介绍将惠普DeskJet 500打印机改装为生物打印机所采用的方法。该打印机能够处理活细胞，并在细胞膜上产生瞬时孔隙。这些孔隙可用于将小分子（包括荧光标记的G-肌动蛋白）导入被打印的细胞中。
本文内容
摘要
摘要
生物打印具有广泛的应用与重要意义，包括组织工程、直接细胞应用治疗以及生物传感器的微加工1-10。最近，热喷墨打印技术也被用于基因转染8,9。研究表明，热喷墨打印过程可暂时破坏细胞膜，但不影响细胞活力。细胞膜上产生的瞬时孔隙可用于将原本因体积过大而无法穿过膜的分子导入细胞质中8,9,11。
此处演示的应用是利用热喷墨打印技术将荧光标记的G-肌动蛋白单体导入细胞。采用热喷墨打印技术向细胞内注入分子的优势在于该方法对细胞的损伤相对较小。8, 12 研究表明，打印后的细胞存活率与标准的细胞接种方法相当1,8。此外，喷墨打印可在数分钟内处理数千个细胞，远快于人工显微注射。打印所形成的孔隙通常在约两小时内闭合。然而，该打印技术所形成的孔隙尺寸有限（约10 nm），因此仅适用于向细胞内递送小分子蛋白和/或颗粒。8,9,11
对一台标准的 HP DeskJet 500 打印机进行改装，以实现细胞打印。3, 5, 8 拆除打印机外壳，并通过机械杠杆绕过纸张进纸机构。构建了一个载物台，用于在打印头正下方直接放置显微镜载玻片和盖玻片。打开墨盒，清除其中的墨水，并在使用前清洗干净，以便用于装载细胞。打印图案通过标准绘图软件设计，再通过简单的打印指令控制打印机完成操作。将 3T3 成纤维细胞培养至融合状态，经胰蛋白酶消化后，重悬于磷酸盐缓冲液中，并加入可溶性荧光标记的 G-肌动蛋白单体。将细胞悬液用移液器加入墨盒中，然后将细胞打印成线状沉积在玻璃盖玻片上。利用荧光显微镜对活细胞进行成像，结果显示肌动蛋白遍布整个细胞质。将荧光标记的肌动蛋白引入细胞，可实现对短时间尺度下细胞骨架动态变化的成像，适用于多种研究应用。13-15
方案
1. 改装 HP DeskJet 500 打印机
需要注意的是，该技术应适用于许多市面上常见的喷墨打印机。然而，较旧型号的打印机通常效果更好，因为它们使用的墨盒喷嘴直径较大，不易堵塞。此外，旧款打印机通常采用机械式进纸传感器，更容易绕过。带有光学传感器的打印机也可以通过在每次打印周期时于打印机远端边缘放置一小条纸张来欺骗传感器，但相比机械系统更难“欺骗”。目前市面上可用的、效果最好的打印机通常分辨率（DPI）较低。
分辨率较高的打印机更容易发生堵塞。HP Deskjet 500 的分辨率为 300 DPI。目前市面上有许多可用的打印机（如 HP Deskjet 系列及其他品牌）分辨率为 600 DPI。此类打印机仅需稍加注意喷嘴堵塞问题，通过仔细清洗（第 3 节）即可有效缓解。
- 通过从打印机底部基座上解锁几个塑料卡扣，缓慢抬起并取下打印机的上部塑料外壳。
- 将按钮/显示灯面板从打印机顶部拆下，但保持其与打印机主板的连接。
- 清洁打印机内部，特别是墨盒放置区域以及打印作业发生的位置。
- 找到为进纸机构供电的电缆，并将其从主板上拔下。
- 在 HP DeskJet 500 中，这些电缆位于前部左侧的纸盒下方。
- 找到纸张检测机构。通过固定一根绳子或金属丝环，作为手动拉手，以绕过该机构。
- 在 HP DeskJet 500 中，纸张检测机构是一个位于打印/进纸机构上方和后方的灰色塑料杠杆。
- 在进纸机构前方创建一个平台（纸张原本从此处进入并被输出），以便将所需打印的载玻片调整至略低于墨盒喷头的位置。
- 在我们的实验中，使用了15 mL离心管的泡沫运输支架，并在打印区域用胶带固定若干显微镜载玻片，以使载玻片最终高度达到所需水平。
- 为维持无菌操作技术，可将打印机置于标准生物安全柜或台式层流罩内。
- 需要注意的是，对商用喷墨打印机进行改装通常会导致制造商保修失效。
2. 转换原装HP墨盒（HP 26黑色墨盒）
- 从包装中取出墨盒，暂时保留覆盖在打印机触点和打印头上的保护胶带。
