本文描述了一种ex vivo制备方法，用于分离最大的股薄肌阻力小动脉，以检测血管对血管活性刺激的反应，并通过被动管壁力学评估其基本结构特性。
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摘要
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分离的微血管制备是一种 离体 一种可用于研究调控血管直径进而影响灌注阻力的各类因素之不同作用的制备方法1-5这是一个经典的实验制备方法，很大程度上最初由 Uchida 描述。 等15 几十年前。这一最初的描述为相关技术奠定了基础，随后这些技术主要在弗吉尼亚大学Brian Duling博士的实验室中得到了广泛改进和优化。6-8，我们将在接下来的页面中介绍一种当前常用的方法。本实验方案将以大鼠的股薄肌小动脉作为微血管的典型示例，但该基本制备方法可轻松适用于跨物种的几乎所有其他组织或器官中分离出的血管。9-13机械性（即尺寸性）变化在离体微血管中可轻易评估，以响应多种生理学（如缺氧、血管内压力或剪切力）或药理学刺激，并可揭示完整生物系统中整合反应所包含的机制要素，尽管 离体，组织。该方法的意义在于，它能够简便地调控影响微血管直径整合调节的各种因素，同时还能控制来自其他多种来源的贡献，包括管内压力（肌源性）、自主神经支配、血流动力学（如剪切应力）、内皮依赖性或非依赖性刺激、激素以及实质组织的影响等。在适当的实验条件和明确的研究目标下，这种方法具有相对优势 体内 或 原位 组织/器官制备，难以便捷地调控更广泛的系统性变量。
该制备方法的主要局限性本质上源于其优势所在。根据定义，这些血管的行为是在许多对血管阻力调节起最重要作用的因素（包括神经、体液、代谢等）均已被去除的条件下进行研究的。因此，研究人员需谨慎，避免对利用该制备方法所获得的数据进行过度解读或外推。该制备方法另一个重要的关注点在于，很容易损伤内皮层或血管平滑肌等细胞成分，从而引入可变的误差来源。强烈建议研究人员在实验开始时以及在整个实验方案进行过程中定期采用适当的检测手段，以确保制备样本的质量。
方案
1. 实验前准备
- 实验前一日，使用适当尺寸的玻璃毛细管（可采用水平或垂直拉制仪）拉制成微吸管。尖端直径可根据所分离的血管进行调整，但通常使用50–150 μm的直径范围。随后在丁烷火焰上加热，将微吸管弯折成适用于微血管实验装置的合适构型。使用精细镊子手动折断微吸管尖端至目标血管所需的近似直径，并可根据具体应用需要将其研磨或抛光至合适形状。有关这些操作的详尽且出色的综述，可参考Davis et al.16。然后将两个微吸管相对安装至微血管腔室的吸管夹持器中，必须调整其方向，使尖端位于血管腔室内的同一垂直和水平平面上。
本文所用的微血管腔室（图1和图2）由威斯康星医学院生理学系的David Eick先生定制制造（http://www.phys.mcw.edu/ 和 www.eicktech.com）。然而，市面上也有多种其他构型的微血管腔室可供选择，其中Living Systems Instrumentation（http://www.livingsys.com/）和IonOptix（http://www.ionoptix.com/）开发的系统尤为常见。使用这些其他系统时，可能必须采用倒置显微镜而非传统的直立显微镜，尽管具体选择取决于实验和设备需求。对于需要荧光或共聚焦成像的实验方案，建议使用倒置显微镜。 - 配制生理盐溶液（PSS；如下所述），并确保其pH值调节至特定实验条件下的适当水平（通常为7.38–7.42，处于生理范围内）。PSS溶液可预先配制并冷藏保存，但在使用前必须在适当温度下检测pH值。若实验人员或特定实验方案有要求，PSS溶液中可添加白蛋白，但此步骤并非普遍必需。
- 用于测量血管直径的数字视频测径器应使用血细胞计数板或显微镜载物台微尺进行校准。为确保准确校准，必须将微尺置于与血管腔室中流入/流出微吸管相同的平面上。
- 应预先制备用于将微血管固定于吸管上的结扎环，并确保其便于后续使用。结扎环可由8-0或更细的眼科缝线制成。单个结扎环可提前制备，并在需要前存放于培养皿中，置于载玻片周围反向粘贴的小段胶带上并加盖保存（以防止丢失）。（图3）。
