为了理解发育过程中如何形成复杂的细胞形态（例如神经元树突），准确检测微管排列方式至关重要。本文介绍了一种可靠的免疫组织化学标记方法，用于分析果蝇（Drosophila）幼虫体壁组织中树突状神经元的树突、气管、肌肉及其他组织的微管排列结构。
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摘要
摘要
为了理解复杂细胞形态差异的形成机制，准确追踪微管的组织方式至关重要。Drosophila 幼虫体壁包含多种细胞类型，是研究细胞和组织形态发生的理想模型。例如，气管可用于研究管状结构的形态发生1，而 Drosophila 幼虫的树突分支（DA）感觉神经元已成为解析树突分化通用机制及神经元类型特异性机制的主要体系2-5，同时也被用于研究树突退化机制6。
不同神经元类别之间的树突分支形态可能存在显著差异，甚至在同一神经元的不同分支之间也存在明显不同。7,8. DA神经元中的遗传学研究表明，细胞骨架的差异性组织可能导致树突分支形态的差异4,9-11我们提供一种可靠的免疫标记方法用于检测 体内 DA感觉神经元树突分支中的微管组织（图1、图2，视频1）。本方案展示了对一龄幼虫进行解剖和免疫染色的步骤，该阶段正是感觉神经元树突活跃生长与分支结构形成的时期。 12,13.
除了标记感觉神经元外，该方法还能对肌肉（视频 2、3）、气管（图 3，视频 3）及其他体壁组织中的微管排列实现强效标记。对于希望分析微管排列的研究人员而言，该方法具有重要价值。 原位 在研究调控组织和细胞形态的机制时，体壁。
方案
1. 试剂的准备
开始前的注意事项：解剖和免疫组织化学染色在磁力腔室中进行，幼虫使用特制形状的昆虫针固定。有关磁力腔室的构建以及这些昆虫针制备的详细说明，可参见相关参考文献14,15。简而言之，将一块磁性材料裁出一个1×1 cm的方形孔洞，并在材料背面粘附一片盖玻片，形成一个小腔室。腔室的四周用环氧树脂胶密封；待胶凝固后，使用前需用70%乙醇反复清洗数次。解剖用昆虫针通过弯折成所需形状后，粘接到金属片上制成14,15。除金属片外，我们亦曾使用倒置的平头钢制图钉，并以截断的黄色吸头作为手柄。采用此种磁力腔室装置可在解剖过程中精确控制针的位置以及组织的拉伸程度。
为了在不同亚群的多巴胺能神经元中驱动报告基因的表达，研究人员可使用多种不同的Gal4品系（Shimono及其同事已对此进行总结16）。许多此类品系可从公共品系保藏中心获得。在本代表性实验方案中，我们对一种同时标记了两类形态特征相对比的多巴胺能神经元的果蝇品系进行免疫染色：结构最简单的I类和结构最复杂的IV类(P10-Gal417,18, UAS-mCD8::Kusabira-Orange (KO))。
- 准备无 Ca++ 的 HL3.1 生理盐水
- 单位为 mM：70 NaCl、5 KCl、20 MgCl2、10 NaHCO3、5 HEPES、115 蔗糖和 5 海藻糖；pH 7.219。过滤除菌后于 4°C 保存。注意：无 Ca++ 溶液可防止解剖过程中肌肉收缩。
- 准备 2 倍浓度 PHEM 缓冲液
- 单位为 mM：130 PIPES、60 HEPES、20 EGTA、4 MgSO4；pH 7.0。过滤除菌后于 4°C 保存。
注意：这些试剂在 pH 接近 7.0 之前不会完全溶解。
- 单位为 mM：130 PIPES、60 HEPES、20 EGTA、4 MgSO4；pH 7.0。过滤除菌后于 4°C 保存。
- 固定前立即新鲜配制固定剂。
- 为配制 25 ml 溶液，首先在 50 ml Falcon 管中混合 2 g 多聚甲醛、100 μl 1 M NaOH 和 10 ml 水。
- 将固定剂置于 55°C 水浴摇床中振荡，直至溶液澄清。（总体积约为 11.5 ml。）
- 将固定剂置于冰上冷却。
- 加入 12.5 ml 2× PHEM 缓冲液。
- 用 1 M HCl 将 pH 调至 7.0。
- 加水定容至 25 ml。
- 使用 Whatman 滤纸过滤溶液。
2. 幼虫解剖
开始实验前的注意事项：微管网络（尤其是感觉树突中的微管网络）在解剖开始后会迅速降解。在五分钟内快速完成解剖并立即进行固定，是本实验方案成功的关键因素。
