本方案介绍了如何使用Tali图像型细胞仪进行细胞活力和荧光表达检测。
本文内容
摘要
摘要
单细胞和群体信息通常通过流式细胞术或荧光显微镜获得。然而，这两种方法提供的信息不同。流式细胞术可提供有关物理特性以及染色或表达情况的定量多参数信息，但无法实现可视化观察；而独立的荧光显微镜可提供可视化数据，却难以进行直接的定量测量1。
基于图像的细胞计数技术弥合了这两种方法之间的差距，能够快速可视化并同时对异质细胞群体中的数千个细胞进行定量分析2。本文介绍了一种利用Tali基于图像的细胞计数仪进行细胞活力和绿色荧光蛋白（GFP）表达检测的方法3。Tali仪器是一种三通道（明场、绿色荧光、红色荧光）台式检测平台，相较于流式细胞术和荧光显微镜具有多项优势。Tali细胞计数仪成本更低，占用实验台空间更小，维护需求更少，且工作流程已简化，使得操作和分析更加简便快捷。Tali细胞计数仪可执行多种悬浮细胞检测，包括GFP和红色荧光蛋白（RFP）表达检测、凋亡4-6以及使用碘化丙啶（PI）进行的细胞活力分析7-11。
本文演示了使用 Tali 仪器对表达 GFP 的细胞进行细胞活力检测的方法。将经 GFP 转导的细胞利用 Tali 活性检测试剂盒（死细胞红色染料）进行染色，随后通过移液将细胞加入 Tali 细胞分析载玻片，并将其装载至细胞仪中。仪器采集明场、红色荧光和绿色荧光图像，并利用特定检测算法进行分析。随后生成直方图，以显示细胞大小、碘化丙啶（PI）荧光强度以及 GFP 荧光强度。通过对这些参数设定阈值，可进一步聚焦于特定的细胞群体。
Tali图像型细胞计数仪与传统流式细胞术的并行比较表明，这两种方法在细胞活力和蛋白质表达方面提供的数据具有可比性。然而，Tali仪器能够提供有关细胞群体的额外可视化信息，而这些信息是使用流式细胞仪无法获得的。
方案
1. 使用 Tali 细胞活力检测试剂盒 - 死细胞红色染料对细胞进行染色
- 使用 CellLight Nucleus-GFP *BacMam 2.0* 转导的 U2OS 细胞（美国模式培养物集存库）开始本实验。（注意：也可将细胞离心后重悬于培养基或 PBS 中）。
- 为用 PI 染色死细胞，取 100 μL 细胞悬液转移至新的微量离心管中。建议本检测中细胞浓度为 1 × 105 至 1 × 107 个细胞/mL，但浓度无需精确。
- 接着，加入 1 μL 基于 PI 的 Tali 死细胞红色试剂以染色死细胞。短暂涡旋混匀。将 Tali 死细胞红色试剂与细胞混合物在室温避光孵育 1–5 分钟。
- 孵育结束后，立即进行 Tali 基于图像的细胞仪对样品的分析。
2. 使用基于图像的 Tali 细胞仪进行细胞活力检测
- Tali 细胞仪使用一次性塑料 Tali 细胞分析载片，该载片专为细胞仪设计，可牢固插入仪器中，并在两个独立的封闭腔室（A 和 B）中各容纳 25 μL 样本。操作载片时，务必始终从两侧持握。
- 加载样本时，用移液器缓慢将 25 μL 样本加入半月形的样本加载区，注意避免产生气泡或回溅。切勿过量或不足量填充。
- 此处，对照细胞（未染色、非转导）加载于腔室 A，而染色的 GFP 表达细胞则加载于腔室 B。对照样本有助于在数据分析时确定自发荧光水平。
- 进行活率检测时，点击细胞仪主屏幕上的 GFP/RFP。检测选项将显示在右侧，选择 GFP + Viability。
- 接下来，点击 Name Now 以命名样本系列。然后通过触摸屏输入样本系列名称，并点击 Save。（注意：Select Name Later 可按日期和时间自动为每个样本系列分配名称。）
- 命名样本后，Tali 细胞仪将自动进入 Measure 屏幕。点击 Measure 屏幕右下侧的 Background 标签。
