小生物细胞时普遍存在技术困难。在本方法中，我们描述了能够保持细菌细胞结构完整的固定与通透化条件，使LNA探针得以有效穿透细胞，并结合信号放大步骤，从而实现对低丰度sRNA的特异性检测（图2）。

方案

1. LNA 探针与实验设计

  1. 设计与您转录的 sRNA/mRNA 序列互补的 LNA 探针，或在 www.exiqon.com 定制设计。若选择定制设计服务，您将获知探针序列，但无法得知 LNA 的掺入模式。每个 LNA 残基加入 DNA 或 RNA 寡核苷酸后，LNA-RNA 杂交双链的 Tm 将升高 2 至 10 °C14。理想情况下，设计的 LNA 探针长度应为 20–25 个核苷酸（过长的探针合成难度较大），且其 RNA 杂交的 Tm 应在 85–90 °C 之间。
  2. 完成序列设计后，使用 BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 或将探针序列比对至本地数据库，以确保该探针仅特异性结合目标 sRNA/mRNA。
  3. 订购 LNA 探针时，应在 LNA 寡核苷酸的 5' 端添加生物素-TEG 修饰。该生物素化修饰是杂交后使用链霉亲和素-染料偶联物进行染色所必需的。必要时也可将该修饰加至 3' 端，但 5' 端修饰成本更低，且通常产率更高。
  4. 实验中应包含三个阴性对照：(i) “无 LNA”对照，即在杂交步骤中不加入 LNA 探针；(ii) “无染料”对照，即加入 LNA 探针与目标 sRNA 杂交，但因未添加荧光染料而无法检测杂交信号；(iii) “非表达 sRNA/mRNA”对照，使用靶向不存在或不表达的 sRNA 的 LNA 探针，以监测非特异性杂交情况。
  5. 本实验中所用的特异性 LNA 探针与 sRNA CsrB 互补，其序列为 5'-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3'（大写字母表示 LNA 单体）。
  6. 收到冻干 LNA 探针后，用无核酸酶水重悬至 50 μg/mL，分装为 10–20 μL 体积，于 -20 °C 保存。

溶液

  • 8% 多聚甲醛（PFA）、10% 乙酸 PBS 溶液：取 1 mL 32% PFA、400 μL 乙酸、400 μL 10X PBS（pH = 7.4）和 2.2 mL 无核酸酶水混合。若需分装冷冻保存，应不加乙酸，将溶液分装成单次使用量后于 -20°C 冷冻保存。
  • 60% 硫酸葡聚糖溶液：将 6.0 g 硫酸葡聚糖加入 50 mL 圆底离心管中，加水至终体积 10 mL。将该混合物置于 65 °C 水浴中加热，直至硫酸葡聚糖完全溶解（可能需要 1–2 小时）。在溶解过程中可能需要补充少量水，以维持 10 mL 总体积。将 60% 硫酸葡聚糖溶液分装后于 -20 °C 保存，直至使用。

2. 固定

  1. 收集 1×108 个发光的 Vibrio campbellii 或目标细菌细胞，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。此细胞量足以用于制备四个流式 FISH 样本（一个特异性 LNA 探针样本和三个阴性对照）。若需检测其他 sRNA/mRNA 种类，应额外收集若干份 1.5 mL 微量离心管的细胞样本。
  2. 在 2300 × g 条件下离心 5 分钟，使细菌细胞沉淀。用移液器吸弃上清液，并将细胞重悬于 400 μL 1× PBS 中。
  3. 向该混合物中加入 400 μL 含 8% 多聚甲醛（pfa）和 10% 乙酸的 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS）溶液，充分混匀后于 25 °C 孵育 10 分钟，期间在 5 分钟时混匀一次。除非另有说明，所有孵育步骤均在加热的离心管架中进行。多聚甲醛溶液应在使用前新鲜配制，或使用加入乙酸后冷冻保存的分装液。多聚甲醛是一种交联固定剂，有助于保持细胞形态并保留细胞内 RNA。
  4. 在 4500 × g 条件下离心 2 分钟，使细胞沉淀，并用移液器吸弃上清液。后续所有需要离心的步骤均应使用相同条件（7K，2 分钟）。需特别注意：离心后应使用移液器吸除上清液，而非倾倒。
  5. 用 400 μL 1× PBS 洗涤细胞两次，并将最终的细胞沉淀重悬于 400 μL 1× PBS 中。此时细胞已固定，可在 400 μL 1× PBS 中于 4 °C 保存最多七天。

