转基因小鼠在赋予基因生理功能方面极为有用。因此，总体研究尤其是气道功能研究已显著转向小鼠模型。本文提供了以下实验方案 体外 气管收缩研究以评估小鼠气道平滑肌功能
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摘要
摘要
转基因和基因敲除小鼠一直是研究气道生理学和病理生理学的有力工具1,2。体外分离气管组织的张力测定已被证明是评估基因修饰小鼠气道平滑肌（ASM）收缩反应的有效方法。这些体外气管制备方法相对简单，反应稳定，并能保留功能性胆碱能神经末梢和平滑肌反应，即使经过长时间孵育后仍可维持。
气管张力测定还可作为一种功能性检测方法，用于研究多种影响平滑肌收缩的第二信使信号通路。气管收缩主要由副交感胆碱能神经介导，这些神经释放乙酰胆碱作用于气道平滑肌（ASM）图1). 主要的ASM乙酰胆碱受体为毒蕈碱型M2和M3，二者均为G蛋白偶联受体输入/输出 以及分别偶联Gq的受体3,4,5M3受体通过与Gq蛋白偶联，激活磷脂酶C，增加IP3的生成，并促进IP3介导的肌浆网钙离子释放，从而引起收缩反应3,6,7M2/G输入/输出 人们认为，信号传导通过抑制腺苷酸环化酶导致cAMP水平下降，从而增强收缩。5,8,9,10这些通路构成了气道平滑肌所谓的“药物-收缩耦联”11此外，通过M2受体（并受M3受体信号调节）的胆碱能信号传导涉及使气道平滑肌去极化的通路，进而激活L型电压依赖性钙通道（图1以及钙离子内流（即所谓的“兴奋-收缩耦联”）4,7有关调控气道收缩信号通路的更详细综述可参见4,12上述通路在小鼠与其他物种之间似乎具有保守性。然而，小鼠气管在某些信号通路方面与其他物种存在差异，其中最显著的是其对组胺和腺苷缺乏收缩反应13,14，两者均为人类及其他物种中已知的ASM调节剂5,15.
本文介绍了小鼠气管环的分离方案以及 体外 测量其收缩输出。内容包括设备配置、气管环的分离及收缩力测量的详细描述。示例中介绍了通过高钾刺激神经间接诱导收缩，以及通过去极化气道平滑肌（ASM）直接激活电压依赖性钙离子内流来引发收缩的方法（1. 高K⁺）+, 图1此外，还介绍了仅使用电场刺激（2. EFS）对神经进行刺激的方法。 图1），或通过向浴液中添加外源性神经递质直接刺激气道平滑肌（3. 外源性 ACh， 图1这种灵活性和制备简便性使得离体气管环模型成为研究多种参与气道平滑肌收缩的信号通路的可靠且功能性的检测方法。
方案
1. 仪器设备
收缩力测量装置的主要组件如图2A所示。
- 组织浴槽。 组织浴槽用于维持含氧的生理溶液在适宜温度下。对于小鼠气管环，我们使用一个10 ml的组织浴槽，其带有用于循环加热液体的水夹层、用于通入氧气（95%/5% O2/CO2混合气体）的烧结玻璃进气口，以及用于更换溶液的进液口和出液口。储备的PSS溶液保存在一个37 °C水浴中，并持续通入95%/5% O2/CO2混合气体（图中未显示）。在更换溶液时，PSS溶液以约每分钟100 ml的速度从储液罐泵入组织浴槽的进液口（底部端口），以实现相对较快的溶液更换。溶液通过溢流口（顶部端口）排出，从而在换液过程中保持浴槽内体积恒定（约10 ml）。我们使用Haake加热循环器将温水泵入组织浴槽的夹层中，以维持37 °C的温度。组织浴槽可从多个供应商处获得，具有多种尺寸和样式，可根据研究者的实验需求进行选择。
- 力传感器。 为测量等长张力，将气管套在两根不锈钢棒的L形末端上（图2A）。应选用与生物材料相容的不锈钢类型。上方的钢棒通过夹子连接至等长力传感器。下方的钢棒将气管固定在某一位置，并安装在微米调节器上，用于调整被动张力和/或肌肉长度。气管收缩时产生的张力传递至力传感器，并在前置放大器中转换为电压信号。下方钢棒还可配置两个矩形铂电极板（相距4 mm），位于气管两侧（图2B）。铂电极板连接至Grass S88刺激器，可在气管上施加电场。裸露的导线和焊点均涂覆Sylgard（Sylgard 184硅弹性体，Dow Corning Corp, Midland, MI），以防止金属离子渗入浴槽溶液中。
- A/D转换器、计算机及数据采集软件。 来自前置放大器的信号记录在MacLab 8 A/D系统上。这是当前ADInstruments Powerlab硬件的早期版本。我们使用Chart软件（ADInstruments）对整个实验过程中的张力进行连续记录。气管平滑肌产生的张力变化较缓慢，因此我们发现每秒采集100个数据点已足够。每次实验前均使用已知重量（最大5克）对张力测量系统进行校准。其他厂商也提供类似系统（例如BioPac、GW Instruments）。
2. 气管分离
- 在组织分离前，使用已知重量对力传感器进行校准，并向组织浴槽中加入正常PSS（见表I）。调节空气入口以获得轻微的氧气气流2/CO2.