- 接下来，将对照样本（A）朝向远离细胞仪的方向，将载片插入加载口直至无法再推进。切勿用力过猛。
- 在背景屏幕上，点击 Press to Insert New Unstained Cell Control。载片将自动被拉入细胞仪，屏幕上将实时显示细胞图像。
- 使用调焦旋钮，将细胞调整至合适的焦平面。细胞应呈现均匀暗色，每个细胞周围有明亮的光晕（图 1，左）。
- 当背景与细胞边缘之间的过渡模糊，导致细胞边界不清晰时，可能导致细胞计数偏低（图 1，中）。当细胞中心明亮而边缘暗淡时，可能导致细胞计数偏高（图 1，右）。
- 为在调焦过程中更清晰地观察细胞群体，可滑动红色的 Zoom 指示按钮至 4X 或 16X。
- 当细胞已调至清晰对焦后，点击 Press to Run Unstained Cell Control 以测量背景荧光。
- 细胞仪将自动捕获并分析样本图像。在默认（9 幅图像）模式下，图像捕获与分析约需 1 分钟。
- 每幅视野的缩略图将在捕获过程中依次显示，进度条提供实时更新。图像捕获完成后，细胞仪将自动弹出载片，并显示基于所捕获图像的分析数据。
- 存储的数据将显示在细胞仪 Background 标签的下拉菜单中。背景对照样本将被赋予与实验相同的名称，并导入下拉菜单中。注意：若未运行背景对照，细胞仪将自动设定荧光阈值。该阈值可在检测完成后手动调整。
- 运行经 PI 染色的转导样本时，从细胞仪中取出载片，将其翻转，并重新插入，使转导样本朝向远离仪器的方向。
- 点击 Sample 标签，然后点击 Press to Insert New Sample。当屏幕显示图像后，使用图像调节旋钮如前所述将细胞调至对焦清晰，然后点击 Press to Run Sample。
- 图像捕获完成后，分析数据将显示在 Sample 标签下，细胞仪将自动弹出载片。
- 将 Tali 细胞分析载片作为生物危害废弃物妥善处理。Tali 细胞分析载片不可重复使用。
3. 设置阈值与门控
- 样品运行完成后，现在可对样品设置阈值，以聚焦特定的细胞群体。此处，我们将调整阈值以确定GFP转导细胞中活细胞与死细胞的百分比。
- 在样品选项卡下，将显示表达GFP的细胞数量与百分比、表达GFP的活细胞与死细胞、总存活率、平均细胞大小、计数的细胞总数以及细胞浓度。
- 此外，屏幕底部还会显示细胞大小、绿色荧光和红色荧光（PI）的直方图。
- 要设置细胞大小门控，轻触细胞大小缩略图以打开细胞大小直方图。尽管培养的细胞中极少含有碎片，但其他样品可能含有比细胞更大或更小的碎片。
- 为排除这些碎片，滑动滑动条上的蓝色按钮，以排除过大和过小的事件。然后，轻触应用以重新分析数据并更新结果。
- 接下来，为将GFP荧光加入分析，轻触GFP直方图缩略图以打开该直方图。滑动蓝色条，将阈值设置在最弱峰右侧附近，并以对照样品作为参考。
- 这使得分析可包含GFP阳性细胞，同时排除自发荧光细胞。当细胞内的生物分子被激发时，常可观察到自发荧光现象。
- 轻触应用以确认并返回上一屏幕。此时样品选项卡下显示的数据应已反映为两个荧光通道所设定的门控与阈值。
- 接下来，为将PI染色的细胞与自发荧光区分开，按下PI直方图缩略图以打开PI直方图。
- 对照样品的峰将以灰色峰的形式显示在直方图上。红色峰为样品的荧光信号。背景荧光在此流式细胞仪中显示为最接近0 RFU值的峰。
- 为消除PI通道中的背景荧光，移动滑动条上的蓝色按钮，调整阈值以排除代表背景荧光的峰，并以对照样品的灰色峰作为参考。轻触应用以确认并返回上一屏幕。
- 接下来，为直观确认每个细胞是否被正确分配，通过按下缩放选项卡中的图像缩略图，再按下图层选项卡，选择一个已捕获的视野进行查看。
