Mycobacterium tuberculosis 在液体培养基中培养后，测定其代谢组学谱。可通过改变条件来测试营养补充剂、氧化剂和抗结核药物对该微生物代谢谱的影响。提取物制备步骤适用于一维 1H 和二维 1H-13C 核磁共振（NMR）分析。
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摘要
摘要
Mycobacterium tuberculosis 是全球范围内导致人类死亡的主要原因之一。多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）菌株的出现，威胁到当前的疾病控制工作。因此，迫切需要开发出比现有药物和疫苗更有效的防治手段。M. tuberculosis 的基因组已被解析超过十年，但我们对其基因功能和必需性的认识仍存在重要空白。许多研究已采用转录组学和蛋白质组学水平的基因表达分析，来确定药物、氧化剂以及不同生长条件对基因表达全局模式的影响。最终，这些变化的最终响应体现在细菌的代谢物组成中，包括数千种小分子量化学物质。通过比较野生型与突变株在未处理或特定药物处理条件下的代谢谱，可有效实现药物靶点的鉴定，并可能促进具有抗结核活性的新型抑制剂的开发。同样，也可评估两种或多种条件对代谢组的影响。核磁共振（NMR）是一种用于鉴定和定量代谢中间产物的强大技术。本实验方案描述了用于NMR代谢组学分析的M. tuberculosis细胞提取物的制备步骤。细胞培养需在适当条件下进行，并在生物安全三级（Biosafety Level 3） containment环境中操作1，收获后在低温条件下进行机械裂解，以最大程度地保存代谢物。收集细胞裂解液，经无菌过滤后，于超低温条件下保存。取部分细胞提取物接种于Middlebrook 7H9琼脂平板，测定菌落形成单位，以确认无活菌存在。在37 °C培养两个月后，若未观察到活菌落，样品即可从 containment 设施中移出，进行后续处理。提取物经冷冻干燥后，重悬于氘代缓冲液中，并注入NMR仪器，获取波谱数据，随后进行统计分析。本方案适用于一维（1D）1H NMR和二维（2D）1H-13C NMR分析。与色谱方法相比，该方法在小分子量代谢物的鉴定以及细胞提取物代谢组成定量分析方面具有更高的可靠性、灵敏度和准确性。在细胞裂解步骤之后，本方案的若干变体也可适用于并行的蛋白质组学分析。
方案
1. 实验方案正文
本方案重点介绍了核磁共振（NMR）方法的适应性应用 M. tuberculosis （III 类试剂）。因此，在进行实验时需遵循生物安全等级 3（BSL3）的操作规范 M. tuberculosis 在每年认证的实验室中开展研究。实验室人员在操作这些微生物时，面临的最重要危害是暴露于实验室产生的气溶胶。以下程序由本机构实施，具体操作可能根据机构生物安全委员会的建议有所调整。常规个人防护装备包括Tyvek防护服、无纺布头帽、鞋套、N95呼吸器、眼部防护装置、袖套以及两副丁腈手套。涉及 M. tuberculosis 培养和/或对开放环境中的操作 M. tuberculosis 在A2型或B2型生物安全柜中进行容器操作。工作台面应铺设带塑料覆膜的吸水纸。所有需丢弃或移出实验室的材料/物品必须置于两层生物危害袋中，并通过高压灭菌进行去污。每次操作结束后，须使用1% Amphyl（具有抗分枝杆菌、杀菌、杀真菌和杀病毒作用的消毒剂）对生物安全柜内使用的台面及设备（FastPrep-24细胞裂解均质器、分光光度计、冰桶等）进行消毒。 M. tuberculosis 培养物在转移至生物安全柜外的大型设备（如冰箱、培养箱、离心机和冷藏柜）时，必须置于双重容器中。离心操作需使用封闭的安全杯及带O形圈的螺旋盖管。如需在BSL3实验室外进行进一步分析，无细胞提取物应通过滤膜过滤 0.2 μm ....