3. 焦碳酸二乙酯处理

  1. 配制 400 μL 的 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）1×PBS 溶液（每份待测样品需使用 400 μL 该溶液，因此请根据样品数量相应调整配制量）。DEPC 溶液应使用 DEPC 原液新鲜配制。DEPC 处理可通过羰基乙氧基化作用使 RNase 失活，从而降低背景信号。
  2. 向每份固定的细菌细胞样品中加入 400 μL 的 0.1% DEPC 溶液，并用移液器充分混匀。在 25°C 下孵育 12 分钟。用 400 μL 1×PBS 洗涤细胞两次，以 7K 离心 2 分钟收集细胞沉淀，并弃去上清液。

4. 透化

  1. 将1.0 mg溶菌酶加入1 mL Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）中，配制成1.0 mg/mL的溶液。该溶液应新鲜配制。向细胞中加入800 μL 1 mg/mL的溶菌酶溶液，用移液器充分混匀，并在25 °C孵育30分钟，期间偶尔混匀。离心收集细胞（7K，2分钟），弃去上清液。溶菌酶通过水解细菌细胞壁中存在的肽聚糖发挥通透化试剂的作用。
  2. 在TE缓冲液中配制3.0 μg/mL的蛋白酶K溶液。该溶液应使用储存于-20 °C的20 mg/mL蛋白酶K储备液新鲜配制。蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，可降解多种蛋白质，有助于探针和试剂对RNA的可及性。
  3. 向细胞沉淀中加入800 μL 3.0 μg/mL的蛋白酶K溶液，用移液器充分混匀。在25 °C孵育15分钟，孵育过程中中途涡旋振荡一次。
  4. 离心收集细胞（7K，2分钟），弃去上清液，并用400 μL 1X PBS洗涤细胞一次。弃去洗涤后的上清液后，将细胞重悬于400 μL 1X PBS中，并将100 μL重悬液分别加入四个新的1.5 mL微量离心管中。离心收集细胞（7K，2分钟），弃去上清液。

5. 杂交

  1. 为每个样品准备 100 μL 杂交缓冲液（HB）。HB 由 50% 体积的甲酰胺、10% 质量的硫酸葡聚糖（每 100 μL 加入 16.7 μL 的 60% 硫酸葡聚糖溶液）、1X 丹哈特溶液、50 mM 磷酸钠（pH 7.0）、2X 柠檬酸钠（SSC）、20 μg 剪切的鲑鱼精子 DNA（SSSD）和 20 μg 酵母 tRNA 组成。
  2. HB 的每种组分具有不同的作用。甲酰胺可降低核酸双链的熔解温度，从而有助于 RNA 变性并最小化细胞损伤。硫酸葡聚糖作为排阻体积的聚合物，用于浓缩探针并提高杂交速率。丹哈特溶液、酵母 tRNA 和 SSSD 作为封闭剂，以减少非特异性结合。
  3. 在每个含有细胞重悬液的 1.5 mL 微离心管中，加入 95 μL HB 和 5.0 μL sRNA/mRNA 特异性 LNA 探针（最终浓度为 20 pmol 的特异性 LNA）或水（用于无 LNA 的阴性对照）。例如：
    1. 管 1 - 95 μL HB + 5.0 μL sRNA/mRNA 特异性探针
    2. 管 2 - 95 μL HB + 5.0 μL sRNA/mRNA 特异性探针（“无染料”阴性对照）
    3. 管 3 - 95 μL HB + 5.0 μL sRNA/mRNA 探针（“非表达 sRNA/mRNA”阴性对照）
    4. 管 4 - 95 μL HB + 5.0 μL 水（“无 LNA”阴性对照）
  1. 将所有四个样品在 60 °C 下孵育 60 分钟。杂交温度取决于 LNA 探针的 Tm，应设置为比预测的 Tm 低约 30 °C，以利于 RNA 退火。较高的杂交温度和杂交缓冲液（HB）中的甲酰胺可确保目标 sRNA 或 mRNA 的二级结构发生变性。

6. 杂交后洗涤

  1. 杂交后，向杂交混合物中加入 1.0 mL 0.1X SSC 缓冲液（含 0.1% tween-20，简称 SSCT）。此步骤可使细胞从黏稠的杂交溶液中释放。离心收集细胞（7K，2 分钟），弃去上清液。
  2. 向细胞沉淀中加入 200 μL 含 50% 甲酰胺、2X SSC 和 0.1% tween-20 的溶液，充分混匀，并在加热块中 65 °C 孵育 30 分钟。
  3. 向混合物中加入 1 mL 0.1X SSCT，离心收集细胞（7K，2 分钟），弃去上清液。
  4. 加入 500 μL 0.1X SSCT 重悬细胞，在加热块中 65 °C 孵育 40 分钟。离心收集细胞（7K，2 分钟），弃去上清液。