- 接着，按下GFP或PI按钮，以显示通过该特定通道捕获的图像。再次按下同一按钮可从显示中移除该图层；或通过按下多图层按钮，实现图层叠加。
- 为识别细胞如何通过特定通道被计数，轻触圆圈。仅通过明场通道计数且不表达荧光的细胞将以蓝色圆圈标出。这表明该细胞为活细胞（即PI阴性）。
- 表达GFP的细胞将在GFP通道中可见，并以绿色圆圈标出。经Dead Cell Red染色的死细胞将在PI通道中可见，并以红色圆圈标出。
- 在红色和绿色通道中均被计数的细胞将以黄色圆圈标出，这表明该细胞表达GFP，但也被PI染色，因此为死细胞。
- 偶尔，屏幕上会出现黑色圆圈，这些是已被识别但因细胞大小不符合条件而被排除在分析之外的物体。
- 继续使用上述步骤微调荧光直方图中的阈值，直至每个表达荧光的细胞均被相应颜色的圆圈正确标记。
- 所有分析参数将自动保存在数据选项卡下。Tali流式细胞仪可存储约500次样品运行的数据文件。
- 数据选项卡中存储的每个文件均可用于重新分析。通过从数据选项卡中选择文件，即可打开该文件，所有直方图和图层将恢复为可操作状态。
- 为归档数据和生成报告，可使用U盘将细胞仪中存储的数据传输至计算机。
4. 典型结果：
采用Tali图像细胞仪检测经核定位GFP BacMam 2.0表达载体转导的细胞中荧光蛋白的表达水平。实验中对四种代表性细胞类型进行了转导（U2OS、293MSR、HEKn和CHO-S）。对于这些细胞系，Tali细胞仪报告了表达GFP的细胞数量，并与同一标本在流式细胞仪上获得的数据进行比较。此外，使用Tali活力检测试剂盒中的Dead Cell Red试剂对细胞进行染色，以在Tali细胞仪和流式细胞仪上识别死细胞群体。
图2中的图形表示展示了每种细胞类型中表达GFP的细胞占总细胞群体的百分比。这些数据表明，Tali细胞计数仪产生的结果与流式细胞仪生成的数据具有可比性。
图1. 分析前细胞应正确对焦。 使用适合分析的Tali细胞分析载片，细胞浓度适宜（推荐细胞数量为1 × 105 至 1 × 107 个细胞）。（左） 对焦准确的细胞在整个细胞区域内呈均匀深色，每个细胞周围有明亮的光晕。（中） 当背景与细胞边缘之间的过渡模糊、细胞边界不清晰时，可能导致细胞计数偏低。（右） 当细胞中心过亮而边缘过暗时，可能导致细胞计数偏高。
图 2. Tali 基于图像的细胞仪获得的荧光蛋白表达数据与流式细胞术结果相当。 对4种不同细胞系中活细胞的GFP表达量计算结果进行并列比较。
讨论
我们刚刚详细介绍了一种使用基于图像的Tali细胞计数仪进行活力计数和评估GFP表达的操作流程。采用相同的操作流程，该细胞计数仪还可用于执行多种其他检测，包括：细胞凋亡、RFP分析以及使用未转导细胞进行的细胞活力分析。
细胞活力、基因表达和细胞凋亡的荧光测定法已成为生物医学研究中的关键技术方法7-12。过去，研究人员需使用不同的仪器分别获取细胞的定量数据和可视化信息。虽然通过流式细胞术可以获得异质细胞群体中细胞的定量信息1-4，但视觉或定性信息则主要依赖荧光显微镜获取。本文介绍一种连接群体细胞与单细胞研究之间差距的技术。利用基于图像的 Tali 细胞分析仪，可同时获取单个细胞或细胞群体的定量数据和可视化细胞图像数据。Tali 仪器可用于多种应用，包括基因表达评估、细胞凋亡检测、药物疗效研究以及疾病进展评估。
Tali 图像细胞仪可捕获并分析明场、红色荧光和绿色荧光图像，从而获取有关细胞亚群的信息。例如，在本实验中，我们利用死细胞红色染料（Dead Cell Red dye）在表达 GFP 的细胞群体中区分出死细胞与活细胞。这提高了对表达 GFP 的活细胞定量的准确性，并可识别出可用于后续实验操作的细胞群体。需要注意的是，细胞群体中的死细胞可能来源于多种因素，包括培养过程中的正常细胞死亡，或由环境条件引起的细胞死亡（例如胰蛋白酶消化处理，或转染/转导方法所诱导的细胞死亡）。
