体外 利用小鼠进行气管收缩的测量

摘要

转基因小鼠在赋予基因生理功能方面极为有用。因此，总体研究尤其是气道功能研究已显著转向小鼠模型。本文提供了以下实验方案 体外 气管收缩研究以评估小鼠气道平滑肌功能

摘要

转基因和基因敲除小鼠一直是研究气道生理学和病理生理学的有力工具^1,2。体外分离气管组织的张力测定已被证明是评估基因修饰小鼠气道平滑肌（ASM）收缩反应的有效方法。这些体外气管制备方法相对简单，反应稳定，并能保留功能性胆碱能神经末梢和平滑肌反应，即使经过长时间孵育后仍可维持。

气管张力测定还可作为一种功能性检测方法，用于研究多种影响平滑肌收缩的第二信使信号通路。气管收缩主要由副交感胆碱能神经介导，这些神经释放乙酰胆碱作用于气道平滑肌（ASM）图1). 主要的ASM乙酰胆碱受体为毒蕈碱型M2和M3，二者均为G蛋白偶联受体_{输入/输出} 以及分别偶联Gq的受体^3,4,5M3受体通过与Gq蛋白偶联，激活磷脂酶C，增加IP3的生成，并促进IP3介导的肌浆网钙离子释放，从而引起收缩反应^3,6,7M2/G_{输入/输出} 人们认为，信号传导通过抑制腺苷酸环化酶导致cAMP水平下降，从而增强收缩。^5,8,9,10这些通路构成了气道平滑肌所谓的“药物-收缩耦联”¹¹此外，通过M2受体（并受M3受体信号调节）的胆碱能信号传导涉及使气道平滑肌去极化的通路，进而激活L型电压依赖性钙通道（图1以及钙离子内流（即所谓的“兴奋-收缩耦联”）^4,7有关调控气道收缩信号通路的更详细综述可参见^4,12上述通路在小鼠与其他物种之间似乎具有保守性。然而，小鼠气管在某些信号通路方面与其他物种存在差异，其中最显著的是其对组胺和腺苷缺乏收缩反应^13,14，两者均为人类及其他物种中已知的ASM调节剂^5,15.

本文介绍了小鼠气管环的分离方案以及 体外 测量其收缩输出。内容包括设备配置、气管环的分离及收缩力测量的详细描述。示例中介绍了通过高钾刺激神经间接诱导收缩，以及通过去极化气道平滑肌（ASM）直接激活电压依赖性钙离子内流来引发收缩的方法（1. 高K⁺）⁺, 图1此外，还介绍了仅使用电场刺激（2. EFS）对神经进行刺激的方法。 图1），或通过向浴液中添加外源性神经递质直接刺激气道平滑肌（3. 外源性 ACh， 图1这种灵活性和制备简便性使得离体气管环模型成为研究多种参与气道平滑肌收缩的信号通路的可靠且功能性的检测方法。

方案

1. 仪器设备

收缩力测量装置的主要组件如图2A所示。

1. 组织浴槽。 组织浴槽用于维持含氧的生理溶液在适宜温度下。对于小鼠气管环，我们使用一个10 ml的组织浴槽，其带有用于循环加热液体的水夹层、用于通入氧气（95%/5% O₂/CO₂混合气体）的烧结玻璃进气口，以及用于更换溶液的进液口和出液口。储备的PSS溶液保存在一个37 °C水浴中，并持续通入95%/5% O₂/CO₂混合气体（图中未显示）。在更换溶液时，PSS溶液以约每分钟100 ml的速度从储液罐泵入组织浴槽的进液口（底部端口），以实现相对较快的溶液更换。溶液通过溢流口（顶部端口）排出，从而在换液过程中保持浴槽内体积恒定（约10 ml）。我们使用Haake加热循环器将温水泵入组织浴槽的夹层中，以维持37 °C的温度。组织浴槽可从多个供应商处获得，具有多种尺寸和样式，可根据研究者的实验需求进行选择。
2. 力传感器。 为测量等长张力，将气管套在两根不锈钢棒的L形末端上（图2A）。应选用与生物材料相容的不锈钢类型。上方的钢棒通过夹子连接至等长力传感器。下方的钢棒将气管固定在某一位置，并安装在微米调节器上，用于调整被动张力和/或肌肉长度。气管收缩时产生的张力传递至力....

讨论

本文所述方案提供了一种用于评估气道平滑肌功能的生理学制备方法。我们通常同时进行3至4个器官浴实验，但目前多家供应商已提供可同时测量多达8个样本的预包装系统（如ADInstruments、World Precision Instruments和Harvard Apparatus）。我们曾使用多种张力传感器和组织器官浴装置，均获得了相当的结果。然而，我们发现电场刺激可能因刺激电极的尺寸、电极板之间的距离以及样本在电场中位置的微小差异而带来一定变异性。因此，应格外注意使各电场电极尽可能保持一致。

在等长力测量中，最关键的参数之一是收缩力的标准化问题，目的是补偿不同样本之间肌肉质量或肌肉组织健康状况的差异。部分差异可通过比较相同年龄和性别的动物来最小化（例如，雌性小鼠通常产生的气管张力较低）。此外，我们发现，以气管湿重或干重进行标准化的方法缺乏足够的精确性，这可能是因为小鼠气管体积较小所致。相比之下，采用多次高钾诱导收缩的方法具有显著优势。高钾收缩具有两个作用：其一，高钾收缩似乎能够“激活”气管平滑肌，确保在进行实验性刺激之前收缩反应具有可重复性；其二，高钾收缩似乎能准确反映样本中活性肌肉.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
模拟-数字转换器	ADInstruments	PowerLab 4/35
卡巴胆碱（Carbamoylcholine Chloride）	Sigma-Aldrich	C4832	10-2 M 水溶液（分装后可储存于 -20 °C）
图表软件	ADInstruments	LabChart
加热循环器	Haake	Mixer Mill MM400
等长张力传感器	Kent Scientific	TRN001
刺激器	Grass Technologies	S88 双输出方波脉冲刺激器
组织浴槽	WPI	47264