7. 封闭与染色

  1. 配制封闭缓冲液（BB）和链霉亲和素-染料染色溶液。从5X储存液（商业化产品，参见试剂部分）制备1X BB溶液。每四支试管一组，准备1.2 mL的1X BB溶液。
  2. 向细胞沉淀中加入200 μL 1X BB，重悬细胞，并在25°C下孵育30分钟。
  3. 使用链霉亲和素偶联的染料来检测生物素化的LNA探针。在封闭的同时，用1X BB配制浓度为2 μg/mL的DyLight 488链霉亲和素或其他所需染料-链霉亲和素偶联物溶液，孵育30分钟（三个样品需配制300 μL）。
  4. 与1X BB孵育后，以7K离心2分钟收集细胞沉淀，并弃去上清液。向细胞沉淀中加入50 μL链霉亲和素-染料溶液，充分混匀，并在25°C下持续振荡（使用涡旋振荡器或温控混合仪）孵育12分钟。对于“无染料”对照组，仅加入50 μL 1X封闭缓冲液。在后续操作中，使用铝箔包裹管子以避光。
  5. 用500 μL 0.1X SSCT缓冲液洗涤细胞一次，再用400 μL含0.1% Tween-20的1X PBS（PBST）洗涤一次。以7K离心2分钟收集细胞，弃去上清液。
  6. 在初始链霉亲和素偶联物染色后，通过引入生物素化的抗链霉亲和素抗体结合至链霉亲和素-染料偶联物，然后再次使用链霉亲和素-染料进行染色，从而放大信号输出，提高每个杂交LNA探针的检测信号（图2）。
  7. 向细胞中加入100 μL含1 μg/mL生物素化抗链霉亲和素抗体的1X PBS溶液，重悬细胞，并在25°C下孵育30分钟，期间偶尔混匀。以7K离心2分钟收集细胞，弃去上清液，并用400 μL 1X PBST洗涤两次。
  8. 向细胞中加入50 μL浓度为2 μg/mL的链霉亲和素-染料溶液，充分混匀，并在25°C下持续振荡（使用涡旋振荡器或温控混合仪）孵育12分钟。对于“无染料”对照组，仅加入50 μL 1X封闭缓冲液。
  9. 用500 μL 0.1X SSCT缓冲液洗涤细胞一次，再用400 μL 1X PBST洗涤一次。
  10. 将细胞重悬于200 μL 1X PBST中，4°C保存直至进行流式细胞术分析。对于较小的细菌细胞，应将流速设为慢速以减小液流核心尺寸。此外，对于具有前向散射阈值截断功能的流式细胞仪，必须将阈值设为尽可能低，以确保检测到小型细菌细胞。
  11. 检测DyLight 488时，流式细胞仪应配备488 nm激光器及FITC的标准发射滤光片。至少应采集2×104个事件。为适配配备不同激光器的流式细胞仪，本方案也可使用其他链霉亲和素偶联的荧光染料。

8. 代表性结果

有效固定和透化的细胞示例如 图3A 中的流式细胞术散点图所示。当采用上述透化条件时，细胞群体较小且均一，表明细胞聚集体较少。当使用较高浓度（5 mg/mL）的溶菌酶时，细胞更容易发生聚集，并表现出增高的前向散射值，提示存在较大的颗粒（图3B）。一次成功的LNA流式FISH实验的流式细胞术数据示例如 图4 所示。该直方图展示了目标小RNA的特异性检测结果以及三个阴性对照。其中，“无染料”阴性对照产生的荧光信号最低，其次为“无LNA”和“非表达sRNA”阴性对照。最后，使用sRNA特异性LNA探针的样品产生最强的荧光信号。一旦通过此方式验证了实验方法和LNA探针的有效性，便可进一步设计实验，用于监测sRNA信号随时间的变化，或在基因突变、不同培养条件等处理下的响应情况等。

细菌流式细胞术示意图；展示了固定、杂交、染色过程。
图 1。 LNA 流式 FISH 实验检测细菌 sRNA 的整体流程示意图。

使用生物素化LNA探针的核酸检测方法；示意图显示了依次结合的步骤。
图 2。 LNA流动FISH信号的染色与扩增。a）生物素化LNA探针的杂交。b）使用荧光DyLight 488链霉亲和素偶联物进行染色。c）生物素化抗链霉亲和素抗体与DyLight 488链霉亲和素结合。该抗体可通过其抗原结合位点与链霉亲和素结合，或通过其生物素残基被链霉亲和素结合。d）通过进一步使用荧光DyLight 488链霉亲和素偶联物染色实现信号扩增。

