样品制备结核分枝杆菌

摘要

代谢组学的档案结核分枝杆菌确定后在肉汤培养物的生长。条件可以改变，以测试的营养补充剂，氧化剂，抗结核剂的影响，对这种微生物的代谢的档案。提取物制剂的程序是适用于两个1D ¹ H和2D ¹ H- ¹³ C NMR分析。

摘要

结核分枝杆菌是在全球范围内人类死亡的一个重要原因。两个多（MDR）和广泛耐药（XDR）株的出现，威胁要破坏当前疾病控制工作。因此，迫切需要开发比现有的，更有效的药物和疫苗。 分枝杆菌的基因组肺结核已超过10年，但在我们的基因的功能和重要性的认识有重要的差距。许多研究都因为基因表达的转录组和蛋白质组水平的分析，以确定影响的药物，氧化剂，对全球基因表达模式和生长条件。最终，这些变化的最终响应反映在代谢的细菌组合物，包括几千小分子量的化学品。比较野生型和突变株的代谢概况，无论是未经处理或者tr与一个特定的药物eated，可以有效地允许的目标识别和可能导致具有反结核活性的新型抑制剂的发展。同样地，对代谢组中的两个或多个条件的影响也可以被评估。核磁共振（NMR）是一个功能强大的技术，用于识别和量化的中间代谢产物。在这个协议中，程序编制M.结核病细胞提取物的NMR代谢组学分析进行了阐述。在适当条件下，所需的生物安全级别3遏制^，1收获细胞培养物生长，并进行机械裂解，同时保持冷的温度，以最大限度地提高保存的代谢物。细胞裂解物中回收，过滤灭菌，并存储在超低温度下。从这些细胞提取物的等分试样镀米德尔7H9琼脂集落形成单位验证没有存活的细胞上。后两个月的孵育在37℃下，如果没有㈥能够观察到菌落，取出样品，从包容设施用于下游处理。萃取液冷冻干燥，再悬浮在氘化缓冲液中喷射的NMR仪器，捕获分光数据，然后将其进行统计分析。所描述的方法可以应用于两个一维（1D）的^{1 H} NMR和二维（2D）的^{1 H-13} C-NMR分析。这种方法提供了更可靠的小分子量代谢物鉴定和色谱法比更可靠，更敏感的细胞提取液代谢成分的定量分析。描述的过程中的变化之后的细胞裂解步骤也可以适于并行蛋白质组学分析。

方案

1。协议文本

该协议强调的NMR方法，以适应M.肺结核 （III级代理）。因此，必须遵循生物安全3级（BSL3）的做法时，M.肺结核在每年认证的实验室研究。暴露于实验室产生的气溶胶是最重要的工作人员与这些微生物所遇到的危险。下面的过程是在我们的机构中​​进行的变化可能存在​​生物安全委员会的建议的基础上。常见的个人防护设备包括特卫强服，​​圆帽，鞋，N95呼吸器，保护眼睛，袖子，和双对丁腈手套。有关的工作，M.肺结核文化和/或打开操作与M.肺结核容器的类型A2或B2生物安全柜。被放置在塑料覆盖的吸收纸的w工作会有的表面上。将予出售或从设备中移除所有材料/耗材必须放置在两个生物危害袋和消毒的高压灭菌。与的1％Amphyl（结核菌，杀菌，杀菌和杀病毒剂），每个工作结束后，工作台面及机柜内的设备使用（FastPrep-24溶解均质机，分光光度计，桶与冰等）必须进行消毒。M.肺结核文化必须放置在双遏制运输的生物安全柜，冷冻箱，孵化器，离心机，冰箱等以外的更大的设备。离心进行封闭安全杯和O形圈螺旋盖的管。外BSL3实验室作进一步的分析，无细胞提取物被过滤通过0.2微米的过滤器或微生物在95℃下15分钟的加热杀死的^。2样品均镀以验证的菌落形成单位的情况下除去遏制之前。

