本视频方案展示了一种基于流式细胞术技术，利用神经干细胞（NSCs）的物理特性（大小和内部粒度）及荧光特性，从可再生的神经干细胞来源中生成并随后纯化神经祖细胞的新方法。
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本文内容
摘要
摘要
神经干细胞（NSCs）可通过神经球实验进行分离并大规模扩增，并可分化为中枢神经系统（CNS）的三种主要细胞类型，即星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。这些特性使神经干细胞和前体细胞成为细胞治疗和神经再生研究中极为宝贵的可再生细胞来源 体外 诸如药物筛选、神经毒理学和电生理学研究，以及多种神经系统疾病的细胞替代治疗。然而在实际应用中，神经干细胞（NSC）分化后代的异质性、神经元和少突胶质细胞产量低，以及分化后以星形胶质细胞为主等问题，限制了其临床应用。本文介绍一种利用荧光激活细胞分选（FACS）技术从鼠源性NSC后代中生成并进一步纯化未成熟神经元的创新方法。采用该方法可获得高度富集的神经前体细胞群体，且无明显星形胶质细胞和真正NSC的污染。该流程包括：通过神经球实验分离并扩增来自E14小鼠纹状体隆起的NSC后代，诱导其分化，随后基于细胞的物理特性（大小和内部复杂性）及荧光特性，利用流式细胞术分离和富集未成熟神经元细胞。总体而言，生成神经球需5–7天，进一步分化NSC后代并分离高纯度的未成熟神经元细胞需6–8天。
方案
1. 进行细胞培养前的基本准备
- 将 NeuroCult NSC 基础培养基与 NeuroCult NSC 增殖添加剂按 9:1 的比例混合，以配制完全 NSC 培养基。
- 使用 37 °C 水浴将培养基预热。
- 将适量热灭活的胎牛血清（FCS）解冻。
- 将适量储存液形式的生长因子溶液，包括表皮生长因子（EGF，10 μg/ml）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF，10 μg/ml）以及磷酸盐缓冲液（PBS）中的 0.2% 肝素溶液解冻。
- 需要组织培养瓶（T25、T75 或 &T175）用于神经干细胞的扩增与分化。
- 需要经组织培养处理的 96 孔和 24 孔板以及玻璃盖玻片，用于接种分选后的细胞。
2. NSCs 的分离与扩增（传代）
- 按照其他独立的实验方案所述，从小鼠脑组织中分离并扩增神经干细胞和前体细胞1, 2, 3。
- 当神经球（无论是原代还是传代的神经球）达到传代条件（直径为150–200 μm）时，将含有神经球的培养基转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以800 rpm（110 g）离心5分钟。
- 移除上清液，将神经球重悬于1 ml预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中。
- 在37 °C水浴中孵育2–3分钟后，向细胞悬液中加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。
- 为确保胰蛋白酶被完全灭活，用移液器轻柔吹打细胞悬液3–5次。
- 在800 rpm（110 g）下离心5分钟后，移除上清液，并将细胞重悬于1 ml完全神经干细胞培养基中。
- 取10 μl细胞悬液与90 μl台盼蓝混合，进行细胞计数。
注意：也可使用其他适当的细胞稀释比例。
- 随后，细胞可用于传代培养1, 2，或按如下所述进行分化。
3. 神经干细胞与前体细胞的分化 神经母细胞检测（NBA）
- 将解离后的神经球细胞以 2-3 × 105 个细胞/ml 的浓度接种于完全神经干细胞培养基中，培养基中添加 20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF、1 μl/ml 的 0.2% 肝素以及 5% 热灭活的 FCS，接种于适当大小的组织培养瓶中。T25 培养瓶使用 5 ml 培养基，T75 使用 20 ml，T175 使用 40 ml。
注意：FCS 会使细胞牢固贴附于基质，因此 NBA 培养无需对培养瓶进行包被。
- 将培养瓶置于含 5% CO2 的 37 °C 恒温湿润培养箱中培养 3-4 天。此阶段称为增殖阶段，在此期间神经干细胞的子代细胞贴附于基质，并以单层细胞形式增殖。
- 当培养细胞达到 90-95% 汇合时，更换每瓶中的培养基为完全神经干细胞培养基，并添加 5% FCS，但不添加任何生长因子。
- 再次将培养瓶置于含 5% CO2 的 37 °C 恒温湿润培养箱中继续培养 3-4 天。此阶段称为分化阶段，在此期间神经前体细胞出现在星形胶质细胞单层之上，并增殖形成未成熟神经元细胞的克隆集落。在分化阶段的第 4-5 天，即可利用流式细胞术技术分离神经母细胞。
4. 流式细胞术的细胞准备
胰蛋白酶消化