- 使用夹具或台钳固定墨盒本体（黑色部分），也可用手牢固握住墨盒（通常效果同样良好），确保绿色顶部不被任何障碍物遮挡。
- 使用钳子或可调扳手夹住墨盒的绿色顶部，来回旋转数次，直至其松动脱落。
- 此步骤无需施加很大力量，但由于顶部不再需要，即使拆卸时发生断裂也无妨。
- 使用螺丝刀撬下现已暴露的透明塑料部件。
- 同样，此步骤无需大力，且该部件不再需要，因此拆卸过程中断裂亦可接受。
- 清空储液腔内残留的液体。
- 移除覆盖在打印机触点和打印头上的塑料保护胶带。
- 用水彻底冲洗储液腔。
- 使用移液器或注射器将水推过内部通道。
- 冲洗过程中水可能会从打印头泄漏，此现象可接受，不会影响墨盒功能。
- 当流出的水变澄清后，让墨盒自然晾干。
3. 清洁墨盒
- 为了保持清洁的打印环境，应在使用前后清洗墨盒。
- 这也有助于避免盐类及其他生物材料在墨盒中结晶，从而防止堵塞。
- 将墨盒完全浸入盛有去离子水的烧杯中，在打印前后各超声处理15分钟。
- 超声处理后，将墨盒从水中取出，并甩去多余的水分。
- 向墨盒内喷入70%乙醇，以创造更无菌的环境。
- 确保乙醇完全干燥后再加入生物墨水打印溶液。
4. 制备细胞悬液——“生物墨水”
- 培养细胞至可传代状态。
- 对于3T3成纤维细胞：在T-75培养瓶中以约1.3×104 cells/cm2的密度接种细胞，使用含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5% CO2培养箱中培养两天。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）配制浓度为50 μg/ml的荧光标记G-肌动蛋白储备液。
- 进行细胞传代。
- 对于3T3成纤维细胞：弃去培养瓶中的培养基，用PBS冲洗两次。加入5 ml 0.25%胰蛋白酶+EDTA覆盖细胞，于37 °C孵育5分钟。
- 加入5 ml新鲜培养基，吹打混匀后将细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中，以1000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
- 用含荧光标记G-肌动蛋白储备液的PBS重悬细胞，制备生物墨水。
- 生物墨水终浓度应为G-肌动蛋白10 μg/ml，细胞浓度为1×105 cells/ml。该浓度已优化，可限制每滴中的细胞数量并防止打印头堵塞。8
- 注意：250 μl生物墨水可按照图2所示图案打印三张盖玻片。
5. 生物打印
- 打开电源，让打印机预热。
- 将所需的打印表面（此处使用 22 mm × 22 mm 盖玻片）放置在步骤 1.6 中准备好的载物台中心。
- 创建打印图案文件。
- 打开 Microsoft Word（或其他绘图软件），绘制所需的图案。
- 从预先制作的文件中选择适合细胞打印的图案。
- 将含有目标细胞悬液的制备好的墨盒装入打印机。
- 用移液器将悬液加入墨盒腔底部的小圆形孔中，使用约 100–120 μl 溶液。打印液滴体积约为 130 皮升。8
- 使用 HP Deskjet 500 打印机打印该文件。
- 为获得最佳效果，可通过在文字处理程序中更改所需打印份数，多次（5 次）打印较小的图案。
- 打印机将再次预热，随后墨盒移动至“就绪位置”。
- 当墨盒移动到就绪位置（略微位于下方墨滴收集孔左侧并停留于此）时，向上拉动进纸机构金属丝，打印即开始。
- 若需打印多份，每次完成一个循环或一页打印后，需释放进纸机构。随后墨盒将返回“就绪”位置，此时应再次抬起进纸机构金属丝。
- 打印机将在步骤 5.2 中放置于打印载物台中心的盖玻片上进行打印（见 图 2）。
6. 代表性结果