1. 转移米德尔7H9完整的媒体，含有聚山梨酯80（吐温80，以防止结块）的110毫升肉汤（MADC-TW）或一个合适的培养基中的250毫升的锥形烧瓶中。一式三份的文化常规种植每条件时，使用^13个 C-代谢物，10个相同的文化生长的一维^{1 H-NMR}分析。两个条件（ 例如 ，不加药物），双量均的文化，每重复可以生长并分裂成两个相同的文化。所有的试剂和溶液的配方中所提供结束时的协议。
2. 接种到肉汤0.150毫升M.结核病 50％的甘油（允许在冰上解冻）。请参阅下面的注意事项1。
3. 让文化成长在37°C，100rpm振荡约6天（OD ₆₀₀ 0.6-0.8）。请参阅下文附注2。
4. 如果没有抗生素，替代增加或其他治疗是必要的，文化是随时可以收获。如果用于治疗，继续直接执行步骤5。从每个烧瓶中取出0.5毫升样品，转移到离心管中，在4°C文化滴定和质量控制污染检测，表型分析，PCR检测。请参阅下文附注3。在这一点上，继续进行第6步。
5. 将瓶中删除振动筛和执行所需的处理（ 如添加药物或代谢物）。地点烧瓶，振动筛，并培育一个额外的周期（ 如 6-18小时）。在这段时间结束后，另取1.0毫升，并确定OD _600。从每个烧瓶中取出0.5毫升样品，转移到离心管中，在4°C的文化滴定和质量控制。
6. 地点文化在冰上5分钟。在此步骤之后，留下细胞在冰上在整个的其它协议。通过离心收获培养在2,000 xg和4℃下15分钟在50毫升的试管，使用台式离心机。每个文化将需要用25毫升每个（共1的四根管00毫升是必需的，以获得足够的信号与噪声的用于2D ^{1 H-13 C} NMR实验，其中只有50毫升每培养所需的1D ^{1 H} NMR的实验）。
7. 每个细胞沉淀洗净两次与冰冷的DDH _{2 O（}大约15毫升的第一次和10毫升的第二次），如上所述通过离心参数。对于第二次洗涤，结合到相同的管中的10毫升等分试样纺丝前。在终体积为1.0ml，DDH _{2 O（}需要调整为细胞沉淀体积）中重悬细胞沉淀。如果在此步骤中，所需的单细胞悬浮液，无结块细胞可以简要地超声处理和/或通过一个27号针头的三倍。另外，将细胞沉淀可以在-80℃下冷冻直至进一步处理和存储。在后者的情况下，冷冻粒料之前，再悬浮于冰上解冻。重悬细胞沉淀，在最终体积为1.0毫升DDH _{2 O，}如上所述。
8. 内部转移r为1.0毫升细胞悬浮液至2.0ml含有溶胞矩阵B（0.1毫米的二氧化硅微球）的螺旋盖管。将FastPrep-24裂解匀浆内的生物安全柜。然后将材料放入的样本保持器，固定保持辐板在管的顶部。设定为6米/秒的速度，在均化器中处理样品60秒。
9. 在微型旋转样品在15,000 xg和4℃下进行10分钟以沉淀细胞碎片和完整细胞。
10. 到无菌管中取出上清液和通样品通过注射器过滤器（0.2μm）。板0.1毫升MADC琼脂上的样品（或有代表性的部分，例如10％）的样品，以验证是否存在没有存活的细胞。侦查人员也可以进行一个以上的过滤步骤，和/或验证的存在下存活的细胞提取物中使用活死的染色程序，以便防止或识别的任何潜在的生物安全顾虑。冷冻样品中的乙醇 - 干冰浴存储在-80℃下，直到他们准备要冷冻干燥和处理中的NMR设施。
11. 2个月后，检查板来验证的情况下的菌落形成单位。如果没有CFU被发现，样本可能采取的BSL3实验室。进行进一步的分析，在标准的NMR的设施，这通常提供多用户和下运作没有具体的遏制要求。
12. 样品冷冻干燥至干，然后重新悬浮在0.7毫升的NMR缓冲区，并转移到一个离心管中。在13000×g下离心3分钟。取出0.6毫升和转移到一个5毫米的NMR管中。另外，冻干样品邮寄给非的生物危害性定期样本的外部设备。
13. NMR数据立即被收集。尽管所有的预防措施，活性酶可能仍存在，样品通常并不稳定，很长一段时间。的NMR谱中的变化是引人注目的，当样品被排除为m，在室温或在4℃下矿石超过1周。此外，NMR数据收集未经治疗和药物治疗的文化，从每个类别中随机抽取的样品之间交替。这可以防止不必要的偏见，因为收集的NMR谱是之前，一个特定的类别有一个较长的延迟。如果所有未处理的样品的NMR光谱首先收集，然后依次由药物处理过的样品中的数据会发生甲偏置。如果样本不能被立即通过NMR分析，样品应在-80℃下储存在1毫升Eppendorf管中
14. BACS-120样品更换，仪器校准，这涉及到几个常规的措施，如锁，垫片，调整和优化的90°脉冲长度，插入样品后，需要最高质量的结果。单一样本是用来校准的90°脉冲的长度和对剩余的样品调整仪器。锁定，匀场，对每个样品的NMR数据采集的自动化全光照克ICONNMR和gradshim。
15. 甲1D ^{1 H} NMR谱是使用布鲁克zgesgp脉冲序列收集与水抑制使用激发雕刻。一个32k的数据点用扫描宽度5482.5Hz，128扫描，和16个虚拟扫描。 A 2D ^{1 H-13 C} HSQC谱的收集，使用的布鲁克hsqcetgp的脉冲序列。共2048个数据点与扫描宽度5000.0赫兹一起被采集的直接¹ H尺寸，和64个数据点，沿间接¹³ C尺寸的扫描宽度18864.9赫兹。收集具有128扫描和16个虚拟扫描的频谱，以获得良好的信号噪声。