- 在分化阶段的第4-5天，用适量PBS洗涤正在分化的NSC子代细胞培养物（T25培养瓶用2 ml，T75用4 ml，T175用8 ml），以去除培养基中的FCS。
注意：FCS会抑制胰蛋白酶-EDTA的活性。
- 随后，向每个培养瓶中加入足量预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液（T25培养瓶加2 ml，T75加4 ml，T175加8 ml），使其覆盖细胞单层，并在37 °C恒湿培养箱中孵育1-2分钟。
- 在显微镜下观察培养瓶，评估胰蛋白酶-EDTA对细胞的作用效果。然后一手握住培养瓶，另一手用力敲击，使细胞从瓶底脱落。
- 向培养瓶中加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂，以终止胰蛋白酶活性。轻轻吹打细胞悬液，上下混匀，确保胰蛋白酶完全失活，并获得均一的单细胞悬液。
注意：也可使用含5% FCS的培养基终止胰蛋白酶活性。
- 为去除未解离的细胞团块，将细胞悬液通过40 μm孔径的滤网过滤。
- 将细胞悬液在800 rpm（110g）条件下离心5分钟，弃去上清液，用适量完全NSC培养基重悬细胞。
- 调整细胞悬液的最终体积，使细胞密度不超过2-3×106 个细胞/ml。过高的细胞密度可能导致流式细胞仪进样管路堵塞。
- 若希望仅根据物理特性分离神经元细胞，此时可按照第4部分所述进行FACS分选。
- 分选前，向每毫升细胞悬液中加入1 μl Propidium Iodide（PI, Sigma, 500 μg/ml in PBS），以排除死细胞。
活细胞免疫标记
为了获得更高纯度的神经元细胞，可对NBA培养物中收获的单个细胞进行PSA-NCAM染色（PSA-NCAM是早期未成熟神经前体细胞的标志物），然后利用流式细胞分选仪（FACS）分离神经元群体中的阳性细胞。
- 进行细胞计数后，将 NBA 培养物中的单细胞悬液分为四组：
- 仅细胞组，作为调整参数和设门的对照（0.5–1 × 106 个细胞）。
- 细胞加碘化丙啶（PI）组，作为调整参数和设门的对照（0.5–10 × 106 个细胞）。该组中 PI 阴性的细胞也可根据其物理特性进行分选。
- 单独的同型对照（Secondary alone，Isotype control）组，同样作为调整参数和设门的对照（1–2 × 106 个细胞）。
- 免疫标记组（8–10 × 106 个细胞），用于 PSA-NCAM 染色，以进一步纯化未成熟神经元细胞。为在分选时排除死细胞，该组也加入碘化丙啶（PI）。
- 开始免疫标记前，将细胞在 800 rpm（110 g）下离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 100 μl 完全 NSC 培养基中。
- 向待进行 PSA-NCAM 染色的细胞悬液中加入藻红蛋白（PE）标记的抗-PSA-NCAM 抗体，添加比例为每 5–10 × 106 个细胞加入 10 μl。同样，向同型对照细胞悬液中加入 PE 标记的小鼠 IgG1 同型对照抗体。抗体使用浓度请参照抗体说明书中的建议。随后轻轻混匀细胞悬液，并在避光条件下室温孵育 10–15 分钟。
- 将细胞悬液（PSA-NCAM 和同型对照管）在 800 rpm（110 g）下离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 1 ml 完全 NSC 培养基中。
- 为去除样本中未结合的过量抗体，重复第 4 步操作 2–3 次。
- 将细胞重悬于适当体积的培养基后，向各细胞悬液（细胞加 PI、同型对照及 PSA-NCAM 染色样本）中加入碘化丙啶（PI，Sigma，PBS 中 500 μg/ml），终浓度为每毫升细胞悬液加入 1 μl，以便在流式细胞分析时排除死细胞。
- 准备含 1 ml 完全培养基的 15 ml 无菌 Falcon 管，用于收集来自不同细胞群体的分选细胞。
5. 未成熟神经元的荧光激活细胞分选（FACS）
- 根据流式细胞仪设施专业技术人员提供的用户手册说明设置 FACS 仪器。
- 磷酸盐缓冲液（PBS）或其他根据制造商说明适用的溶液可通过 90 μm 喷嘴以 28 PSI 用作鞘液。
- 调节系统差压，使分选触发速率不超过 2500 事件/秒。
- 将仅含细胞组的细胞悬液上样至 FACS 仪器中运行。
- 首先，根据细胞大小（前向散射光，FSC）与内部复杂性（侧向散射光，SSC）对细胞（事件）进行绘图，以区分不同的细胞群体。为此，应调整 FSC 和 SSC 的电压参数，使细胞在流式细胞术图中可见。
- 为排除细胞团块和双联体，首先以前向散射面积（FSC-A）对前向散射脉宽（FSC-W）作图，圈选单细胞群体作为群体 1（P1）；随后将 P1 细胞以侧向散射面积（SSC-A）对侧向散射脉宽（FSC-W）作图，此次圈选的单细胞定义为群体 2（P2）。通过建立这两个连续门控，可排除细胞团块或双联体（高 FSC 脉宽和高 SSC 脉宽）。