如前所述，将标准现成的惠普Deskjet 500打印机和标准HP 26系列墨盒进行完整改装后，可获得一台能够打印多种细胞溶液用于各类分析的设备。改装完成后的打印机如图3所示，配有用于放置显微镜盖玻片的打印平台。该打印机在多个研究领域中具有应用价值，包括但不限于：单细胞力学、组织工程、基因转染、生物传感器微图案化以及直接细胞治疗。1-10, 16-22
在本示例中，对惠普 Deskjet 500 打印机和惠普 26 系列墨盒进行了改造，用于生物打印。使用该打印机系统，并以成纤维细胞悬浮于 G-肌动蛋白单体溶液中的生物墨水进行打印，将细胞打印至玻璃显微镜盖玻片上。图1展示了打印后成纤维细胞的代表性结果，显示细胞已整合荧光标记的肌动蛋白单体。实验在严格控制的无菌环境中进行，细胞被打印成可定制的图案。
本示例中使用的图案是在 Microsoft Word 中创建的（图2）。该图案在显微镜载玻片的大部分区域形成了一条连续的打印溶液线条。图4 显示了生物墨水与细胞共同沉积的直线。需要注意的是，打印完成后，背景荧光会立即增强，这是因为悬浮细胞的生物墨水溶液中含有游离的过量荧光标记肌动蛋白单体。在向细胞中加入培养基后（图1），背景荧光显著降低，因为培养基将底物上多余的单体冲洗掉。
图1。 使用改良喷墨打印机打印后3小时的3T3成纤维细胞代表性图像。细胞内部显示出掺入的荧光标记肌动蛋白单体。比例尺为50 μm。
图 2. 用于打印生物墨水的设计。
图3。 安装聚苯乙烯泡沫塑料平台后改装的打印机。中间的橙色电线绕过了进纸杆传感器。
图 4。 在局部打印区域内打印的 3T3 成纤维细胞的代表性图像。打印后 5 分钟在 20 倍放大倍数下拍摄的显微图像。
图 5。 打印后 3 小时拍摄的荧光图像（40 倍放大），显示成纤维细胞内化了荧光标记的肌动蛋白单体。比例尺为 50 μm。
图6。 细胞在打印后15分钟进行荧光显微镜观察（20倍放大）。图像显示了g-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。从左至右：Alexa Fluor 488标记的g-肌动蛋白、DAPI标记的细胞核，以及两者的叠加图像。
图7。 荧光显微镜图像显示打印后3小时呈线性排列的两个成纤维细胞。左侧图像显示细胞内荧光标记的肌动蛋白单体。右侧图像为荧光通道与背景图像的叠加，表明尽管载玻片上可能存在一些碎片（左下角），但其并不产生荧光。比例尺代表50 μm；若未标明尺寸，则最右侧为对照组，即未打印细胞在含有荧光标记单体的培养基中孵育3小时。该对照实验旨在证明，在未通过细胞打印实现细胞膜通透化的情况下，单体无法穿透细胞膜。
讨论
将标准喷墨桌面打印机改装用于生物打印的过程并不特别困难。最具挑战性的步骤是确定如何绕过进纸机构，而这取决于所使用的打印机品牌和型号。然而，当进纸传感器为机械式时（如本文所述），这一过程相对简单。对于采用光学进纸传感器的型号，可能需要采用其他技术手段来欺骗打印机，使其误认为正在使用纸张；例如，可以在打印机于显微镜载玻片上打印的同时，让一小片纸张通过打印机。绕过进纸机制很可能是将这些操作流程应用于不同打印机型号时最困难的步骤。
在构建用于放置盖玻片以进行打印的载物台时，确保正确的对齐和高度至关重要。该载物台应能使盖玻片位于打印区域的中央，同时将其置于适当的高度，以便打印墨盒能够顺利通过载玻片上方而不产生干扰。载物台的具体高度取决于打印机型号。
为确保打印的细胞不被冲走，载玻片在打印后立即放入培养箱中孵育约30分钟，以使细胞充分贴附，之后再添加额外的细胞培养基。由于细胞是在含有大量PBS的溶液中打印的，因此细胞不会干燥，仍保持活性。使用荧光显微镜对细胞成像，以观察细胞内标记的G-肌动蛋白单体的分布情况（图1、5-7）。使用3T3成纤维细胞进行打印时，图5展示了代表性结果，其中肌动蛋白导致细胞大部分区域产生荧光，同时呈现出亮度增强的条纹状结构。将荧光标记的G-肌动蛋白整合入细胞骨架中，有助于研究细胞骨架动力学和细胞力学特性12-15。该技术的一个局限性在于，仅适用于直径小于约10 nm的分子和蛋白质。
