神经母细胞检测：一种利用流式细胞术从分化中的神经干细胞后代中生成并富集神经祖细胞的检测方法

摘要

本视频方案展示了一种基于流式细胞术技术，利用神经干细胞（NSCs）的物理特性（大小和内部粒度）及荧光特性，从可再生的神经干细胞来源中生成并随后纯化神经祖细胞的新方法。

摘要

神经干细胞（NSCs）可通过神经球实验进行分离并大规模扩增，并可分化为中枢神经系统（CNS）的三种主要细胞类型，即星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。这些特性使神经干细胞和前体细胞成为细胞治疗和神经再生研究中极为宝贵的可再生细胞来源 体外 诸如药物筛选、神经毒理学和电生理学研究，以及多种神经系统疾病的细胞替代治疗。然而在实际应用中，神经干细胞（NSC）分化后代的异质性、神经元和少突胶质细胞产量低，以及分化后以星形胶质细胞为主等问题，限制了其临床应用。本文介绍一种利用荧光激活细胞分选（FACS）技术从鼠源性NSC后代中生成并进一步纯化未成熟神经元的创新方法。采用该方法可获得高度富集的神经前体细胞群体，且无明显星形胶质细胞和真正NSC的污染。该流程包括：通过神经球实验分离并扩增来自E14小鼠纹状体隆起的NSC后代，诱导其分化，随后基于细胞的物理特性（大小和内部复杂性）及荧光特性，利用流式细胞术分离和富集未成熟神经元细胞。总体而言，生成神经球需5–7天，进一步分化NSC后代并分离高纯度的未成熟神经元细胞需6–8天。

方案

1. 进行细胞培养前的基本准备

1. 将 NeuroCult NSC 基础培养基与 NeuroCult NSC 增殖添加剂按 9:1 的比例混合，以配制完全 NSC 培养基。
2. 使用 37 °C 水浴将培养基预热。
3. 将适量热灭活的胎牛血清（FCS）解冻。
4. 将适量储存液形式的生长因子溶液，包括表皮生长因子（EGF，10 μg/ml）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF，10 μg/ml）以及磷酸盐缓冲液（PBS）中的 0.2% 肝素溶液解冻。
5. 需要组织培养瓶（T25、T75 或 &T175）用于神经干细胞的扩增与分化。
6. 需要经组织培养处理的 96 孔和 24 孔板以及玻璃盖玻片，用于接种分选后的细胞。

2. NSCs 的分离与扩增（传代）

1. 按照其他独立的实验方案所述，从小鼠脑组织中分离并扩增神经干细胞和前体细胞^{1, 2, 3}。
2. 当神经球（无论是原代还是传代的神经球）达到传代条件（直径为150–200 μm）时，将含有神经球的培养基转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以800 rpm（110 g）离心5分钟。
3. 移除上清液，将神经球重悬于1 ml预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中。
4. 在37 °C水浴中孵育2–3分钟后，向细胞悬液中加入等体....

讨论

分离特定神经细胞群体（即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）的能力，可能有助于克服神经干细胞（NSCs）在临床应用中面临的一些障碍。首先，该技术使我们能够全面表征供体细胞的起始群体。其次，可根据疾病性质或病程阶段，选择使用特定类型的细胞，或以特定比例组合使用不同类型的细胞。最后，使用高度富集的预分化神经前体细胞，可显著降低因使用包含真正NSCs的异质性神经前体细胞而可能导致的非可控性增殖和肿瘤形成风险。⁶通常情况下，神经干细胞的分化会导致5-10%的细胞成为神经元，而超过80%的细胞则分化为星形胶质细胞。采用NBA分化方法，神经元细胞的比例可提高至20-30%，但培养物中仍存在大量星形胶质细胞以及其他干细胞和前体细胞，若研究目标是获取纯化的神经元细胞，则这种情况可能并不理想。 体外 或用于研究其在神经系统疾病动物模型中的治疗效果。在本方案中，我们利用了正在分化的神经干细胞子代细胞在物理特性和荧光特性上的固有差异，以纯化未成熟的神经元细胞⁵我们的流式细胞术纯化方法可将神经元细胞的比例从20-30%提高到75-97%，且未检测到星形胶质细胞以及未分化的真正神经干细胞和前体细胞。 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NeuroCult NSC 基础培养基	培养基	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC 增殖添加剂	培养基添加剂	Stem Cell Technologies	05701
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
大豆胰蛋白酶抑制剂	试剂	Sigma-Aldrich	T6522
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	试剂	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM 组分
*HEPES	试剂	Sigma-Aldrich	H4034	HEM 组分
*蒸馏水	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
细胞滤网	筛具	BD Biosciences	352340
T25 培养瓶	培养器皿	Nalge Nunc International	136196
T80 培养瓶	培养器皿	Nalge Nunc International	178905
15 ml 离心管	培养器皿	BD Biosciences	352096
50 ml 离心管	培养器皿	BD Biosciences	352070
EGF	生长因子	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	生长因子	R&D Systems	3139-FB
肝素	生长因子	Sigma-Aldrich	H4784	用 PBS 重悬
抗 PSA-NCAM-PE 抗体	抗体	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE 标记的小鼠 IgG1	同型对照抗体	BD Biosciences	556029
肝素	生长因子	Sigma-Aldrich	H4784	用 PBS 重悬
HrBMP-4	生长因子	R&D Systems	314-BP-010
多聚-L-鸟氨酸	试剂	Sigma-Aldrich	P4957
胎牛血清	培养基添加剂	GIBCO, by Life Technologies	10099-141
GFAP	抗体	Dako	Z0334
B-III 微管蛋白	抗体	Promega Corp.	G7121
*配制 HEM：取 1 包 10 L 的 1× MEM 粉末与 160 ml 1 M HEPES 混合，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4°C 保存。