图1，一种实验程序的流程图被描述。

NMR缓冲

原液的50mM磷酸钾的buff呃50μM第三次会议:

• 2.17克K ₂ HPO _4（磷酸氢二钾）
• 1.70克KH ₂ PO _4（磷酸二氢钾）
• 7.86毫克钠3 -三甲基甲硅烷基丙（TMSP-2 ,2,3,3-D _{4（D，98％））}
• "100％"D _{2 O}溶解于500毫升
• 最终的解决方案应该是在pH 7.2的（未校正的）

MADC-TW或MOADC的TW（1L）

• 4.7克米德尔7H9肉汤基础
• 900 ML DDH _{2 O}
• 2 mL甘油
• 混合组分和25分钟的高压釜。清凉的液体接触，并添加以下解决方案:
• 百毫升ADC在准备MADC或100毫升OADC的在准备MOADC时
• 2.5毫升20％的吐温80（可选地，1毫升的20％的非代谢泰洛沙泊）
• 10毫升1％的放线菌酮

ADC（1L）中

• 20克D（+） - 葡萄糖
• BSA分数50克V
• 8.5克氯化钠
• 800 ML DDH _{2 O}
• 溶解在一起，调整音量至1 L与0.2微米的过滤器和消毒。存放于4℃

另外，准备OADC（1L），添加1％的油酸（配方下面，使250毫升的批次）加50毫升以上列出的所有组件。溶解在一起，调整音量至1 L与0.2微米的过滤器和消毒。瓶需要被包装在铝箔和商店在4°C。

• 2.5克油酸
• 250毫升0.2M的NaOH
• 解冻油酸（固化制冷时）通过加​​热在55℃下10分钟，并在搅拌下进行60分钟，加至NaOH溶液中和热。储存，包裹在铝箔中的无菌玻璃瓶。密封瓶的封口膜和存储在4°C。

如果愿意，您可以购买商业BD BBL米德尔的ADC或OADC与过氧化氢酶的富集。

1％的放线菌酮（100ml）中

• 1克放线菌酮
• 100 ML DDH _{2 O}

溶解和消毒用0.2微米的过滤器。存放于4℃注意:放线菌酮是有毒的，所以格外小心处理。

20％（体积/体积）吐温80（100毫升）

• 20毫升吐温80
• 80 ML DDH _{2 O}

另外，称量20克吐温80（约18.9毫升，密度1.06克/毫升），以制备20％w / v溶液。热到55°C，30分钟至完全溶解，混合。消毒液体，用0.2微米的过滤器。存储最终的溶液在室温下。