2. 实验当天
- 应开启所有辅助设备并检查其功能是否正常。包括防振/浮动台、循环加热水浴（设定温度以使浴槽内液体温度保持在适宜水平，通常为 37 °C）、所有压力传感器以及血管浴槽的排水泵（图 1A 和 1B）。开启血管浴槽以及灌流液和灌注液储液瓶中的平衡气体。
- 用 PSS 溶液填充所有储液瓶、管道和腔室。通向流入端移液管的灌流液管路必须完全充满，以避免管路中存在气泡，这些气泡可能脱落并损伤血管内皮（图 1C）。如有需要，可使用注射器轻轻推动 PSS 溶液完全通过移液管，确保其完全充满且无任何可能阻碍灌流液流动的堵塞。流入压力应保持在合理范围内，以避免损坏压力传感器。
3. 微血管采集
- 在获取微血管前，应先对供体动物进行麻醉，随后根据所研究血管系统的特性，采用最适宜的方法分离目标血管。在某些情况下，可能需要摘除器官本身（如脑部或冠状微血管），而在其他情况下，则可直接从麻醉动物体内取出血管（如肌肉组织中的血管）。图中展示了股薄肌内血管走向的一个示例。 图4. 估算血管的长度 体内 在使用镊子或小型卡尺移除前。在将血管从动物/器官上取下之前，进行最后一次检查以确保血管腔室已准备就绪并正常运行（包括所有结扎环均已就位）会非常有帮助。
- 用精细镊子夹住血管一端的外侧，从动物或器官上取下血管，沿血管长轴剪开，直至完全游离，操作过程中需格外小心，避免对血管产生任何牵拉。游离后立即将其放入盛有PSS的1.7 mL离心管中，但不要松开镊子，以保持血管原有方向，确保灌注时灌流液在浴槽中的流动方向与动物体内血流方向一致。
4. 血管插管
- 将血管置于盛满液体的浴槽中，并将近端套接到流入端移液管上。此操作最好在导管内维持适度的灌注压力（约50 mmHg）的情况下进行，同时使用一对精细镊子夹住血管近端管腔壁的两侧（即每只手各持一把镊子）。在本实验室中，我们使用来自Fine Science Tools的精细镊子。http://www.finescience.com/Home.aspx），尽管任何结构合适的镊子均可有效使用。将血管套入套管尖端，并沿尖端推进血管，直至可使用两根结扎线固定血管为止。
- 将灌注压力升高至约75 mmHg，以进一步扩张血管并便于在远端移液管尖端进行插管。通过血管的灌注可在血管远端流出处的灌流液储液池中观察到液体的形变（在显微镜下）。将血管远端插管至流出端移液管，并用两个结扎环固定（这两个最终的结扎环必须在插管前预先就位）； 图5).
- 调整套管针至所需的 XYZ 坐标，直至血管变形最小，且血管接近 体内 长度。升高流入压，直至接近该血管段通常所承受的平均动脉压的百分比（本实验室对股薄肌的大阻力小动脉采用平均动脉压的80%）8).
- 将一个小型曝气石（可提供适当气体混合物）放入浴液中，并在灌流 chamber 上覆盖塑料薄膜或玻璃盖，以防止液体溅到显微镜镜头。我们使用的曝气石在普通宠物店或水族用品店均可购得，直径约为 1 cm，但更小尺寸的同样有效。曝气石的存在可确保血管始终获得充足的气体供应，从而延长血管的存活时间。在所有测量期间，应移除曝气石（或暂时中断通过曝气石的气流），以避免图像失真。松开流出端移液管上的夹子，使液体流经血管 30 分钟。应定期夹闭流出端管道，以判断血管是否正在建立静息张力。此时必须检查所有血管是否存在压力泄漏。通过向血管内施加已知压力（通常为 100–120 mmHg），随后夹闭流出端和流入端管道，若管腔内压力保持稳定，则表明无明显泄漏；若压力开始下降，则存在显著泄漏，必须予以封闭。流入端或流出端移液管处的泄漏通常可通过在移液管上血管周围增加一个结扎环来修复。 alternatively，若血管存在小的侧支导致泄漏，则会影响血管有效维持压力的能力，并可能引入额外误差来源。一旦发现此类泄漏，通常可用 10-0 眼科缝线单圈结扎封闭。 alternatively，使用从 6-0 缝线中分离出的单股纤维制作结扎环也同样高效。若无法定位泄漏点或无法有效结扎（例如侧支无主干，仅为血管壁上的孔洞），则可能导致实验提前终止，需更换其他血管（通常选用动物对侧肢体——必要时为对侧——的相同血管）。
应让血管在无灌流条件下平衡至少30分钟。所有实验均在无灌流条件下进行。当血管已形成满意的张力，并符合该实验的纳入标准时，即可用于后续研究。
