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使用X射线计算机断层扫描对小鼠肥胖模型中的脂肪体积进行分割与测量

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DOI：

10.3791/3680

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2012年4月4日

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1Carestream Molecular Imaging , 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame , 3Freimann Life Science Center, University of Notre Dame , 4Research and Development, Oncovision, GEM-Imaging S.A.

本文内容

摘要

在利用小鼠肥胖模型的研究中，脂肪含量分析是常规操作。小型动物CT成像与分析的新兴方法为纵向、详尽的脂肪含量分析提供了可能。本文将逐步详细介绍进行小型动物CT成像、分析及可视化的方法流程。

摘要

肥胖与发病率和死亡率升高以及生活质量指标下降相关。1 肥胖与环境和遗传因素均有关联，但目前导致该疾病的精确潜在机制仍在阐明之中。2,3 已开发出多种小型动物肥胖模型，并被应用于各类研究中。4 这些实验的关键环节包括在不同条件下采集动物局部和/或整体脂肪含量数据。

用于测量肥胖症小型动物模型脂肪含量的传统实验方法包括侵入性方法（例如 离体 脂肪沉积的测量）和非侵入性方法（如双能X射线吸收测定法（DEXA）或磁共振成像（MR）），每种方法均有其相对的优缺点。目前的侵入性脂肪含量测量方法可提供器官和特定区域脂肪分布的详细信息，但需牺牲实验动物，因而无法进行纵向评估。相反，现有的非侵入性策略虽能实现有价值的纵向监测，但在器官和区域特异性脂肪分布的细节方面存在局限。随着专用的小动物X射线计算机断层扫描（CT）系统的出现以及定制化分析流程的发展，有望同时实现脂肪分布的器官与区域特异性分析以及纵向动态监测。近期已有研究报告验证了CT在 体内 活体小鼠脂肪分布的纵向成像5,6 本文提供了一种改进的方法，可利用Carestream Molecular Imaging Albira CT系统结合PMOD和Volview软件，实现脂肪/总体积的测量、分析与可视化。

方案

1. 动物

  1. 以下报告的结果中，三只 C57BL/6J 小鼠和四只 B6.V-Lepob/J 小鼠购自杰克逊实验室（Jackson Laboratories，美国缅因州巴港）。B6.V-Lepob/J 小鼠是最早的肥胖模型之一，至今仍被广泛研究。B6.V-Lepob/J 小鼠表现出脂肪细胞大小和数量增加的表型，体重可达野生型小鼠的三倍。7,8 本研究中，采用 B6.V-Lepob/J 小鼠作为肥胖表型的阳性对照，以验证 Albira CT 系统用于基于 CT 的脂肪含量测量的可行性。
  2. 在动物达到约 12 周龄时进行成像。（B6.V-Lepob/J 小鼠在 4 周龄后即表现出肥胖表型）。
  3. 小鼠通过异氟烷（2.5% 流速）麻醉，并通过鼻罩系统维持 2.5% 异氟烷浓度进行成像。将动物俯卧于 Albira 成像系统配套的标准大鼠床（M2M Imaging Inc.，俄亥俄州克利夫兰）中，四肢置于躯干两侧，以确保 CT 采集的均匀性。
  4. 完成图像采集后，将小鼠从鼻罩中取出，并放回恢复笼中，直至恢复自主活动。

2. 图像采集与重建

  1. 使用 Albira CT 系统（Carestream Molecular Imaging，Woodbridge，CT）进行图像采集。通过异氟烷（2.5% 流速）对小鼠进行麻醉，并在成像过程中通过鼻罩装置维持 2.5% 的麻醉浓度。采集时扫描范围为 115 mm 长的床板，共采集 600 个投影图像。X 射线源设置为 200 μA 电流和 45 kVp 电压，并使用 0.5 mm 铝滤片对射线束进行硬化处理。
  2. CT 参数下的近似深部辐射剂量当量为 220 mSv，浅表剂量当量为 357.4 mSv。这些剂量低于文献报道的 LD50 值的二十分之一以上。9
  3. 图像通过 Albira Suite 5.0 重建软件使用 FBP（滤波反投影）算法，并采用“标准”参数进行重建。该组合的采集与重建参数可生成最终分辨率为 125 μm 各向同性体素的图像，足以满足整体动物分析的需求。对于特定区域的详细分析，可选择重建为 35 μm 各向同性体素，以获得 90 μm 的最终分辨率。

