Mycobacterium tuberculosis 在液体培养基中培养后，测定其代谢组学谱。可通过改变条件来测试营养补充剂、氧化剂和抗结核药物对该微生物代谢谱的影响。提取物制备步骤适用于一维 1H 和二维 1H-13C 核磁共振（NMR）分析。
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摘要
摘要
Mycobacterium tuberculosis 是全球范围内导致人类死亡的主要原因之一。多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）菌株的出现，威胁到当前的疾病控制工作。因此，迫切需要开发出比现有药物和疫苗更有效的防治手段。M. tuberculosis 的基因组已被解析超过十年，但我们对其基因功能和必需性的认识仍存在重要空白。许多研究已采用转录组学和蛋白质组学水平的基因表达分析，来确定药物、氧化剂以及不同生长条件对基因表达全局模式的影响。最终，这些变化的最终响应体现在细菌的代谢物组成中，包括数千种小分子量化学物质。通过比较野生型与突变株在未处理或特定药物处理条件下的代谢谱，可有效实现药物靶点的鉴定，并可能促进具有抗结核活性的新型抑制剂的开发。同样，也可评估两种或多种条件对代谢组的影响。核磁共振（NMR）是一种用于鉴定和定量代谢中间产物的强大技术。本实验方案描述了用于NMR代谢组学分析的M. tuberculosis细胞提取物的制备步骤。细胞培养需在适当条件下进行，并在生物安全三级（Biosafety Level 3） containment环境中操作1，收获后在低温条件下进行机械裂解，以最大程度地保存代谢物。收集细胞裂解液，经无菌过滤后，于超低温条件下保存。取部分细胞提取物接种于Middlebrook 7H9琼脂平板，测定菌落形成单位，以确认无活菌存在。在37 °C培养两个月后，若未观察到活菌落，样品即可从 containment 设施中移出，进行后续处理。提取物经冷冻干燥后，重悬于氘代缓冲液中，并注入NMR仪器，获取波谱数据，随后进行统计分析。本方案适用于一维（1D）1H NMR和二维（2D）1H-13C NMR分析。与色谱方法相比，该方法在小分子量代谢物的鉴定以及细胞提取物代谢组成定量分析方面具有更高的可靠性、灵敏度和准确性。在细胞裂解步骤之后，本方案的若干变体也可适用于并行的蛋白质组学分析。
方案
1. 实验方案正文
本方案重点介绍了核磁共振（NMR）方法的适应性应用 M. tuberculosis （III 类试剂）。因此，在进行实验时需遵循生物安全等级 3（BSL3）的操作规范 M. tuberculosis 在每年认证的实验室中开展研究。实验室人员在操作这些微生物时，面临的最重要危害是暴露于实验室产生的气溶胶。以下程序由本机构实施，具体操作可能根据机构生物安全委员会的建议有所调整。常规个人防护装备包括Tyvek防护服、无纺布头帽、鞋套、N95呼吸器、眼部防护装置、袖套以及两副丁腈手套。涉及 M. tuberculosis 培养和/或对开放环境中的操作 M. tuberculosis 在A2型或B2型生物安全柜中进行容器操作。工作台面应铺设带塑料覆膜的吸水纸。所有需丢弃或移出实验室的材料/物品必须置于两层生物危害袋中，并通过高压灭菌进行去污。每次操作结束后，须使用1% Amphyl（具有抗分枝杆菌、杀菌、杀真菌和杀病毒作用的消毒剂）对生物安全柜内使用的台面及设备（FastPrep-24细胞裂解均质器、分光光度计、冰桶等）进行消毒。 M. tuberculosis 培养物在转移至生物安全柜外的大型设备（如冰箱、培养箱、离心机和冷藏柜）时，必须置于双重容器中。离心操作需使用封闭的安全杯及带O形圈的螺旋盖管。如需在BSL3实验室外进行进一步分析，无细胞提取物应通过滤膜过滤 0.2 μm 过滤或加热灭活的微生物 95 °C 15分钟。2 样品经涂布培养以确认无菌落形成单位存在后，方可从密闭环境中移出。
- 将 110 ml 含吐温 80（Tween 80，防止菌体聚集）的 Middlebrook 7H9 完全培养基（MADC-TW）或合适的培养基转移至 250 ml 锥形瓶中。使用 13C-代谢物时，每个实验条件通常设置三个重复培养；进行 1D 1H NMR 分析时，则需培养十个相同的培养物。对于两个实验条件（例如，加药与不加药），可将每份重复培养物的体积加倍，随后均分为两个相同的培养体系。所有试剂和溶液的配制方法均在本方案末尾提供。
- 用 0.150 ml 的 M. tuberculosis 50% 甘油菌种（置于冰上解冻）接种液体培养基。参见下方注释 1。