这些纳入标准可能因具体的实验方案和研究者而异。在我们的实验室中，通常采用以下标准：- 主动语调 >30%（计算方式为 ΔD/D）最大 x 100，其中 ΔD 是指小动脉内壁直径在平衡压力基础上暴露于 Ca 后的增加值2+无 PSS 和 D最大值 是在 Ca 的平衡压力下测得的最大直径2+无PSS的
- 以肌源性激活（即腔内压力升高时，微动脉直径维持不变或更优地出现减小）作为血管平滑肌层功能完好的指标。
- 具有活性的内皮细胞层，可通过乙酰胆碱（10-6 浴液中的 M）。
- 可根据具体实验方案的需要增加其他纳入标准，包括对肾上腺素能激动剂（如苯肾上腺素，10-7 M），对其他刺激物（如腺苷（10-5 M）或缺氧（0% O₂条件下的降低）2 在平衡气体中）。
- 以下部分是一个“模拟实验”的示例。所有所需溶液均按要求配制，并注意计算血管腔室内生理盐溶液（PSS）的稀释因子。例如，对于部分实验设备，血管腔室的容积为20 ml。因此， 20 μl 10 的-2 M 储备液得到的有效浓度为 10-5 将血管置于含 M 溶液的浴槽中。在完成上述的血管取出、套管插入、平衡及验证步骤后，实验即可开始。具体细节（如处理分组的随机化及有效性）因实验而异，详细描述将占用过多篇幅，因此此处不作详述。
初始对照反应的测定。以肌源性激活（压力诱导的血管收缩）这一生理刺激为例，将管腔内压力在目标范围内随机改变，并给予血管足够的反应时间（本实验中为5-7分钟）。以乙酰胆碱刺激为例的药理学刺激，则按照随机顺序从储备液中将药物加入浴槽后方。本实验中，通常采用的浓度范围为10⁻⁹ M至10⁻⁴ M。-9 至 10-5 浴液中乙酰胆碱的浓度通常为 M，冲洗效果的定义为平衡直径的恢复。由于乙酰胆碱是一种作用迅速的试剂，仅需数秒即可达到最大舒张反应。而其他试剂（如肽类）则需要更长时间才能引发最大反应，因此必须充分考虑达到最大反应所需的时间以及有效冲洗所需的时间。在获取对照反应数据后，可对系统施加特定干预措施，包括将血管与受体激动剂/拮抗剂、作用于特定离子通道的试剂共同孵育，改变管腔内压力，调整平衡气体成分，或使用靶向特定酶系统的药理学试剂等，以上仅为最常见的干预方式举例。
在干预措施达到预期作用时间后（该时间应经过适当验证），可开始下一轮数据采集。根据具体的实验方案，可对血管施加后续干预措施，或移除首次干预（可行时通过洗脱，或简单地撤除生理刺激）。待血管恢复至平衡状态后（应予以确认），可根据需要施加进一步的干预措施，并继续收集数据。该通用流程将持续进行，直至实验结束，或血管制备质量下降至先前设定的阈值标准以下（例如对激动剂的反应能力或产生足够主动张力的能力）。此时，实验可宣告结束；或者研究者也可选择采集与离体血管反应性无关的数据（例如血管壁力学特性，此类检测可采用与肌源性激活相同的实验流程，仅需使用完全无主动张力的血管即可）。14). - 定期清洁所有设备对于去除盐分沉积以及防止任何不需要的生物体生长至关重要。每次实验结束后，至少应使用大量蒸馏水或去离子水彻底冲洗所有管路和腔室，并使其完全干燥。每使用2-3天后，还需用乙醇清洗一次，并让设备完全干燥。每周连续使用结束后，所有管路和腔室均需注入0.1 M盐酸，静置“孵育”30分钟，然后如上所述用大量水彻底冲洗。最后，在连续使用2-3周后，所有管路段均应更换为新的，腔室和储液槽则用1.0 M HCl清洗，随后用蒸馏水或去离子水进行充分冲洗。若发现管路出现变色，或在管路、腔室/储液槽任何部件中出现可见的生物生长，应视情况予以更换或彻底清洁。通过定期清洁和常规维护，设备可长期使用。撰写本文时，我们的血管腔室均已使用超过8年th 或 9th 常规使用一年以来，我们未遇到任何显著困难。
5. 代表性结果
图1A. 本图展示了基本的微血管实验站设置。A = 用于观察血管的电视机；B = 数字卡尺；C = 注射器，用于在需要时推动灌流液通过进液移液管；D = 静水柱，用于调节灌流液入口压力；E = 显微镜；F = 微血管腔室；G = 灌流液储液罐；H = 压力监测仪（可根据需要添加多个）；I = 微血管腔室灌流液排水泵；J = 平衡气体混合气罐；K = 废液容器（用于收集灌流液）；L = 循环水加热器；M = 抗振/浮动台。