在此，我们展示了使用 Tali 细胞仪对 U2OS 细胞进行检测的方法。类似的方法也可用于大多数哺乳动物和昆虫细胞。对于每种细胞系，Tali 细胞仪均可获得定量的 GFP 表达数据，而使用标准荧光显微镜对细胞进行目视观察则无法实现这一结果。尽管这些结果与流式细胞术相当，但数据采集所需时间仅为后者的一小部分。该细胞仪能够准确计数直径在 5 μm 至 60 μm 之间的细胞，理想浓度范围为 1 × 105 至 1 × 107 个细胞/mL。
需要指出的是，大多数标准染色方案（包括此处所述的死细胞红色染色方案）均使用碘化丙啶（propidium iodide）来区分活细胞与死细胞。然而，在对经透化处理以标记细胞内标志物的细胞进行活力评估时，这种方法会带来挑战，因为碘化丙啶可对任何细胞膜受损的细胞进行染色。由于Tali基于图像的细胞仪能够检测绿色或红色荧光通道的任何荧光染料或蛋白，未来的研究可探索使用其他替代性染料，例如胺反应性活力染料4。Perfetto et al.12 在2006年的一项研究中发现，这类染料在区分活细胞与死细胞群体时操作简便且结果可重复。
请注意，Tali 在可执行的检测类型方面存在一定的局限性。例如，由于仪器使用的物镜为 4X，计数操作仅限于较大的细胞类型：亚细胞结构（如线粒体或囊泡）以及细菌细胞无法被定量。还需注意，Tali 的检测通道仅限于可在其通道内激发和发射荧光的荧光染料。虽然 YFP 和强荧光的 mCherry 信号可以被检测到，但较弱的 mCherry 信号则无法检测。最后，Tali 仅能分析悬浮状态的细胞，无法准确计数贴附在载玻片上的细胞。此外，对于形态不规则的细胞（包括某些酵母细胞和原代细胞），其计数能力也十分有限。
此外，未来的研究可能会探讨该系统在评估细胞内标志物表达方面的应用。可使用 Invitrogen 的在线 SpectraViewer 工具（www.invitrogen.com/spectraviewer）检查单个染料与相邻通道之间是否存在光谱重叠。鉴于该技术尚属新兴，其全部应用范围仍有待探索。
综上所述，本文展示的Tali基于图像的细胞仪呈现了一种新技术，可同时对细胞群体进行可视化和分析，能够在紧凑的格式下通过简单的操作流程，实现对单个细胞以及细胞群体的评估。
披露
Krissy Remple 和 Laurel Stone 是 Life Technologies 的员工，该公司生产了本文所使用的仪器。Life Technologies 赞助了本视频文章的制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基于图像的Tali细胞仪 | Invitrogen | T10796 | |
| Tali细胞分析载玻片，50片 | Invitrogen | T10794 | |
| Tali细胞分析载玻片，500片 | Invitrogen | T10795 | |
| Tali细胞活力检测试剂盒 - 死细胞红色 | Invitrogen | A10786 | |
| Tali细胞活力检测试剂盒 - 死细胞绿色 | Invitrogen | A10787 | |
| Tali细胞凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | A10788 | |
| U2OS细胞 |
参考文献
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