- 为排除死细胞或受损细胞，将单细胞（P2）以前向散射面积（FSC-A）对碘化丙啶（PI）反应性作图，圈选单个活细胞群体。
- 将单个活细胞以前向散射光（FSC）对侧向散射光（SSC）作图，根据细胞大小和内部颗粒度区分不同细胞群体。在此阶段，圈选出两个主要细胞群体：FSClow SSClow（P3）和 FSChigh SSChigh（P4）细胞群体。
- 为从 FSClow SSClow 群体中分选 PSA-NCAM 免疫反应性未成熟神经元细胞，首先将对照组（细胞加 PI 和同型对照）的 FSClow SSClow 群体以 PE 免疫反应性对 FSC-A 作图，圈选阴性细胞（P5）；然后将 PSA-NCAM 染色组的阳性细胞圈选为群体 6（P6）。
- 在调整所有所需门控后，将目标细胞分选至含有 1 ml NSC 培养基的 15 ml 无菌组织培养管中。
- 分选后的细胞在 1200 rpm（240 g）下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于适量体积的培养基中（根据沉淀物大小决定），并进行细胞计数。
- 随后将细胞接种于多聚-L-鸟氨酸包被的 96 孔板中，每孔加入 200–250 μl 含 5% FCS 和 20 ng/ml 人重组 BMP45 的完全 NSC 培养基，细胞密度为 20–30 × 103 个细胞/孔。
注意：包被96孔时，每孔加入100 μl多聚-L-鸟氨酸工作液（1.5 ml Poly-O 和8.5 ml无菌PBS），在37 °C培养箱中孵育至少1小时。随后吸除Poly-O，并用无菌PBS每孔洗涤三次（每次静置10分钟）。若使用24孔板，则每孔使用500 μl多聚-L-鸟氨酸工作液。
- 分选后在不同时间点使用预冷的4%多聚甲醛固定细胞，并对适当的神经元和胶质细胞标志物进行免疫染色，以评估来自不同细胞群体的分选细胞的表型。
6. 代表性结果
在神经母细胞检测（NBA）分化培养中，接种的细胞会贴附于组织培养基质并以单层形式生长。根据初始细胞接种密度的不同，培养物在3-4天后将达到90-95%的融合度。在此阶段，可在显微镜下观察到主要由星形胶质细胞构成的单层细胞层，其上方分布着少量圆形的神经前体细胞4,5（图1）。当培养基更换为无生长因子的培养基后，神经前体细胞在4-5天内迅速分裂，并在星形胶质细胞单层上方形成不成熟神经母细胞的细胞簇（图2）。在分化阶段第4-5天对解离的NBA培养物进行流式细胞术分析，结果显示两个主要的细胞群体：根据细胞大小（FSC）和内部颗粒度（SSC）可分为FSClow SSClow 和 FSChigh SSChigh 群体（图3）。对分选细胞进行免疫荧光分析表明，神经元细胞主要位于FSClow SSClow 群体中（其中超过75%的细胞表达β-III微管蛋白），而来自FSChigh SSChigh 群体的分选细胞则主要为GFAP免疫反应性星形胶质细胞（图4）。通过从FSClow SSClow 群体中对PSA-NCAM免疫反应性细胞进行阳性筛选，可进一步将不成熟神经元细胞纯化至接近均一（97%）的水平（图3, 4）。由E14小鼠纹状体隆起分离的神经干细胞所生成的富集神经元细胞在分化后获得GABA能表型，并表达中等棘状神经元标志物DARPP-32（图5）。
图1. E14小鼠神经干细胞在增殖阶段第4天的神经母细胞检测培养。该单层培养包含位于下方的扁平星形胶质细胞（箭头所示）和位于上方的圆形神经祖细胞（箭头所示）。原始放大倍数：20 ×。
图 2. E14 小鼠神经干细胞在分化阶段第 4 天的神经母细胞检测培养：A) 相差图像，B) 免疫荧光染色。注意在星形胶质细胞单层（A 中的空心箭头，B 中的 GFAP 染色）上方的未成熟神经元细胞簇（A 中的实心箭头，B 中的 β III 微管蛋白染色）。原始放大倍数：20 ×。
图3. 代表性分选图谱：A）。分选前的FSC与SSC图谱，尚未排除双联体和死细胞。B, C）。基于FSC和SSC脉冲宽度排除双联体的分选图谱。D）。基于碘化丙啶（Propidium Iodide）免疫反应性排除死细胞和受损细胞。E）。排除双联体和死细胞后的FSC与SSC图谱，显示两个主要细胞群，分别标记为FSClow SSClow 和 FSChigh SSChigh 群体。F, G）。从FSClow SSClow 群体中分选PSA-NCAM免疫反应性（IR）未成熟细胞的分选图谱。
图4. 分选自不同细胞群、接种后一天的代表性显微图像。A) FSClow SSClow 细胞群（其中超过75%的细胞为神经元）。B) FSChigh SSChigh 细胞群（其中大多数细胞为星形胶质细胞）。C) 从 FSClow SSClow 细胞群中分选的 PSA-NCAM+ 细胞（几乎全部分选细胞均为神经元）。原始放大倍数：20 ×。
图 5. 分选后的未成熟神经元分化为 GABA 能神经元（A），并表达中等棘状神经元标志物 DARPP-32（B）。
