为了理解发育过程中如何形成复杂的细胞形态（例如神经元树突），准确检测微管排列方式至关重要。本文介绍了一种可靠的免疫组织化学标记方法，用于分析果蝇（Drosophila）幼虫体壁组织中树突状神经元的树突、气管、肌肉及其他组织的微管排列结构。
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摘要
摘要
为了理解复杂细胞形态差异的形成机制，准确追踪微管的组织方式至关重要。Drosophila 幼虫体壁包含多种细胞类型，是研究细胞和组织形态发生的理想模型。例如，气管可用于研究管状结构的形态发生1，而 Drosophila 幼虫的树突分支（DA）感觉神经元已成为解析树突分化通用机制及神经元类型特异性机制的主要体系2-5，同时也被用于研究树突退化机制6。
不同神经元类别之间的树突分支形态可能存在显著差异，甚至在同一神经元的不同分支之间也存在明显不同。7,8. DA神经元中的遗传学研究表明，细胞骨架的差异性组织可能导致树突分支形态的差异4,9-11我们提供一种可靠的免疫标记方法用于检测 体内 DA感觉神经元树突分支中的微管组织（图1、图2，视频1）。本方案展示了对一龄幼虫进行解剖和免疫染色的步骤，该阶段正是感觉神经元树突活跃生长与分支结构形成的时期。 12,13.
除了标记感觉神经元外，该方法还能对肌肉（视频 2、3）、气管（图 3，视频 3）及其他体壁组织中的微管排列实现强效标记。对于希望分析微管排列的研究人员而言，该方法具有重要价值。 原位 在研究调控组织和细胞形态的机制时，体壁。
方案
1. 试剂的准备
开始前的注意事项：解剖和免疫组织化学染色在磁力腔室中进行，幼虫使用特制形状的昆虫针固定。有关磁力腔室的构建以及这些昆虫针制备的详细说明，可参见相关参考文献14,15。简而言之，将一块磁性材料裁出一个1×1 cm的方形孔洞，并在材料背面粘附一片盖玻片，形成一个小腔室。腔室的四周用环氧树脂胶密封；待胶凝固后，使用前需用70%乙醇反复清洗数次。解剖用昆虫针通过弯折成所需形状后，粘接到金属片上制成14,15。除金属片外，我们亦曾使用倒置的平头钢制图钉，并以截断的黄色吸头作为手柄。采用此种磁力腔室装置可在解剖过程中精确控制针的位置以及组织的拉伸程度。
为了在不同亚群的多巴胺能神经元中驱动报告基因的表达，研究人员可使用多种不同的Gal4品系（Shimono及其同事已对此进行总结16）。许多此类品系可从公共品系保藏中心获得。在本代表性实验方案中，我们对一种同时标记了两类形态特征相对比的多巴胺能神经元的果蝇品系进行免疫染色：结构最简单的I类和结构最复杂的IV类(P10-Gal417,18, UAS-mCD8::Kusabira-Orange (KO))。
- 准备无 Ca++ 的 HL3.1 生理盐水
- 单位为 mM：....
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讨论
为了理解复杂细胞形态的形成机制，准确检测微管排列方式至关重要。本文介绍一种可靠的免疫组织化学标记方法，用于检测树突状感觉神经元树突的微管排列结构。除标记感觉神经元外，该方法还可实现对气管、肌肉及其他体壁组织的强效免疫组织化学染色。
我们采用此方案检测DA神经元发育过程中感觉树突内的微管组织。这些树突对损伤或应激极为敏感25，在解剖开始后会迅速降解23。解剖操作应在五分钟或更短时间内完成。气管及其他体壁组织中的微管则更为稳定。本方案改编自用于制备幼虫半体制片以分析神经肌肉接头的既往方法14,15，并针对快速解剖后的快速固定步骤进行了优化。
在分析多巴胺能神经元（DA神经元）的树突时，其上方肌肉和下方上皮细胞中强烈的抗微管蛋白染色26可能导致复杂的染色模式（图1，视频1）。因此，可能需要通过多个连续切片仔细追踪树突染色（视频1），才能对DA神经元树突分支中的微管排列进行完整分析。单克隆抗体可靶向特异性识别Drosophila中.......
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢理化学研究所（RIKEN）提供的经费支持。P10-Gal4 果蝇品系由 Alain Vincent（法国图卢兹，保罗·萨巴蒂埃大学）惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子 | Dumont | 11251-20 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 小鼠抗α-微管蛋白（克隆：DM1A） | Sigma-Aldrich | T9026 | 稀释比例 1/1000 |
| 小鼠抗Futsch（克隆：22C10），上清液 | 发育研究杂交瘤库 | 22C10 | 稀释比例 1/1000 |
| 大鼠抗CD8（克隆：5H10） | Caltag | MCD0800 | 稀释比例 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11001 | 稀释比例 1/500 |
| Cy3 抗大鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | 稀释比例 1/200 |
参考文献
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in....
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