图1B. 本图展示了微血管腔室装置的更详细视图。图中，E = 显微镜；F = 微血管腔室；H = 压力监测器（为简化起见仅显示一个，但可根据需要在不同位置添加多个）；I = 微血管腔室排水泵；N = 连接至灌流液流入微管起始端的管路（自图1A中“D”处延续而来）；O = 连接至灌流液流出微管的管路。
图1C. 本图展示了微血管腔室的最接近视图。图中，N = 灌注液管路（即直接连接至灌注液流入移液管的管道）；O = 直接连接至灌注液流出移液管的管道；P = 流入移液管的水平与垂直位置控制装置；Q = 水浴的灌流液排出管（连接至图1A和图1B中的“I”）；R = 来自储液器的水浴流入管（连接至图1A中的“G”）。
图 2. 本图展示了系统中流体和气体流动的示意图。图中，A = PSS灌流液进液管路；B = 通向进液移液管的PSS灌流液管路；C = 从浴槽排出至废液容器的PSS灌流液；D = 从出液移液管排出的PSS灌流液；E = 加热水进入腔室夹套的入口；F = 加热水从腔室夹套流出的出口。
图3. 本图展示了用于我们实验准备的单个结扎环，由眼科缝线制成（通过解剖显微镜观察，目镜放大倍数为10倍，变焦放大倍数可调至4.5倍；图A），以及将多个8-0和10-0缝线结扎环缠绕在倒置的胶带上的储存方式，胶带固定于载玻片周围，并将载玻片置于加盖的培养皿中保存（以防丢失；图B）。
图 4. 本图显示了股薄肌阻力小动脉在手术分离和切除前通过标准解剖显微镜观察的图像，以提供适当的空间方位参考。
图 5. 本图展示了一个插管微血管的代表性图像。图 A 显示了血管的全长，包括流入端（A）和流出端（B）移液管，以及结扎环（C）。图 B 为高倍放大图像，清晰显示了使用数字卡尺测定小动脉内径的过程（本例中直径为 112 μm）。
图6. 本图展示了平衡后套管化微血管的代表性图像。上方图像为微血管在平衡压力下处于对照、未刺激状态时的图像，中间图像为同一血管经乙酰胆碱（浴液中浓度为10-6 M）刺激后发生舒张的图像，下方图像为该血管经去氧肾上腺素（浴液中浓度为10-7 M）刺激后发生收缩的图像。
图 7. 本图总结了离体微血管在以下刺激条件下的反应：低氧（图 A，本系统中灌流液和灌注液的 PO2 从约 135 mmHg 降至约 40 mmHg）、乙酰胆碱浓度梯度增加（图 B）、在对照条件下以及血管经无钙 PSS 孵育后血管内压力的变化（图 C）。
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讨论
本文所述方案介绍了骨骼肌微血管的分离、摘除和双重套管技术，尽管该通用技术可 readily 应用于大多数组织。在本论文中，作者使用“微动脉”一词来描述一种在静息活性张力状态下直径介于 70–120 μm 的阻力血管，这种血管也是调节器官或组织灌注阻力的主要因素。
经过一些改进后，该系统可适用于特定研究者的多种应用，并可轻松整合其他技术，以开展更深入的实验（例如，使用跨膜电极测定膜电位17）。基本制备中的关键步骤始终是确保用于插管血管的流入和流出移液管匹配良好、保持通畅，并能方便地维持灌注流量和压力。当移液管被微小碎屑堵塞时，可能需要折断管尖极小部分以恢复液体流动。如果操作谨慎，移液管可重复使用多次，直至其无法再通或管径过大，导致血管插管变得极为困难。然而，通过熟练掌握该手术与实验制备技术，细致关注操作细节，并根据特定条件和需求进行适当调整，研究者可轻松评估在多种生理和药理刺激下决定血管反应性的各种通路。该制备方法还可使研究者在无主动张力条件下对血管壁力学性质的改变进行基础分析14。这确实是一项非常强大且具有高度适应性的技术，可广泛应用于从...
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致谢
本工作得到美国心脏协会（EIA 0740129N）和美国国立卫生研究院 T32 HL90610 项目的资助。
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参考文献
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重印与许可
