样品制备结核分枝杆菌

Summary

代谢组学的档案结核分枝杆菌确定后在肉汤培养物的生长。条件可以改变，以测试的营养补充剂，氧化剂，抗结核剂的影响，对这种微生物的代谢的档案。提取物制剂的程序是适用于两个1D ¹ H和2D ¹ H- ¹³ C NMR分析。

Abstract

结核分枝杆菌是在全球范围内人类死亡的一个重要原因。两个多（MDR）和广泛耐药（XDR）株的出现，威胁要破坏当前疾病控制工作。因此，迫切需要开发比现有的，更有效的药物和疫苗。 分枝杆菌的基因组肺结核已超过10年，但在我们的基因的功能和重要性的认识有重要的差距。许多研究都因为基因表达的转录组和蛋白质组水平的分析，以确定影响的药物，氧化剂，对全球基因表达模式和生长条件。最终，这些变化的最终响应反映在代谢的细菌组合物，包括几千小分子量的化学品。比较野生型和突变株的代谢概况，无论是未经处理或者tr与一个特定的药物eated，可以有效地允许的目标识别和可能导致具有反结核活性的新型抑制剂的发展。同样地，对代谢组中的两个或多个条件的影响也可以被评估。核磁共振（NMR）是一个功能强大的技术，用于识别和量化的中间代谢产物。在这个协议中，程序编制M.结核病细胞提取物的NMR代谢组学分析进行了阐述。在适当条件下，所需的生物安全级别3遏制^，1收获细胞培养物生长，并进行机械裂解，同时保持冷的温度，以最大限度地提高保存的代谢物。细胞裂解物中回收，过滤灭菌，并存储在超低温度下。从这些细胞提取物的等分试样镀米德尔7H9琼脂集落形成单位验证没有存活的细胞上。后两个月的孵育在37℃下，如果没有㈥能够观察到菌落，取出样品，从包容设施用于下游处理。萃取液冷冻干燥，再悬浮在氘化缓冲液中喷射的NMR仪器，捕获分光数据，然后将其进行统计分析。所描述的方法可以应用于两个一维（1D）的^{1 H} NMR和二维（2D）的^{1 H-13} C-NMR分析。这种方法提供了更可靠的小分子量代谢物鉴定和色谱法比更可靠，更敏感的细胞提取液代谢成分的定量分析。描述的过程中的变化之后的细胞裂解步骤也可以适于并行蛋白质组学分析。

Protocol

1。协议文本

该协议强调的NMR方法，以适应M.肺结核 （III级代理）。因此，必须遵循生物安全3级（BSL3）的做法时，M.肺结核在每年认证的实验室研究。暴露于实验室产生的气溶胶是最重要的工作人员与这些微生物所遇到的危险。下面的过程是在我们的机构中​​进行的变化可能存在​​生物安全委员会的建议的基础上。常见的个人防护设备包括特卫强服，​​圆帽，鞋，N95呼吸器，保护眼睛，袖子，和双对丁腈手套。有关的工作，M.肺结核文化和/或打开操作与M.肺结核容器的类型A2或B2生物安全柜。被放置在塑料覆盖的吸收纸的w工作会有的表面上。将予出售或从设备中移除所有材料/耗材必须放置在两个生物危害袋和消毒的高压灭菌。与的1％Amphyl（结核菌，杀菌，杀菌和杀病毒剂），每个工作结束后，工作台面及机柜内的设备使用（FastPrep-24溶解均质机，分光光度计，桶与冰等）必须进行消毒。M.肺结核文化必须放置在双遏制运输的生物安全柜，冷冻箱，孵化器，离心机，冰箱等以外的更大的设备。离心进行封闭安全杯和O形圈螺旋盖的管。外BSL3实验室作进一步的分析，无细胞提取物被过滤通过0.2微米的过滤器或微生物在95℃下15分钟的加热杀死的^。2样品均镀以验证的菌落形成单位的情况下除去遏制之前。

1. 转移米德尔7H9完整的媒体，含有聚山梨酯80（吐温80，以防止结块）的110毫升肉汤（MA....

Discussion

一个相当多的研究分析，转录组和蛋白质组的配置文件的M.在体外和体内条件下各种肺结核 ^11-16最终，在基因表达和酶活性的变化导致在分子量小的分子的浓度的变化。的完整描述，这些化合物构成的代谢组。因此，药物和不同生长条件对代谢途径的影响可能其次是代谢组学分析^。17,18很少有研究利用这种方法，研究代谢途径中的M.结核 （见下文）和其他的分枝杆菌属，或分析与M.感染小鼠的代谢变化肺结核¹⁹

这种方法是一个潜在的陷阱，一些样品中的微生物可能无法完全溶解。如有必要，裂解步骤可以重复一个或两次以上。裂解效率可以通过执行一个标准的蛋白检测（ 例如 ，BioRad公司DC蛋白测定）监测。代谢物在低浓度存在为了增加检测的灵敏度，几个相同的样品（在步骤8收集的）可以被汇集，冷冻干燥，并重新悬浮在一个较低的体积。

替代分枝杆菌代谢组学研究中的样品制备过程进行.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/设备名称	公司	目录编号	评论
ADC富集	BD BBL米德尔	212352
BACS-120样品转换器	布鲁克
BRUKER AVANCE NMR	布鲁克		500 MHz的
牛血清白蛋白	Fisher Scientific则	BP1600-100	馏分V
离心分离	Beckman Coulter公司	Allegra的X-15R	台式
离心管	康宁	430291	50毫升无菌聚丙烯
低温瓶	康宁	430488	2.0毫升无菌聚丙烯
Cycloheximide	AG科学	C-1189	有毒的
D（+） - 葡萄糖	ACROS	41095-0010
氧化氘	Sigma Aldrich公司	617385
锥形烧瓶	VWR	89095-266	不育，平底，聚碳酸酯，0.22微米PTFE膜通风帽
闪霜瓶	VWR	82018-226	750毫升
冷冻干燥机	VWR	82019-038	4.5 L台式
甘油	GibcoBRL	15514-029
恒温箱	新不伦瑞克省	伊诺40	台式振动筛
裂解矩阵B	MP Biomedicals	6911-100
裂解机	MP Biomedicals	FastPrep-24
微型离心机	Eppendorf公司	5415D	台式
微型离心机	Beckman Coulter公司	微型离心22R	台式
米德尔7H9肉汤	Difco公司	271310
NMR管	诺莱尔	ST500-7	5mM的
OADC富集	BD BBL米德尔	212351
油酸	西格玛	O1008
磷酸氢二钾	VWR	BDH0266
磷酸二氢钾	VWR	BDH0268
- 转子的离心22R	Beckman Coulter公司	F241.5P	密封和聚丙烯
转子 - Allegra的X-15R	Beckman Coulter公司	SX4750	随着生物认证的封面
氯化钠	Fisher Scientific则	S271-3
钠 - 3 - 三甲基甲硅烷基丙-2 ,2,3,3-D4	剑桥同位素	DLM-48
分光光度计	Beckman Coulter公司	DU-530
分光光度计比色皿	生命线	LS-2410	1.5毫升聚苯乙烯，2明确双方
注射器	Becton Dickinson公司	309585	不育，3毫升鲁尔乐
针头式过滤器	的Nalgene	190-2520	0.2微米的无菌醋酸纤维素
吐温80	Fisher Scientific则	BP338-500