- 将培养物在 37 °C、100 rpm 振荡条件下培养约 6 天（OD600 为 0.6–0.8）。参见下方注释 2。
- 若无需添加抗生素、其他添加剂或处理，则培养物可直接用于收获。若需进行处理，则继续进行第 5 步。从每个锥形瓶中取出 0.5 ml 样品，转移至微量离心管中，并置于 4 °C 下用于培养滴定和质量控制：污染检测、表型分析、PCR 检测。参见下方注释 3。此时，继续进行第 6 步。
- 将锥形瓶从摇床中取出，进行所需处理（例如，添加药物或代谢物）。将锥形瓶放回摇床，继续孵育一段时间（例如，6–18 小时）。孵育结束后，再取 1.0 ml 等分试样，测定 OD600。从每个锥形瓶中取出 0.5 ml 样品，转移至微量离心管中，并置于 4 °C 下用于培养滴定和质量控制。
- 将培养物置于冰上 5 分钟。此后，在整个剩余操作过程中均需将细胞保持在冰上。使用台式离心机在 4 °C、2,000 × g 条件下离心 15 分钟（使用 50 ml 离心管）收集细胞。每个培养物需使用四支离心管，每管装液 25 ml（为获得足够的信噪比，2D 1H-13C NMR 实验需总共 100 ml 培养物，而 1D 1H NMR 实验每份培养物仅需 50 ml）。
- 使用冰冻的 ddH2O 对每个细胞沉淀清洗两次（第一次约 15 ml，第二次约 10 ml），离心参数同上。第二次清洗时，将 10 ml 的等分试样合并至同一离心管中再进行离心。将细胞沉淀重悬于最终体积为 1.0 ml 的 ddH2O 中（需根据细胞沉淀体积进行调整）。若在此步骤中希望获得无聚集的单细胞悬液，可短暂超声处理和/或通过 27 号针头反复吹打三次。或者，也可将细胞沉淀在 -80 °C 冻存，待后续处理时使用。在后一种情况下，冻存的沉淀需在冰上解冻后再进行重悬。按上述方法将细胞沉淀重悬于最终体积为 1.0 ml 的 ddH2O 中。
- 将 1.0 ml 细胞悬液转移至含有 Lysing Matrix B（0.1 mm 二氧化硅微珠）的 2.0 ml 螺口管中。将 FastPrep-24 裂解均质仪置于生物安全柜内。将样品放入样品架中，并将固定轮辐板压紧在管口上方。在均质仪中以 6 米/秒的速度处理样品 60 秒。
- 在微量离心机中以 15,000 × g、4 °C 离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片和完整细胞。
- 移除上清液，并通过注射器滤器（0.2 μm）将样品滤入无菌管中。取 0.1 ml 样品（或代表性部分，例如 10%）涂布于 MADC 琼脂平板，以确认无活菌存在。研究者也可进行多次过滤操作和/或使用活-死染色法检测提取物中是否存在活菌，以预防或识别任何潜在的生物安全风险。将样品在乙醇-干冰浴中速冻，随后于 -80 °C 保存，直至进行冻干处理并在核磁共振（NMR）设施中进一步分析。
- 两个月后检查平板，确认无菌落形成单位（CFU）生长。若未发现 CFU，样品可移出 BSL3 实验室。后续分析在标准 NMR 设施中进行，该设施通常为多用户共享，无需特殊生物 containment 要求。
- 将样品冻干至完全干燥，然后重悬于 0.7 ml NMR 缓冲液中，并转移至微量离心管。在 13,000 × g 条件下离心 3 分钟。取 0.6 ml 转移至 5 mm NMR 样品管中。或者，冻干后的样品也可作为非生物危害性常规样品邮寄至外部检测机构。
- 应立即采集 NMR 数据。尽管已采取所有预防措施，样品中仍可能存在具有活性的酶，因此样品通常无法长期稳定。当样品在室温或 4 °C 放置超过 1 周时，NMR 谱图变化明显。此外，应交替采集未处理组与药物处理组的 NMR 数据，从每组中随机选取样品进行检测。这可避免因某组样品在 NMR 检测前等待时间过长而引入不必要的偏差。若先采集所有未处理样品的 NMR 谱图，再采集药物处理组的谱图，则可能导致数据偏差。若样品无法立即进行 NMR 分析，应将其保存在 1 ml Eppendorf 管中，并置于 -80 °C 冻存。
- 将样品插入 BACS-120 自动进样器后，需进行仪器校准，包括锁场、匀场、调谐以及优化 90 ° 脉冲长度等常规步骤，以最大程度提高结果质量。使用单一样品校准 90 ° 脉冲长度，并为后续样品调谐仪器。通过 ICONNMR 和 gradshim 系统自动完成每一样品的锁场、匀场及 NMR 数据采集。