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讨论
大量研究已分析了转录组和蛋白质组谱型 M. tuberculosis 在多种条件下 体外 和 体内 条件。11-16 最终，基因表达和酶活性的变化会导致小分子量化合物浓度的改变。对这些化合物的全面描述构成了代谢组。因此，可通过代谢组学分析来追踪药物及不同培养条件对代谢通路的影响。17,18 很少有研究利用该方法来研究代谢通路 M. tuberculosis （参见下文）及其他分枝杆菌，或分析感染小鼠的代谢变化 M. tuberculosis19
该方法的一个潜在缺陷是样本中的某些微生物可能未被完全裂解。如有必要，可将裂解步骤重复一至两次。可通过进行标准蛋白质测定来监测裂解效率（例如，BioRad DC蛋白质测定法）。为了提高对低浓度代谢物的检测灵敏度，可将多个相同的样品（在步骤8中收集）合并，冻干后重悬于较小体积的溶液中。
已有文献报道了分枝杆菌代谢组学研.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨向 Barletta 博士和 Powers 博士实验室的所有成员致以感谢，他们在本实验方案的开发过程中提供了有益的建议。我们感谢 Wendy Austin 在研究讨论和稿件校对方面给予的帮助。本研究工作由内布拉斯加大学林肯分校氧化还原生物学中心（上级资助项目编号：NCRR 2P20RR 017675，负责人：D. Becker）向上述每位研究人员提供的种子试点基金资助。此外，我们感谢 Ofelia Chacon 博士提供其 R21 项目基金（1R21AI087561-01A1）用于购买研究耗材，并资助 Halouska 先生的部分薪资，以支持本文所包含的核磁共振（NMR）技术的标准化工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ADC 富集液 | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 样品更换器 | Bruker | ||
| Bruker Avance 核磁共振仪 | Bruker | 500 MHz | |
| 牛血清白蛋白 | 赛默飞世尔科技 | BP1600-100 | 第五组分 |
| 离心机 | 贝克曼库尔特 | Allegra X-15R | 台式 |
| 离心管 | 康宁 | 430291 | 50 ml 无菌聚丙烯 |
| 冻存管 | 康宁 | 430488 | 2.0 ml 无菌聚丙烯 |
| 放线菌酮 | A.G. Scientific | C-1189 | 有毒 |
| D(+) - 葡萄糖 | ACROS | 41095-0010 | |
| 重水 | 西格玛奥德里奇 | 617385 | |
| 锥形瓶 | VWR | 89095-266 | 无菌，平底，聚碳酸酯，带 0.22 μm PTFE 透气盖 |
| 速冻烧瓶 | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| 冷冻干燥机 | VWR | 82019-038 | 4.5 L 台式 |
| 甘油 | 吉布科生命技术 | 15514-029 | |
| 培养箱 | 新不伦瑞克 | Innova 40 | 台式摇床 |
| 裂解基质 B | MP 生物医学 | 6911-100 | |
| 组织破碎仪 | MP 生物医学 | FastPrep-24 | |
| 微量离心机 | 艾本德 | 5415D | 台式 |
| 微量离心机 | 贝克曼库尔特 | Microfuge 22R | 台式 |
| Middlebrook 7H9 液体培养基 | Difco | 271310 | |
| 核磁共振管 | Norell | ST500-7 | 5 mM |
| OADC 富集液 | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| 油酸 | 西格玛 | O1008 | |
| 磷酸氢二钾 | VWR | BDH0266 | |
| 磷酸二氢钾 | VWR | BDH0268 | |
| 转子 - Microfuge 22R | 贝克曼库尔特 | F241.5P | 密封式聚丙烯转子 |
| 转子 - Allegra X-15R | 贝克曼库尔特 | SX4750 | 带生物认证盖 |
| 氯化钠 | 赛默飞世尔科技 | S271-3 | |
| 钠-3-三甲基硅丙酸-2,2,3,3-D4 | 剑桥同位素 | DLM-48 | |
| 分光光度计 | 贝克曼库尔特 | DU-530 | |
| 分光光度计比色皿 | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml 聚苯乙烯，两侧透明 |
| 注射器 | 贝克顿-迪金森 | 309585 | 无菌，3 ml 鲁尔锁 |
| 注射器滤器 | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm 无菌醋酸纤维素 |
| 吐温 80 | 赛默飞世尔科技 | BP338-500 |
参考文献
- Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol<....
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