- 用清水清洗幼虫，并使用一根毛发环迅速将其移入液滴中。
- 将幼虫背侧朝上，腹侧朝向玻片。注意：此方向用于观察腹侧神经元簇。若需观察背侧神经元簇，则应反转方向。
- 使用中央的昆虫针将幼虫前端靠近口钩处固定。为获得最佳效果，应将针置于靠近末端的位置。
- 在解剖腔内加入一滴 HL3.1 生理盐水。
- 用显微剪刀剪除幼虫最末端的尾部尖端。注意：此步骤可在幼虫后端形成一个开口，以便后续显微剪刀进入（见步骤 2.7）。
- 用镊子夹住从后端开口处突出的肠道区域，轻柔地将整个肠道拉出。
- 将显微剪刀的一侧刀尖从开口处插入，沿腹侧中线向前剪开。
- 使用两侧的固定针，先固定后端自由的角部，再固定前端，同时轻柔地将幼虫体壁展开成片状。
3. 幼虫肌束的固定、封闭、染色和封片
开始前的注意事项：所有固定和染色步骤均在解剖皿中进行。操作过程中需小心，避免触碰固定幼虫的昆虫针，以免造成组织损伤。为防止实验样本干燥，所有染色步骤应在小型密封盒内进行，并在盒内放置湿润的纸巾以维持湿度。
- 使用黄色枪头吸除无 Ca++ 的 HL3.1 缓冲液。立即用另一支移液器加入固定液。
- 轻轻吹打，使固定液与腔室中残留的无 Ca++ HL3.1 缓冲液充分混匀。立即吸除，然后向腔室中加入新鲜固定液。
- 室温孵育 20 分钟。
- 用 PBST（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）洗涤 6 次，每次 10 分钟。
- 用含 5% 正常山羊血清的 PBST 在室温下封闭 20 分钟。
- 将封闭液替换为用含 5% 正常山羊血清的 PBST 稀释的一抗溶液。所用一抗为小鼠抗 α-Tubulin（DM1A）和大鼠抗 CD8（5H10），两者均按 1/1000 稀释。
注意：在某些情况下，研究者可选择用小鼠抗 Futsch（22C10）20,21（以 1/1000 稀释）替代小鼠抗 α-Tubulin（DM1A）（详见讨论部分）。 - 在 4°C 下孵育过夜（至少 16 小时）。
- 用 PBST 洗涤 6 次，每次 10 分钟。
- 加入用含 5% 正常山羊血清的 PBST 稀释的二抗溶液。所用二抗为 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 和 Cy3 标记的驴抗大鼠 IgG。样品需避光保存，以防荧光染料发生光漂白22。
- 可在室温孵育 2 小时，或在 4°C 孵育过夜后，再于室温孵育 1 小时。
- 用 PBST 洗涤 6 次，每次 10 分钟。
- 将幼虫肌壁切片置于载玻片上，表皮面朝下，用 80% 甘油封片，并用指甲油密封盖玻片边缘，制成“快速”封片标本。
注意：如需更好的组织透明效果及永久稳定的样品，可按照先前描述的方法使用 DPX 封片23。
4. 代表性结果：
在共聚焦显微镜下观察荧光染色结果。图1-2显示，树突分支内的不同区域具有不同的细胞骨架组织结构。图1展示了四类DA神经元树突分支区域在1st 龄幼虫阶段。整个神经突树使用mCD8::KO标记，并通过抗CD8抗体及荧光二抗（Cy3）进行检测。微管蛋白通过抗α-微管蛋白抗体及荧光二抗（Alexa Fluor 488）检测。主分支呈微管蛋白阳性，部分细小侧支则为微管蛋白阴性。视频1为类似染色的I类DA神经元连续切片图像。图2显示了IV类DA神经元神经突树的一个区域，该区域在1st 幼虫龄期阶段。主分支呈Futsch阳性，部分细小的侧分支呈Futsch阴性。图3. 幼虫体壁中的气管显示出复杂的微管结构。影片2和影片3展示了体壁肌肉和气管连续切片的染色结果。
图1图1显示了四类DA神经元树突区域的一个部分，处于1st 龄幼虫阶段。整个神经突通过mCD8::KO标记，并使用抗CD8抗体和荧光二抗（Cy3）检测。微管蛋白使用抗&-微管蛋白抗体及荧光二抗（Alexa 488）。图A-C为连续共聚焦z轴切片（0.5μm），C'-C"，来自C图面板的单抗体染色。示例中用黄色箭头标示含有微管的分支，紫色箭头标示不含微管的分支。红色箭头标示下层上皮细胞中的微管。