- 使用 Bruker zgesgp 脉冲序列并结合激发塑形法（excitation sculpting）进行水峰抑制，采集 1D 1H NMR 谱图。共采集 32k 数据点，谱宽为 5482.5 Hz，累加 128 次扫描，预扫描 16 次。使用 Bruker hsqcetgp 脉冲序列采集 2D 1H-13C HSQC 谱图。直接 1H 维采集 2048 个数据点，谱宽为 5000.0 Hz；间接 13C 维采集 64 个数据点，谱宽为 18864.9 Hz。该谱图累加 128 次扫描，预扫描 16 次，以获得良好的信噪比。
图1. 实验流程示意图。
NMR 缓冲液
含50 μM TMSP的50 mM磷酸钾缓冲液储备液：
- 2.17 g K2HPO4（磷酸氢二钾）
- 1.70 g KH2PO4（磷酸二氢钾）
- 7.86 mg 三甲基硅丙酸钠（TMSP-2,2,3,3-D4（D,98%））
- 溶于 500 ml “100%” D2O 中
- 最终溶液的 pH 值应为 7.2（未校正）
MADC-TW 或 MOADC-TW（1 L）
- 4.7 g Middlebrook 7H9 肉汤基础
- 900 ml ddH₂O2O
- 2 ml 甘油
- 混合各组分，121°C高压灭菌25分钟。冷却至不烫手后，加入以下溶液：
- 制备MADC时使用100 ml ADC，制备MOADC时使用100 ml OADC
- 2.5 ml 20% 吐温80（或1 ml 不可代谢的20% Tyloxapol）
- 10 ml 1% 放线菌酮
ADC（1 L）
- 20 g D(+)-葡萄糖
- 50 g BSA 第五组分
- 8.5 g 氯化钠
- 800 ml ddH2O
- 共同溶解，定容至 1 L，用 0.2 μm 滤器除菌。4 °C 保存。
或者，制备OADC（1 L）时，将上述所列所有组分以及50 ml 1%油酸（以下配方制备250 ml批次）一并加入。混合溶解后定容至1 L，用0.2 μm滤器除菌。瓶装后需用铝箔包裹，并于4 °C保存。
- 2.5 g 油酸
- 250 ml 0.2M NaOH
- 将油酸（冷藏后会凝固）在 55 °C 加热 10 分钟以解冻，加入 NaOH 溶液中，搅拌加热 60 分钟。储存于用铝箔包裹的无菌玻璃瓶中，用封口膜密封后于 4 °C 保存。
如果需要，您可以购买市售的BD BBL Middlebrook ADC或含过氧化氢酶的OADC增补剂。
1% 放线菌酮（100 ml）
- 1 g 放线菌酮
- 100 ml ddH2O
用0.2 μm滤器溶解并灭菌，4 °C保存。注意：放线菌酮有毒，操作时需格外小心。
20% (v/v) 吐温80（100 ml）
- 20 ml Tween 80
- 80 ml ddH2O
或者，称取20 g吐温80（约18.9 ml；密度1.06 g/ml），配制20% w/v溶液。将溶液在55 °C加热30分钟以充分溶解并彻底混匀。使用0.2 μm滤器对液体进行灭菌。将最终溶液于室温保存。
20% (v/v) Tyloxapol (100ml)
- 20 ml Tyloxapol
- 80 ml ddH2O
或者，称取20 g司盘-80（约18.2 ml；密度1.1 g/ml），以配制20% w/v溶液。将溶液在55 °C加热30分钟以完全溶解，并充分混匀。使用0.2 μm滤器对液体进行灭菌。将最终溶液于室温保存。
注1：使用以下方案制备结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的甘油菌种保存液。
放养 M. tuberculosis
- 在37 °C、摇床（100 rpm）条件下，将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在50 ml MADC培养基中培养至饱和（OD600 = 1.5 至 2.0）。根据菌株不同，此过程需要7-14天。
- 在4 °C下以2,000 × g离心15分钟，使菌体沉淀；弃去上清液。
- 用6 ml无菌的50%甘油重悬菌体。
- 将重悬液分装至4个Corning冻存管中，每管1.5 ml，并做好相应标记。
- 立即置于乙醇/干冰浴中快速冷冻，并于-80 °C保存。
注意 2：将 H37Rv 菌株（-80 °C 保存的菌种，使用年限不超过 1.5 年）接种至 70 ml MADC 培养基中，在 Innova 40 摇床中于 37 °C、100 rpm 振荡培养 5 天后，OD600 约为 0.6。
注意 3：为检测培养物污染，研究人员可将培养物等分试样接种至标准富集培养基，并在过夜培养后确认无菌生长。常规操作中，将培养物划线接种于 MADC 琼脂平板，以观察菌落形态，并通过相差显微镜进行检查。如需验证，可使用 IS6110 引物进行 PCR 检测，方法如文献3所述。