泰洛沙泊（100毫升）20％（体积/体积）的

• 20毫升四丁酚醛
• 80 ML DDH _{2 O}

或者，称重20克泰洛沙泊（约18.2毫升，密度1.1克/毫升），以制备20％w / v溶液。 30分钟，到二55°C的热解决方案ssolve，完全混合。消毒液体，用0.2微米的过滤器。存储最终的溶液在室温下。

注1:甘油股票M.结核制备使用下面的协议。

放养M.肺结核

• 成长M.在50毫升MADC 肺结核饱和度（OD ₆₀₀ = 1.5到2.0），在37℃下的振荡条件下（100转）。根据上的应变，这将花费7-14天。
• 附带样品在4℃以2,000 xg离心15分钟以沉淀文化。除去上清液。
• 重悬在无菌的50％甘油的6毫升。
• 分装1.5毫升到4康宁的低温瓶和标签适当。
• 立即闪光冻结于乙醇/干冰浴和存储的瓶在-80°C。

注2:接种菌株H37Rv（-80°C股票上涨1.5岁）为70毫升的MADC媒体产生的OD _{600 <}/ sub>的约0.6后5天的生长在37℃下在振荡条件下（100转），在一个伊诺40摇床。

注3:为了测试文化的污染，研究人员可以到标准营养丰富的培养基接种文化等分，并确认没有过夜培养后的增长。按常规，文化上都镀MADC琼脂相衬显微镜观察菌落形态和检查。如果需要，文化可以验证6110引物通过PCR方法。

2。代表性的成果

一个样品已做好充分准备，将产生一个如图2所示的NMR光谱相似。这个频谱是表示在M.肺结核野生型代谢池。所识别的代谢产物被直接或间接相关联的D-丙氨酸的通路。另外，峰强度的大小是代谢物的浓度成比例呈现的细胞提取物中。因此，在处理培养物，药物治疗，和突变株之间的峰强度的变化可以指示的代谢产物和代谢途径中的扰动。该M.结核 1D ¹ H NMR谱是在Bruker Avance 500兆赫光谱仪配备三重谐振，Z轴梯度冷冻探针收集。的频谱包含约。 400峰，它是可能的，以确定和量化40-50代谢产物，包括氨基酸，核苷酸前体，以及糖酵解和柠檬酸中间体的。一个BACS-120自动进样器与布鲁克图标软件用于自动NMR数据采集。 1D ^{1 H} NMR谱，收集使用激发雕刻⁴有效地除去溶剂，并保持平坦的基线，消除了任何需要收集基线可能引起工件在随后的主成分分析（PCA）或正交偏最小二乘判别分析（OPLS- DA）。 A 1D ¹ H NMR谱是在25℃下收集与5482.5 Hz和32K数据点的频谱宽度。总共有16个虚拟扫描和128扫描被用来以获得频谱。 ACD实验室1D NMR处理软件，用于半会自动处理所有1D ^{1 H-NMR}谱。光谱傅立叶变换，分阶段实施，并参照第三次会议的峰值（0.0 PPM）。 NMRpipe软件包用于单独处理2D的^{1 H-13 C} NMR光谱，并分析NMRDraw。布鲁克FID数据文件首先被转换为一个文件格式识别的NMRpipe格式和然后光谱进行傅立叶变换，相位校正，填充零。在一维的^{1 H} NMR谱和2D ^{1 H-13} C NMR谱中所观察到的NMR峰被分配到特定的代谢物，用^{1 H}和¹³ C化学位移分别为0.05和0.50 ppm时，公差，和麦迪逊代谢组学联合体数据库（MMCD ） ^{BioMagResBank，6}和人类代谢组数据库。具体来说，一维和二维NMR谱都是手工挑选的高峰，然后上传到人类代谢组数据库的核磁共振化学位移的峰值列表。人类代谢组数据库所确定的代谢物被分配基于两个最大化的数目匹配的NMR共振和属于代谢网络的NMR谱。每种化合物或代谢物通常有多个CH对和相应的多个NMR共振。因此，更多的这些核磁共振实验的NMR谱中所观察到的共振，就越有可能的代谢物是本。同样，识别多个代谢产物联营公司相同的途径的可能性增加了正确的任务。存在的代谢物和代谢途径进行了验证^。9 结核分枝杆菌的基因和基因组^（KEGG）8 MetaCyc数据库"京都百科全书smegmATIS是一个有用的模型系统，M.肺结核和其他分枝杆菌病原体。如其他地方，样品M.耻垢分枝杆菌也可能被超声破碎^。