流式细胞术点图显示侧向散射与前向散射数据分析及细胞群门控。
图 3。 流式细胞术点图显示 a) 1 mg/mL 溶菌酶、3 μg/mL 蛋白酶 K 透化处理和 b) 5 mg/mL 溶菌酶、3 μg/mL 蛋白酶 K 透化处理的前向散射与侧向散射结果。

使用流式细胞术检测DyLight 488荧光强度的直方图，显示事件计数与荧光强度的关系。
图4。 LNA流动-FISH结果的直方图分析。每种样品产生的荧光信号由四条曲线表示：黑色——sRNA特异性LNA探针；红色——“非表达sRNA”阴性对照；蓝色——“无LNA”阴性对照；紫色——“无染料”阴性对照。

讨论

本文所介绍的LNA流动FISH方法用于检测一种来自革兰氏阴性海洋细菌Vibrio campbellii的小RNA（sRNA）表达，该sRNA的表达此前已通过基于微阵列的表达谱分析和反转录聚合酶链式反应确认16。迄今为止，我们已利用该方法监测了多种RNA的表达（例如反式编码sRNA、调控蛋白质活性的sRNA、核糖开关以及mRNA）。因此，我们确信该方法具有良好的适应性，可用于检测任何sRNA或mRNA靶标，并可针对任何细菌种类或细胞类型进行相应修改。若需将本方案应用于其他类型的细胞，最关键的可调节变量是通透化步骤。例如，在调整本文所述的通透化条件时，应测试溶菌酶和蛋白酶K浓度的变化。我们发现，将溶菌酶和蛋白酶K的用量加倍或增至三倍，会显著影响LNA流动FISH的结果。此外，在测试其他通透化条件时，应评估细胞是否发生聚集、细胞损失情况，以及可获得的最佳信噪比荧光信号。细胞聚集程度可通过显微镜观察和/或流式细胞术进行检测。在流式细胞术中，细胞聚集体在前向散射与侧向散射点图中表现为拖尾现象，而合适的通透化方法应尽可能减少这种拖尾效应。本方法也适用于多重sRNA检测，无需对所述方案进行重大修改，只需在杂交步骤中加入用其他半抗原（如地高辛）标记的额外LNA探针，随后使用抗地高辛抗体及荧光素偶联的二抗进行检测即可。目前，我们在此方法中遇到的唯一局限是其难以从低丰度表达的sRNA分子中产生足够强的信号，相关研究正在进行中，以确定该方法的检测阈值（即每个细胞内的绝对拷贝数）。

总体而言，LNA 流式 FISH 方法能够在高通量条件下在单细胞水平上检测细菌 sRNA 或 mRNA 的表达，从而揭示特定 sRNA 的存在情况、相对丰度及其在群体中表达水平的变异程度。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国海军研究实验室核心资金通过美国海军研究办公室资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10X 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4Applied BiosystemsAM9625
无核酸酶水Applied BiosystemsAM9932（非 DEPC 处理）
32% 多聚甲醛Electron Microscopy SciencesRT 15714无乙醇
乙酸Acros Organics327290010
焦碳酸二乙酯 (DEPC)Sigma-AldrichD5758保持干燥
溶菌酶Sigma-AldrichL2879
蛋白酶 K (20 mg/mL)Applied BiosystemsAM2546
甲酰胺Applied BiosystemsAM9342去离子，分装后冷冻
硫酸葡聚糖，分子量 > 500,000Sigma-AldrichD8906将 60% 溶液分装并冷冻
Denhardt’s 溶液 50X 浓缩液Sigma-AldrichD2532分装并冷冻
柠檬酸钠缓冲液 20XApplied BiosystemsAM9770
鲑鱼精 DNA（剪切）10 mg/mLApplied BiosystemsAM9680分装并冷冻
酵母 tRNA (10 mg/mL)Life Technologies15401-011分装并冷冻
Tween-20Sigma-AldrichP9416
5X in situ 杂交封闭液Vector LaboratoriesMB-1220
DyLight 488 标记链霉亲和素Vector LaboratoriesSA-5488-1
生物素化抗链霉亲和素Vector LaboratoriesBA-0500分装并冷冻

参考文献

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