图 2。图 2 显示了在 1龄幼虫阶段，用抗 Futsch 和 CD8 抗体染色的 IV 类 da 神经元树突区域的相似区域。整个树突结构通过 mCD8::KO 标记，并使用抗 CD8 抗体及荧光二抗（Cy3）检测。Futsch 通过抗 Futsch 抗体及荧光二抗（Alexa 488）检测。主分支呈 Futsch 阳性，部分细小的侧支呈 Futsch 阴性。示例中用黄色箭头标记了含 Futsch 的分支，紫色箭头标记了不含 Futsch 的分支。
图3. 使用上述抗微管蛋白染色方案染色的气管。该幼虫为三龄幼虫，按先前所述方法解剖23,24. 视频3展示了由方框标记区域的放大连续切片。
视频 1. 连续切片显示一类神经元树突分支中微管蛋白染色的分布。整个树突分支通过 mCD8::KO（品红色）标记，并使用抗 CD8 抗体及荧光二抗（Cy3）检测。微管蛋白（绿色）通过抗 α-微管蛋白抗体及荧光二抗（Alexa Fluor 488）检测。比例尺：视频图像一侧对应切片中的 46.88 μm。点击此处观看视频。
视频 2. 连续切片显示三龄幼虫体壁肌肉中微管蛋白染色的追踪结果。微管蛋白使用抗α-微管蛋白抗体及荧光二抗（Alexa Fluor 488）进行检测。比例尺：视频图像一侧对应切片中的 46.88μm。 点击此处观看视频。
视频 3. 连续切片显示三龄幼虫体壁气管中的微管蛋白染色，该区域在图 3 中以方框标出。微管蛋白使用抗 α-微管蛋白抗体及荧光二抗（Alexa Fluor 488）进行检测。比例尺：视频图像一侧对应切片中的 46.88μm。点击此处观看视频。
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讨论
为了理解复杂细胞形态的形成机制，准确检测微管排列方式至关重要。本文介绍一种可靠的免疫组织化学标记方法，用于检测树突状感觉神经元树突的微管排列结构。除标记感觉神经元外，该方法还可实现对气管、肌肉及其他体壁组织的强效免疫组织化学染色。
我们采用此方案检测DA神经元发育过程中感觉树突内的微管组织。这些树突对损伤或应激极为敏感25，在解剖开始后会迅速降解23。解剖操作应在五分钟或更短时间内完成。气管及其他体壁组织中的微管则更为稳定。本方案改编自用于制备幼虫半体制片以分析神经肌肉接头的既往方法14,15，并针对快速解剖后的快速固定步骤进行了优化。
在分析多巴胺能神经元（DA神经元）的树突时，其上方肌肉和下方上皮细胞中强烈的抗微管蛋白染色26可能导致复杂的染色模式（图1，视频1）。因此，可能需要通过多个连续切片仔细追踪树突染色（视频1），才能对DA神经元树突分支中的微管排列进行完整分析。单克隆抗体可靶向特异性识别Drosophila中...
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢理化学研究所（RIKEN）提供的经费支持。P10-Gal4 果蝇品系由 Alain Vincent（法国图卢兹，保罗·萨巴蒂埃大学）惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子 | Dumont | 11251-20 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 小鼠抗α-微管蛋白（克隆：DM1A） | Sigma-Aldrich | T9026 | 稀释比例 1/1000 |
| 小鼠抗Futsch（克隆：22C10），上清液 | 发育研究杂交瘤库 | 22C10 | 稀释比例 1/1000 |
| 大鼠抗CD8（克隆：5H10） | Caltag | MCD0800 | 稀释比例 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11001 | 稀释比例 1/500 |
| Cy3 抗大鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | 稀释比例 1/200 |
参考文献
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