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讨论
分离特定神经细胞群体（即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）的能力，可能有助于克服神经干细胞（NSCs）在临床应用中面临的一些障碍。首先，该技术使我们能够全面表征供体细胞的起始群体。其次，可根据疾病性质或病程阶段，选择使用特定类型的细胞，或以特定比例组合使用不同类型的细胞。最后，使用高度富集的预分化神经前体细胞，可显著降低因使用包含真正NSCs的异质性神经前体细胞而可能导致的非可控性增殖和肿瘤形成风险。6通常情况下，神经干细胞的分化会导致5-10%的细胞成为神经元，而超过80%的细胞则分化为星形胶质细胞。采用NBA分化方法，神经元细胞的比例可提高至20-30%，但培养物中仍存在大量星形胶质细胞以及其他干细胞和前体细胞，若研究目标是获取纯化的神经元细胞，则这种情况可能并不理想。 体外 或用于研究其在神经系统疾病动物模型中的治疗效果。在本方案中，我们利用了正在分化的神经干细胞子代细胞在物理特性和荧光特性上的固有差异，以纯化未成熟的神经元细胞5我们的流式细胞术纯化方法可将神经元细胞的比例从20-30%提高到75-97%，且未检测到星形胶质细胞以及未分化的真正神经干细胞和前体细胞。 ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了Overstreet基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC 基础培养基 | 培养基 | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC 增殖添加剂 | 培养基添加剂 | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM 组分 |
| *HEPES | 试剂 | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM 组分 |
| *蒸馏水 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 细胞滤网 | 筛具 | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 培养瓶 | 培养器皿 | Nalge Nunc International | 136196 | |
| T80 培养瓶 | 培养器皿 | Nalge Nunc International | 178905 | |
| 15 ml 离心管 | 培养器皿 | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml 离心管 | 培养器皿 | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | 生长因子 | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | 生长因子 | R&D Systems | 3139-FB | |
| 肝素 | 生长因子 | Sigma-Aldrich | H4784 | 用 PBS 重悬 |
| 抗 PSA-NCAM-PE 抗体 | 抗体 | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE 标记的小鼠 IgG1 | 同型对照抗体 | BD Biosciences | 556029 | |
| 肝素 | 生长因子 | Sigma-Aldrich | H4784 | 用 PBS 重悬 |
| HrBMP-4 | 生长因子 | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| 胎牛血清 | 培养基添加剂 | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| GFAP | 抗体 | Dako | Z0334 | |
| B-III 微管蛋白 | 抗体 | Promega Corp. | G7121 | |
| *配制 HEM：取 1 包 10 L 的 1× MEM 粉末与 160 ml 1 M HEPES 混合，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4°C 保存。 |
参考文献
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457(2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
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