2. 典型结果
制备良好的样品将产生与图2所示相似的核磁共振（NMR）谱图。该谱图代表了结核分枝杆菌（M. tuberculosis）野生型的代谢物池。所鉴定的代谢物直接或间接地与D-丙氨酸代谢途径相关。此外，峰强度的大小与细胞提取物中代谢物的浓度成正比。因此，未经处理的培养物、药物处理组以及突变菌株之间峰强度的变化可反映代谢物及代谢通路的扰动情况。结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的一维1H NMR谱图是在配备三共振Z轴梯度低温探头的Bruker Avance 500 MHz波谱仪上采集的。该谱图包含约400个峰，从中可鉴定并定量40至50种代谢物，包括氨基酸、核苷酸前体以及糖酵解和三羧酸循环中间产物。使用配备Bruker Icon软件的BACS-120自动进样器以实现NMR数据采集的自动化。采用激发塑形技术（excitation sculpting）4采集一维1H NMR谱图，以高效去除溶剂信号并保持基线平坦，从而避免因基线校正可能在后续主成分分析（PCA）或正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）中引入伪影。一维1H NMR谱图在25 °C下采集，谱宽为5482.5 Hz，数据点为32K。共进行16次预扫描和128次信号累加以获得谱图。使用ACD Labs一维NMR处理软件对所有一维1H NMR谱图进行半自动处理。谱图经傅里叶变换、相位校正，并以TMSP峰（0.0 ppm）为参考进行化学位移校准。二维1H-13C NMR谱图使用NMRpipe软件包单独处理，并通过NMRDraw进行分析。首先将Bruker FID数据文件转换为NMRpipe可识别的格式，然后对谱图进行傅里叶变换、相位校正和零填充处理。利用1H和13C化学位移容差分别为0.05和0.50 ppm的标准，结合麦迪逊代谢组学联盟数据库（Madison Metabolomics Consortium Database, MMCD）5、生物磁共振数据库（BioMagResBank）6以及人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）7，将一维1H NMR谱图和二维1H-13C NMR谱图中观察到的NMR峰归属至特定代谢物。具体而言，对一维和二维NMR谱图进行手动选峰，将获得的NMR化学位移峰列表上传至人类代谢组数据库。根据匹配的NMR共振峰数量最大化以及代谢物所属的代谢网络关系，将数据库鉴定出的代谢物归属至NMR谱图。每种化合物或代谢物通常具有多个C-H键对，相应地在NMR谱图中表现为多个共振信号。因此，实验NMR谱图中观测到的此类共振信号越多，该代谢物存在的可能性就越大。同样，若鉴定出多个属于同一代谢通路的代谢物，则可进一步提高归属结果的可靠性。代谢物及其代谢通路的存在性通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）8和MetaCyc数据库9进行验证。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）是研究结核分枝杆菌（M. tuberculosis）及其他分枝杆菌病原体的有用模型系统。如其他文献所述，M. smegmatis样品也可通过超声破碎进行处理10。
图 2. 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）细胞提取物的一维1H 核磁共振（NMR）谱图。与代表性代谢物相关的 NMR 峰已标注。缩写如下：AMP，腺苷一磷酸；α-Kg，α-酮戊二酸；Glu，谷氨酸；Ala，丙氨酸。
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讨论
大量研究已分析了转录组和蛋白质组谱型 M. tuberculosis 在多种条件下 体外 和 体内 条件。11-16 最终，基因表达和酶活性的变化会导致小分子量化合物浓度的改变。对这些化合物的全面描述构成了代谢组。因此，可通过代谢组学分析来追踪药物及不同培养条件对代谢通路的影响。17,18 很少有研究利用该方法来研究代谢通路 M. tuberculosis （参见下文）及其他分枝杆菌，或分析感染小鼠的代谢变化 M. tuberculosis19