- 两个月或更年老的小鼠气管最为理想。也可使用较年幼的动物，但由于其气管尺寸较小，将其安装到测力传感器金属丝上需要更高的操作技巧。解剖前，先用异氟烷对小鼠进行深度镇静。当用镊子夹捏脚趾无法引起反应时，表明镇静程度已达到适当水平。随后立即通过颈椎脱位法处死小鼠。 一个重要提示： 我们观察到，阿弗丁（Avertin，Tribromoethanol），一种常用于小鼠的镇静剂，对气道平滑肌具有显著的松弛作用，因此不应用于气管收缩研究。
- 从胸部至喉部去除皮肤（和毛发）。从胸骨底部开始，沿两侧向上至心脏顶部剪开肋骨。然后将胸骨和肋骨向前牵拉至喉部，以暴露心脏/肺、胸腺、气管（腹侧）以及食管（附着于气管，位于气管背侧）。
- 气管在支气管分叉下方和咽部上方被切除。将气管置于冰冻的含氧（95/5）PSS溶液中（成分见表I）。
- 气管应剥离周围组织至干净。在清理过程中，可于咽部或气管分叉下方夹持气管，但需注意避免直接用镊子夹持气管本身。可使用精细剪刀剪除周围组织，但剪切时应始终与气管走向平行，以避免损伤。若将气管标本在分叉下方和咽部上方固定于Sylgard包被的培养皿（Sylgard 184 Silicone Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI）上，此步骤操作将更为便利。
- 去除周围组织后，于咽部下方和支气管分叉上方切断气管，并轻轻将其固定在测力传感器的金属丝上。
- 气管被穿入两个L形金属叉中（图 2A）。其中一个叉臂连接至力-位移换能器，用于连续记录等长张力；另一个叉臂连接至千分尺。随后抬高组织浴槽，使气管浸入PSS溶液中。气管的安装应尽快完成，以尽量减少气管暴露于PSS溶液外的时间。经过练习后，气管安装通常可在1分钟内完成，但一般应避免操作时间超过3分钟，以防组织活性下降。
- 将微米计缓慢调节，以获得约10 mN（约1克力）的被动张力。最佳静息张力系通过经验确定，我们发现被动张力在约5–10 mN范围内时，可产生等效的最大高钾刺激反应。该结果与多项采用此范围内被动张力的其他研究一致。16,17,18在最初的5-10分钟内，气管的被动张力 tends to 下降（应力松弛现象），在平衡期间使用千分尺将被动张力调整至约10 mN。气管需至少平衡1小时后，方可进行实验性刺激。
3. 高钾刺激
平衡后，用高钾PSS溶液（67 mM KCl，表I）对气管进行两次刺激。收缩通常需要约5-10分钟达到稳态，此时用正常的PSS多次冲洗浴槽，使气管完全松弛。重复第二次钾诱导收缩，必要时进行第三次，直至获得可重复的收缩反应。
4. 电刺激诱发的收缩
气管两侧各有一个矩形铂金板（电极），可用于对样本施加电场刺激（EFS）。EFS引起的收缩反应依赖于刺激的频率和电压，同时也受电极面积以及电极间距离等物理参数的影响。刺激器的功率特性也会影响反应，例如在较高电压和电流输出时，刺激器可能达到其输出极限。任何EFS系统的特性都应通过检测肌肉在不同刺激时程、频率、电压和脉冲持续时间下的收缩反应来确定。在我们的实验装置中，我们发现当电极间距约为4 mm，刺激幅度为44 V（脉冲时长0.5 ms）、频率为30 Hz时，可获得可重复且接近最大幅度的收缩反应。
5. 胆碱能刺激诱发的收缩
通过单次给予受试药物或以累积剂量方式多次给予药物，评估气管对体外施加化合物的反应性。对于气管实验，本实验室常规使用卡巴胆碱激活胆碱能受体，因为与乙酰胆碱不同，卡巴胆碱不会被乙酰胆碱酯酶降解。卡巴胆碱的合理剂量-反应范围为10-8至10-5 M。采用Hill方程拟合Log[卡巴胆碱]-收缩反应曲线，可估算EC50（半数有效浓度），该参数用于衡量气管收缩对胆碱能激动剂的敏感性19。值得注意的是，相同剂量的卡巴胆碱作为单次剂量给予时所产生的反应略大于其在累积剂量-反应曲线中的反应。