3. 图像分析

使用 PMOD（PMOD Technologies LTD，苏黎世，瑞士）分析软件进行图像分析。在 PMOD 中根据组织密度对图像进行分割——首先分割总体积，然后分割脂肪体积。

3.1 为降低计算需求，图像可被缩小以用于分析。

  1. 要进行缩减，请导航至主 视图 选项卡。
  2. 选择 工具 > 缩减。
  3. 选择 X 缩减为 2、Y 缩减为 2 和 Z 缩减为 2。
  4. 勾选 替换。
  5. 选择 运行。

当缩减完成后，会显示消息：“边界框将发生变化”。

3.2 可对图像进行掩膜处理，以消除床体和鼻锥部分，以便后续进行感兴趣体积（VOI）分析。

  1. 进行掩膜操作时，导航至 Planes, Layouts, Rotations, Mirror, 3D Markers > Planes & Layouts。
  2. 选择 Show plane Z。
  3. 在 Z 平面中滚动至鼻锥位置。
  4. 选择主 VOI 选项卡 > Draw vertices。
  5. 在动物鼻部周围绘制感兴趣区域（ROI），排除床板和鼻锥部分。
  6. 选择 Copy Actual ROI。
  7. 移至下一个切片，并通过鼻部相关平面粘贴 ROI from buffer。
  8. 使用 Edit Group of Vertices 根据需要调整 ROI。
  9. 在鼻锥之后的第一个平面处，选择 Delete ROI。
  10. 生成一个新的 VOI，以包含鼻锥之后第一个平面处的动物躯干周径（排除动物床板）。
  11. 导航至 VOI Tools > Masking & Algebra。
  12. 在提供的对话框中输入 -1000。
  13. 选择 Mask voxels outside the selected VOIs 按钮。

显示消息：“不可逆的数据操作。您要继续吗？”

  1. 选择 是。
  2. 导航至 平面、布局、旋转、镜像、3D 标记 > 平面与布局。
  3. 选择 显示所有平面。
  4. 检查感兴趣体积（VOI）的完整性。
  5. 选择 保存。
  6. 另存为 Analyze 格式。
  7. 更改文件名前缀。

3.3 首先，对图像进行分割以获取整个动物的体积：

  1. 选择 工具 > 外部。
  2. 选中 分割 复选框。
  3. 输入密度范围 -300 至 +3500（参考腹部脂肪区域的密度范围）。
  4. 选择 运行分割。
  5. 检查分割结果的完整性。
  6. 选择 确定。
  7. 选择 移除 ROI。
  8. 选择 VOI 统计。

报告的统计数据代表总体积。

  1. 记录报告的体积。

3.4 接下来，对图像进行分割以获取脂肪体积：

  1. 返回非分割的掩膜图像以进行脂肪体积分割。
  2. 为加载已保存的 Masked 数据文件，在 Load 窗口中勾选 Analyze 选项。
  3. 选择 Tools > External。
  4. 勾选 Segmentation 复选框。
  5. 输入范围为 -200 至 -50。
  6. 选择 Run Segmentation。
  7. 检查分割结果的完整性。
  8. 选择 OK。
  9. 选择 VOI statistics。

所报告的统计量代表脂肪体积。

  1. 记录报告的体积。
  2. 选择 保存。
  3. 另存为 分析。
  4. 更改文件名前缀。

可选：如果皮肤/外周密度仍然存在，可执行下方的“侵蚀与膨胀”方案，以消除这些区域，便于进行感兴趣容积（VOI）分析。

  1. 选择 工具 > 外部。
  2. 选中 形态学 复选框。将显示 形态学 视图。
  3. 选择 腐蚀。
  4. 选择 确定。
  5. 选择 工具 > 外部。
  6. 选中 形态学 复选框。将显示 形态学 视图。
  7. 选择 膨胀。
  8. 选择 确定。