该方法的一个潜在缺陷是样本中的某些微生物可能未被完全裂解。如有必要，可将裂解步骤重复一至两次。可通过进行标准蛋白质测定来监测裂解效率（例如，BioRad DC蛋白质测定法）。为了提高对低浓度代谢物的检测灵敏度，可将多个相同的样品（在步骤8中收集）合并，冻干后重悬于较小体积的溶液中。
已有文献报道了分枝杆菌代谢组学研...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨向 Barletta 博士和 Powers 博士实验室的所有成员致以感谢，他们在本实验方案的开发过程中提供了有益的建议。我们感谢 Wendy Austin 在研究讨论和稿件校对方面给予的帮助。本研究工作由内布拉斯加大学林肯分校氧化还原生物学中心（上级资助项目编号：NCRR 2P20RR 017675，负责人：D. Becker）向上述每位研究人员提供的种子试点基金资助。此外，我们感谢 Ofelia Chacon 博士提供其 R21 项目基金（1R21AI087561-01A1）用于购买研究耗材，并资助 Halouska 先生的部分薪资，以支持本文所包含的核磁共振（NMR）技术的标准化工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ADC 富集液 | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 样品更换器 | Bruker | ||
| Bruker Avance 核磁共振仪 | Bruker | 500 MHz | |
| 牛血清白蛋白 | 赛默飞世尔科技 | BP1600-100 | 第五组分 |
| 离心机 | 贝克曼库尔特 | Allegra X-15R | 台式 |
| 离心管 | 康宁 | 430291 | 50 ml 无菌聚丙烯 |
| 冻存管 | 康宁 | 430488 | 2.0 ml 无菌聚丙烯 |
| 放线菌酮 | A.G. Scientific | C-1189 | 有毒 |
| D(+) - 葡萄糖 | ACROS | 41095-0010 | |
| 重水 | 西格玛奥德里奇 | 617385 | |
| 锥形瓶 | VWR | 89095-266 | 无菌，平底，聚碳酸酯，带 0.22 μm PTFE 透气盖 |
| 速冻烧瓶 | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| 冷冻干燥机 | VWR | 82019-038 | 4.5 L 台式 |
| 甘油 | 吉布科生命技术 | 15514-029 | |
| 培养箱 | 新不伦瑞克 | Innova 40 | 台式摇床 |
| 裂解基质 B | MP 生物医学 | 6911-100 | |
| 组织破碎仪 | MP 生物医学 | FastPrep-24 | |
| 微量离心机 | 艾本德 | 5415D | 台式 |
| 微量离心机 | 贝克曼库尔特 | Microfuge 22R | 台式 |
| Middlebrook 7H9 液体培养基 | Difco | 271310 | |
| 核磁共振管 | Norell | ST500-7 | 5 mM |
| OADC 富集液 | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| 油酸 | 西格玛 | O1008 | |
| 磷酸氢二钾 | VWR | BDH0266 | |
| 磷酸二氢钾 | VWR | BDH0268 | |
| 转子 - Microfuge 22R | 贝克曼库尔特 | F241.5P | 密封式聚丙烯转子 |
| 转子 - Allegra X-15R | 贝克曼库尔特 | SX4750 | 带生物认证盖 |
| 氯化钠 | 赛默飞世尔科技 | S271-3 | |
| 钠-3-三甲基硅丙酸-2,2,3,3-D4 | 剑桥同位素 | DLM-48 | |
| 分光光度计 | 贝克曼库尔特 | DU-530 | |
| 分光光度计比色皿 | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml 聚苯乙烯，两侧透明 |
| 注射器 | 贝克顿-迪金森 | 309585 | 无菌，3 ml 鲁尔锁 |
| 注射器滤器 | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm 无菌醋酸纤维素 |
| 吐温 80 | 赛默飞世尔科技 | BP338-500 |
参考文献
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