6. 代表性结果
高钾诱导的收缩反应示例如图3A所示。收缩反应通常在约10分钟内达到峰值，之后可能出现轻微下降。在高钾溶液的早期洗脱过程中，由于连接管路中少量未加热的PSS溶液短暂灌流组织标本，导致温度下降，肌肉可能出现短暂的收缩增强。通过减少加热PSS储液罐与组织浴之间管路的死腔体积，并以相对较快的速度更换溶液（通常以100 ml/min的流速泵入溶液），可尽量减少该现象。由于肌肉质量差异或解剖过程中造成的损伤，每个标本的收缩反应可能存在一定差异。图3B展示了两个肌肉质量不同的气管在高钾溶液和卡巴胆碱刺激下的反应。尽管胆碱能激动剂诱导的收缩幅度不同，但在以高钾溶液的反应作为标准化参照后，其归一化结果相似（图3C）。
图4展示了使用单次剂量（A）和累积递增剂量（B）诱发的卡巴胆碱（胆碱能）收缩示例。卡巴胆碱溶液直接加入浴槽中，通入的气体有助于快速混合。值得注意的是，单次给药（例如 1 μM，图4A）引起的反应略大于累积剂量-反应曲线中相应浓度（1 μM，图4B）所引发的反应。图4C显示了基于图4B数据绘制的收缩力随卡巴胆碱浓度变化的曲线图。卡巴胆碱的作用在 10-5 M 浓度时达到饱和。尽管胆碱能激动剂通过钙释放机制启动收缩，但收缩反应的相当一部分也由去极化及电压依赖性钙通道的激活所介导20。
图5A 显示了电场刺激（EFS）诱导收缩的一个示例。使用持续时间为0.5毫秒、电压为40伏的脉冲刺激气管，直至收缩达到平台期（见插图a1）。增加刺激频率可导致收缩反应增强（频率-反应曲线见图5B）。已有研究表明，电场刺激主要通过激活突触前神经来诱导收缩。这一点可通过肉毒毒素的作用得到证实：作为一种神经递质释放阻断剂，肉毒毒素可阻断大部分由EFS诱导的气管收缩21。此外，河豚毒素是一种可阻断Na+通道的试剂，同样能抑制神经活性，并完全消除气管对EFS的反应。
图1. 离体气管制备中主要信号通路的示意图。图中显示支配气管平滑肌细胞的胆碱能轴突末梢。主要信号通路包括M3和M2型毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mACHR）的激活，其中M3受体通过IP3受体引起钙离子释放，M2受体则降低cAMP水平。M2受体（以及部分M3受体）还可引起胆碱能诱导的去极化，从而激活L型电压依赖性钙通道并导致钙离子内流。常见的收缩剂及其效应分子包括：1. 高钾溶液（使平滑肌细胞和胆碱能轴突去极化）；2. 电场刺激（EFS，使胆碱能轴突去极化）；3. 外源性应用胆碱能激动剂（如乙酰胆碱或卡巴胆碱），直接激活毒蕈碱受体。
图 2. 用于测量气管收缩的设备示意图。A. 力传感器、千分尺和组织浴槽通过螺钉夹具固定在支撑杆上。气管环穿在上下两根杆上。图中所示为浴槽位于标本下方（即气管安装到力传感器时的位置）。在进行收缩实验时，将组织浴槽垂直移动以浸没标本。B. 进行电场刺激时，底部杆经改装，包含两个铂金板，侧向固定于夹持气管的金属丝上。铂金板通过导线与刺激器相连。
图3. 气管对高钾（67 mM）刺激的收缩反应示例。（A）显示对高钾刺激的重复性、可重现的反应。（B）两个不同气管对卡巴胆碱的收缩反应示例。（C）将B中气管的反应以高钾反应为基准进行归一化后，其反应相似。
图 4. 卡巴胆碱诱导收缩的示例。（A）使用单次剂量卡巴胆碱后进行洗脱的诱导收缩实验。（B）A 中气管的累积剂量-反应曲线示例。（C）将 B 中的峰值收缩按卡巴胆碱浓度作图。
图5. 电场刺激诱发收缩的示例。（A）使用0.5 ms脉冲、40伏电压及如图所示的不同刺激频率对气管收缩进行电场刺激。插图为30 Hz时时间扩展的收缩曲线。（B）将A图中的峰值收缩按刺激频率作图。