为了确认细胞确实被改装后的打印机处理，将DAPI（以PBS 1:5000稀释）加入生物墨水中，替代一半体积的纯PBS。荧光染料DAPI可结合位于细胞核内富含氨基酸的DNA区域，因此DAPI在荧光成像打印细胞的细胞核时是一种有效的染色剂。图6展示了一个代表性图像，显示细胞同时呈现Alexa Fluor 488（肌动蛋白）和DAPI（细胞核）的荧光信号，以及两者的叠加图像。图7还说明了当g-肌动蛋白单体被整合后细胞将产生荧光，而沉积到样品中的非生物材料由于缺乏g-肌动蛋白单体，不会产生荧光。
生物打印的一个重要考虑因素是生物墨水所使用的水性介质。研究发现，使用含血清的标准细胞培养基会得到不一致的结果。这很可能是因为血清蛋白堵塞了打印头喷嘴。使用磷酸盐缓冲液（PBS）可提高打印图案的一致性以及沉积的细胞数量。使用PBS的一个缺点是细胞不应在悬浮液中长时间放置。然而，在这些示例中，成纤维细胞能够在生物墨水条件下耐受至少一小时，且细胞活力未发生改变。这一结果与多项先前研究一致，这些研究表明，通过热喷墨机制打印的细胞具有较高的存活率。2-8
这种改进的打印机设置可用于细胞打印以外的应用。 16-22 基质蛋白（如胶原蛋白或纤连蛋白）可利用该技术轻松打印到基底上，适用于细胞图案化。例如，将I型胶原蛋白打印成线性图案，可获得排列有序的胶原基底，可用于 体外 细胞培养研究。17 除了基质蛋白外，其他分子（包括生长因子）也可被稳定地定位于细胞研究及潜在治疗应用的基底上。18
上述步骤中描述的设计存在一个主要局限性，即该打印机无法进行超过一维的打印。这限制了其在图案化应用（如支架打印）中的潜在用途。为了实现3D打印，需要使用专用的载物台。该载物台需具备可逐级调节高度的功能，以实现生物墨水的逐层沉积。
生物打印已被证明是一种高效且具有成本效益的组织工程、基因转染、微图案化及微阵列制备方法。1-12, 16-22 这类装置的未来应用前景广泛，包括：构建可控且具有特定图案的细胞微环境、将大分子整合至细胞胞质中，以及将细胞沉积到自然界中不存在或无法高效形成的支架和结构上。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者谨此感谢 Thomas Boland 博士提出使用惠普 DeskJet 打印机进行细胞打印的构想。本项目由美国国家科学基金会（NSF RII-EPS 0903795）和美国国立卫生研究院（NIH K25 HL0922280）提供资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HP DeskJet 500 | 惠普公司 | C2106A | 制造商已停产。购自翻新的 DEC Trader。 |
| HP 26 黑色墨盒 | 惠普公司 | 51626A | |
| 兔骨骼肌肌动蛋白，Alexa Fluor 488 标记，200 μg | 英潍捷基 | A12373 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | MP 生物医学 | ICN1860454 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 赛默飞世尔科技公司 | SH3002201 | |
| 胎牛血清 | 西格玛-奥德里奇 | F4135 | |
| 两性霉素 B | 西格玛-奥德里奇 | A2942 | 在细胞培养基中使用浓度为 0.5% |
| 青霉素-链霉素 | 西格玛-奥德里奇 | P4333 | 在细胞培养基中使用浓度为 0.5% |
| 单向气流洁净工作台 | Envirco | VLF 797 | 可选外壳，用于保持打印机无菌环境 |
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重印与许可