4. CT 图像的可视化

4.1 使用 VolView v3.2（Kitware，Clifton Park，NY，USA）创建分割图像的渲染三维可视化显示。

  1. 以 Analyze 格式打开 CT 数据集。
  2. 在弹出窗口中使用默认设置。
  3. 打开插件菜单。
  4. 在 Utility 下选择 Merge volumes。
  5. 取消勾选 Rescale Components。
  6. 点击 Assign Second Input。
  7. 为第二个输入选择已分割的脂肪数据。
  8. 在弹出窗口中使用默认设置。
  9. 点击 Apply plug-in。
  10. 双击 Volume view window 以获得更清晰的小鼠主体视图。

4.2 返回到 颜色/不透明度选项卡。组件下拉框用于指定当前正在编辑的数据集。该选项卡底部有两个滑块，用于通过 0 至 1 的数值调节各组件数据集在叠加图像中的相对亮度。对于组件 1（即 CT 数据），我们倾向于使用灰度颜色方案。如需更改颜色：

  1. 在标量颜色映射部分，双击其中一个颜色滑块。
  2. 要移除滑块，请将其拖出框外。
  3. 要添加新滑块，请在滑块区域内任意位置点击。
  4. 移除其中一个滑块。
  5. 将左侧颜色滑块设置为黑色（标量值(S) = -19000）。
  6. 将右侧颜色滑块设置为白色（(S) = 15000）。
  7. 在标量不透明度映射框中，通过在框内单击创建一个新点，使窗口中总共出现三个点。
  8. 对于中间的点，将(S)值更改为~-3000，不透明度(O)值更改为0。
  9. 选择窗口右侧的第三个点。
  10. 将(S)值更改为约32000，O值更改为.25。
  11. 第一个点可位于左侧任意位置，只要将不透明度Opacity值设为0即可。
  12. 切换至组分二，以调整脂肪的显示效果。
  13. 通过双击并左移色相(H)滑块，将每个颜色滑块均设置为红色，从而将脂肪伪彩色映射为红色。除此之外，几乎无需其他调整即可获得理想的脂肪显示效果。

4.3 创建一个三面板旋转动画，显示 CT、脂肪和叠加图像：

  1. 点击并将实验小鼠拖动至直立位置，使其背部朝向您。
  2. 在成分权重下，将成分二的值设为0，以仅显示CT扫描图像。
  3. 点击查看 > 相机。
  4. 选择用于生成旋转动画的帧数（在当前案例中，我们选择“36”）。
  5. 将X轴旋转值更改为360度。
  6. 选择创建。
  7. 在弹出的对话框中，创建一个名为CT的新文件夹，并以tiff格式保存文件，这将输出一系列旋转图像。
  8. 对脂肪图像以及叠加的脂肪/CT图像重复此步骤，每次将其保存到单独的文件夹中。

4.4 使用 ImageJ v 1.43u 对 VolView 输出图像生成旋转动画文件。

  1. 在 ImageJ 中，选择 文件 > 导入 > 图像序列。
  2. 选择 CT 文件夹中的第一张图像。软件将自动检测其余文件，并将其作为图像栈打开。
  3. 重复此操作以打开脂肪和叠加序列。
  4. 在 分析 > 工具 > ROI 管理器 中打开 ROI 管理器。
  5. 在目标小鼠周围绘制一个 ROI，排除不必要的背景像素。
  6. 在 ROI 管理器 中，点击 添加 以加入该 ROI。
  7. 选择另一个图像序列。
  8. 在 ROI 管理器 中，点击该 ROI 将其应用到图像上。通过这种方式，所有裁剪后的图像栈将完全对齐。
  9. 当 ROI 已应用于所有图像栈后，在 ROI 区域内单击右键。
  10. 选择 复制。
  11. 选择 勾选复制栈选项框，以将 ROI 区域从图像其余部分分离出来。
  12. 关闭较大的图像栈。
  13. 对全部三个图像序列重复此操作。
  14. 转至 图像 > 栈 > 工具 > 合并，将各图像栈合并。
  15. 为 栈 1 选择 CT。
  16. 为 栈 2 选择 脂肪。
  17. 再次操作，为 栈 1 选择 合并的栈，为 栈 2 选择 叠加。
  18. 现在将生成一个三面板图像旋转栈，可通过点击图像窗口左下角的 播放 按钮进行预览。
  19. 若要将视频保存为 AVI 格式，请选择 文件 > 另存为… > AVI…。
  20. 点击 保存。