正常PSS
| 盐 | 浓度 (mM) | 用量 (g/2 L) |
| NaCl | 119 | 13.91 |
| KCl | 4.7 | 0.7 |
| KH2PO4 | 1.18 | 0.32 |
| MgSO4 x 7H2O | 1.17 | 0.58 |
| NaHCO3 | 18 | 3.02 |
| EDTA | 0.026 | 0.1 ml 的 0.5 M |
| 葡萄糖 | 11 | 3.96 |
| 蔗糖 | 12.5 | 8.56 |
| CaCl2 | 2 | 400 ml 的 10 mM |
高 K+ PSS（NaCl 和 KCl 调整）
| 盐 | 浓度 (mM) | 用量 (g/2 L) |
| NaCl | 56.7 | 6.628 |
| KCl | 67 | 9.991 |
表1. PSS溶液的配制配方。注意：溶液每周新鲜配制，使用超纯水，并在冰箱中储存不超过5天，以避免污染生长。
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讨论
本文所述方案提供了一种用于评估气道平滑肌功能的生理学制备方法。我们通常同时进行3至4个器官浴实验，但目前多家供应商已提供可同时测量多达8个样本的预包装系统（如ADInstruments、World Precision Instruments和Harvard Apparatus）。我们曾使用多种张力传感器和组织器官浴装置，均获得了相当的结果。然而，我们发现电场刺激可能因刺激电极的尺寸、电极板之间的距离以及样本在电场中位置的微小差异而带来一定变异性。因此，应格外注意使各电场电极尽可能保持一致。
在等长力测量中，最关键的参数之一是收缩力的标准化问题，目的是补偿不同样本之间肌肉质量或肌肉组织健康状况的差异。部分差异可通过比较相同年龄和性别的动物来最小化（例如，雌性小鼠通常产生的气管张力较低）。此外，我们发现，以气管湿重或干重进行标准化的方法缺乏足够的精确性，这可能是因为小鼠气管体积较小所致。相比之下，采用多次高钾诱导收缩的方法具有显著优势。高钾收缩具有两个作用：其一，高钾收缩似乎能够“激活”气管平滑肌，确保在进行实验性刺激之前收缩反应具有可重复性；其二，高钾收缩似乎能准确反映样本中活性肌肉...
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致谢
本工作由气道疾病预防与治疗创新中心资助项目（NINDS 资助号：NS052574）以及桑德勒哮喘研究项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 模拟-数字转换器 |  ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| 卡巴胆碱（Carbamoylcholine Chloride） | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M 水溶液（分装后可储存于 -20 °C） |
| 图表软件 | ADInstruments | LabChart | |
| 加热循环器 | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| 等长张力传感器 | Kent Scientific | TRN001 | |
| 刺激器 | Grass Technologies | S88 双输出方波脉冲刺激器 | |
| 组织浴槽 | WPI | 47264 |
参考文献
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