图2。1D ^{1 H} NMR谱的结核分枝杆菌的细胞提取物。具有代表性的代谢产物的NMR峰标记。缩写如下:AMP，腺苷单磷酸，α-，α-酮戊二酸千克，谷氨酸，谷氨酸，丙氨酸和Ala。

讨论

一个相当多的研究分析，转录组和蛋白质组的配置文件的M.在体外和体内条件下各种肺结核 ^11-16最终，在基因表达和酶活性的变化导致在分子量小的分子的浓度的变化。的完整描述，这些化合物构成的代谢组。因此，药物和不同生长条件对代谢途径的影响可能其次是代谢组学分析^。17,18很少有研究利用这种方法，研究代谢途径中的M.结核 （见下文）和其他的分枝杆菌属，或分析与M.感染小鼠的代谢变化肺结核¹⁹

这种方法是一个潜在的陷阱，一些样品中的微生物可能无法完全溶解。如有必要，裂解步骤可以重复一个或两次以上。裂解效率可以通过执行一个标准的蛋白检测（ 例如 ，BioRad公司DC蛋白测定）监测。代谢物在低浓度存在为了增加检测的灵敏度，几个相同的样品（在步骤8收集的）可以被汇集，冷冻干燥，并重新悬浮在一个较低的体积。

替代分枝杆菌代谢组学研究中的样品制备过程进行...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备名称	公司	目录编号	评论
ADC富集	BD BBL米德尔	212352
BACS-120样品转换器	布鲁克
BRUKER AVANCE NMR	布鲁克		500 MHz的
牛血清白蛋白	Fisher Scientific则	BP1600-100	馏分V
离心分离	Beckman Coulter公司	Allegra的X-15R	台式
离心管	康宁	430291	50毫升无菌聚丙烯
低温瓶	康宁	430488	2.0毫升无菌聚丙烯
Cycloheximide	AG科学	C-1189	有毒的
D（+） - 葡萄糖	ACROS	41095-0010
氧化氘	Sigma Aldrich公司	617385
锥形烧瓶	VWR	89095-266	不育，平底，聚碳酸酯，0.22微米PTFE膜通风帽
闪霜瓶	VWR	82018-226	750毫升
冷冻干燥机	VWR	82019-038	4.5 L台式
甘油	GibcoBRL	15514-029
恒温箱	新不伦瑞克省	伊诺40	台式振动筛
裂解矩阵B	MP Biomedicals	6911-100
裂解机	MP Biomedicals	FastPrep-24
微型离心机	Eppendorf公司	5415D	台式
微型离心机	Beckman Coulter公司	微型离心22R	台式
米德尔7H9肉汤	Difco公司	271310
NMR管	诺莱尔	ST500-7	5mM的
OADC富集	BD BBL米德尔	212351
油酸	西格玛	O1008
磷酸氢二钾	VWR	BDH0266
磷酸二氢钾	VWR	BDH0268
- 转子的离心22R	Beckman Coulter公司	F241.5P	密封和聚丙烯
转子 - Allegra的X-15R	Beckman Coulter公司	SX4750	随着生物认证的封面
氯化钠	Fisher Scientific则	S271-3
钠 - 3 - 三甲基甲硅烷基丙-2 ,2,3,3-D4	剑桥同位素	DLM-48
分光光度计	Beckman Coulter公司	DU-530
分光光度计比色皿	生命线	LS-2410	1.5毫升聚苯乙烯，2明确双方
注射器	Becton Dickinson公司	309585	不育，3毫升鲁尔乐
针头式过滤器	的Nalgene	190-2520	0.2微米的无菌醋酸纤维素
吐温80	Fisher Scientific则	BP338-500