5. 典型结果

此处报告了三只野生型（C57BL/6J）小鼠和四只肥胖型（B6.V-Lepob/J）小鼠的结果，作为采用Albira CT系统进行脂肪/总体积比测量的代表性示例。图1 下方展示了使用VolView v3.2对肥胖小鼠CT图像进行分割（即 总体积和脂肪体积）所生成的代表性图像。

用于生物医学研究的小鼠解剖结构及示踪剂分布的X射线和荧光断层成像图像。
图 1. 脂肪分割的代表性CT图像。（A）肥胖小鼠（B6.V-Lepob/J）CT总体积（灰度），（B）脂肪体积（红色），以及（C）图像融合。（D）野生型小鼠（C57BL/6J）CT总体积（灰度），（E）脂肪体积（红色），以及（F）图像融合。

每只野生型小鼠和每只肥胖小鼠的总体积、脂肪体积以及计算得到的脂肪/总体积比例如下表1所示。野生型组和肥胖组的平均脂肪/总体积比率分别为0.09和0.42（图2）。野生型小鼠与肥胖小鼠之间的脂肪/总体积比率差异具有显著性（p = 0.001）。

野生型 (C57BL/6J)总体积 (cm3)脂肪体积 (cm3)脂肪/总体积比值肥胖型 (B6.V-Lepob/) 总体积 (cm3)脂肪体积 (cm3)脂肪/总体积比值
动物 128.793.000.10动物 166.2526.750.40
动物 233.253.050.09动物 261.1526.310.43
动物 330.302.630.09动物 364.1925.70.40
    动物 454.2523.780.44

表1. 野生型小鼠与肥胖小鼠的总体积、脂肪体积及脂肪体积/总体积比值。 总体积和脂肪体积是通过PMOD VOI分析对分割图像进行计算得出的。

WT小鼠与肥胖小鼠脂肪/总体积比的柱状图（统计分析结果）
图2. WT小鼠与肥胖小鼠的平均脂肪/总体积比。 显示的WT（C57BL/6J）和肥胖（B6.V-Lepob/J）小鼠的平均脂肪/总体积比分别为0.09和0.42。（误差条表示单个标准差）。WT与肥胖小鼠的脂肪/总体积比差异具有显著性（p值 = 0.001）。

讨论

本研究利用 B6.V-Lepob/J 小鼠，展示了在小型动物模型中使用 Albira CT 系统进行脂肪含量测量的可行性。这些测量结果在组内和组间比较中均符合预期。首先，本文提供的代表性结果表明，采用这些方法对野生型（WT）和肥胖型小鼠组进行脂肪/总体积比值的测量时，组内变异程度较小。其次，野生型小鼠与肥胖型小鼠的脂肪/总体积比值存在显著差异。最后，通过与既往报道的野生型与 B6.V-Lepob/J 小鼠相对总脂肪质量及体脂百分比数据的比较（未展示），我们测得的野生型与 B6.V-Lepob/J 小鼠脂肪/总体积比值处于预期范围内7, 8。

此处详述的方法可应用于其他模型和/或研究目标，或根据需要进行调整。为实现特定目标，可能需要修改重建参数。例如，Judex et al.（2010）报道称，某些区域特异性分析需要分辨率达到 50 μm 的图像。在 Albira 5.0 Suite Reconstructor 中，可使用“HR”重建选项选择图像中 1 cm 的各向同性体积进行 35 μm 的重建。一旦 Albira CT 系统被用于特定区域和器官的脂肪含量测量，即可充分发挥基于 CT 的脂肪含量分析的优势（即同时实现特定区域和器官的脂肪体积测量以及纵向测量）。

结论：

本文提供了一种利用X射线CT成像技术对活体小鼠脂肪含量进行测量的详细分步方法。我们使用Albira成像系统获取CT数据集，并采用PMOD软件套件进行后续的分割与分析。最后，我们提供了相关操作指南，以实现对整只动物体内脂肪组织分布的便捷三维渲染与可视化。

披露

Todd A. Sasser、Shengting Li、Sean P. Orton 和 Seth T. Gammon 是 Carestream Molecular Imaging 的员工。Carlos Correcher 是 Oncovision, Gem-Imaging S.A. 的员工。W. Matthew Leevy 是 Carestream Molecular Imaging 的顾问。

致谢

我们衷心感谢圣母大学综合成像中心（NDIIF）和锐珂医疗为本项目提供的资金支持。

参考文献

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