利用侧向层析技术检测血液系统恶性肿瘤患者中的侵袭性肺曲霉病

摘要

介绍了一种用于侵袭性肺曲霉病的快速、准确的即时检测方法。该方法采用侧向层析技术，利用一种特异性单克隆抗体，可结合肺部感染期间分泌的Aspergillus抗原。该检测适用于血清和支气管肺泡灌洗液，是一种新型的辅助诊断工具。

摘要

侵袭性肺曲霉病（IPA）是血液系统恶性肿瘤患者及造血干细胞移植受者发病和死亡的主要原因¹。IPA的检测面临严峻的诊断挑战，在缺乏“金标准”的情况下，需结合临床资料以及可行的微生物学和组织病理学检查进行综合判断。IPA的诊断必须符合欧洲癌症研究与治疗组织和美国国家过敏与传染病研究所真菌病研究小组（EORTC/MSG）达成的共识，该共识定义了“确诊”、“很可能”和“可能”的侵袭性真菌病²。目前尚无经过外部验证的基于核酸的检测方法用于IPA的检测，因此聚合酶链式反应（PCR）未被纳入当前的EORTC/MSG诊断标准中。

由于Aspergillus的菌丝形态与其他侵袭性真菌病原体相似，通过组织学切片鉴定其存在具有困难³，确切鉴定需要从纯培养物中分离出致病菌。基于培养的方法依赖于活检样本的可获得性，但在重症患者中这些样本并不总是能够获取，且即使获得样本，也不一定能够培养出具有活力的繁殖体。

发病机制中的一个重要特征 曲霉属 是血管侵袭性，这一特性使得可通过免疫学方法追踪真菌，利用可检测血清和支气管肺泡灌洗（BAL）液中特征性抗原标志分子的检测技术。这推动了Platelia酶联免疫吸附试验（GM-EIA）的开发，该方法可检测 曲霉属 半乳甘露聚糖以及一种“广谱真菌”检测法（Fungitell检测），该检测可识别真菌细胞壁中保守组分(1→3)-β-D-葡聚糖，但接合菌目真菌因其细胞壁缺乏该组分而无法被检出^1,4. 关于这些检测准确性的相关问题^1,4-6 促进了基于下一代单克隆抗体（MAb）检测感染替代标志物的检测方法的近期发展^1,5.

Thornton⁵最近描述了利用杂交瘤技术生成一种针对Aspergillus的单克隆抗体（JF5），并将其用于开发一种免疫层析侧向流动装置（LFD），以实现侵袭性肺曲霉病（IPA）的即时诊断（POC）。LFD的一个主要优势在于其能够检测真菌的活动性，因为单克隆抗体JF5仅在真菌活跃生长期间分泌的胞外糖蛋白抗原上结合⁵。在使用肺泡灌洗液（BAL）等样本诊断IPA时，这一点尤为重要，因为Aspergillus孢子是吸入空气中常见的成分。该装置在感染动物模型中的诊断效能已得到验证，结果显示，与Platelia GM和Fungitell (1 → 3)-β-D-葡聚糖检测相比，LFD具有更高的灵敏度和特异性⁷。

本文介绍了一种简单的侧向层析检测法（LFD），用于检测人血清和支气管肺泡灌洗液中的Aspergillus抗原。该方法具有快速、准确的特点，可作为血液系统恶性肿瘤患者侵袭性肺曲霉病（IPA）诊断的一种新型即时检测辅助手段。

方案

1. 血清和支气管肺泡灌洗液的采集、保存与制备

1. 通过将未处理的血液样本在 4 °C 下静置凝固，收集血清，并在使用前将血清分装后于 -20 °C 保存。支气管肺泡灌洗液（BAL）也应分装后于 -20 °C 保存。注意：将血清和 BAL 样本分装保存可避免在重复检测过程中因反复冻融而导致目标抗原降解。
2. 解冻样本，通过涡旋振荡充分混匀血清和 BAL 样本，并在 14,000 rpm 下离心 1 分钟。
3. 对于常规人血清样本检测，将血清用组织培养基（TCM）按 1:1（v/v）比例稀释。TCM 由 RPMI-1640 培养基、10%（v/v）胎牛血清、1%（v/v）200 mM L-谷氨酰胺溶液以及作为防腐剂的叠氮化钠（0.02% w/v）组成。该培养基可预先配制，并在 4 °C 下保存数月。取 100 μl 稀释后的血清加入 LFD 检测装置。
4. 对于人源及动物模型来源的 BAL 液，无需预处理，直接取 100 μl 原液加入 LFD 检测装置。
5. 对于动物模型的血清样本，将血清用含 4%（w/v）EDTA 的磷酸盐缓冲液按 1:2（v/v）比例稀释，在沸水浴中加热 3 分钟，于 14,000 rpm 离心 5 分钟，取 100 μl 上清液直接加入 LFD 检测装置。

2. 将血清和支气管肺泡灌洗液应用于侧向层析检测装置

1. 将侧向层析装置置于室温（23 °C）下保存。在此温度下，装置可稳定保存12个月。从包装袋中取出装置，并放置于水平表面上。
2. 使用无菌移液器吸头，向装置的加样孔加入100 μl预处理后的血清或未经稀释的支气管肺泡灌洗液样本。
3. 在室温下让检测反应进行15分钟，此时应记录检测结果。注意：数秒内可在观察窗中看到液体通过毛细作用沿硝酸纤维素膜迁移。

3. LFD 结果的记录与解读

1. 侧向层析试纸条（LFD）包含一条内部质控线（在塑料外壳上以字母 C 标示）和一条检测线（在塑料外壳上以字母 T 标示）。无论血清或支气管肺泡灌洗（BAL）样本中是否存在Aspergillus 抗原，质控线均应出现，表明检测过程运行正常。
2. 若血清或 BAL 样本中存在Aspergillus 抗原，则在加样后 15 分钟内检测线也会出现。由于检测线的强度与样本中Aspergillus 抗原的含量成正比，检测线可表现为弱阳性（+）、中等阳性（++）或强阳性（+++）。然而，无论检测线强度如何，只要出现任何程度的阳性检测线，即表明样本中存在Aspergillus抗原。若样本中无Aspergillus 抗原，则不会出现检测线，结果记为阴性（-）。

4. 代表性结果

支气管肺泡灌洗液和血清样本的LFD检测结果中，阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性的代表性示例如下所示 图1.

根据EORTC/MSG诊断标准确诊为急性髓系白血病（AML）的患者，其支气管肺泡灌洗液（BAL）进行抗原阳性LFD检测（弱阳性与强阳性）或阴性LFD检测的结果如表1所示。该表中还包括每位患者的相应临床和真菌学数据（半乳甘露聚糖和培养结果），以及在圣巴塞洛缪医院开发的Aspergillus特异性PCR检测结果⁸。疾病诊断依据宿主因素（中性粒细胞减少、长期使用皮质类固醇、接受其他已知T细胞免疫抑制剂治疗）、临床标准以及BAL样本中半乳甘露聚糖（GM）阳性（此处定义为GM指数值 > 0.8）。根据2002年EORTC/MSG指南¹⁰，患者12、13和16因存在宿主因素及临床标准或GM阳性，被诊断为“可能的”侵袭性曲霉病（IA）。根据修订后的2008年EORTC/MSG指南²，仅凭宿主因素与GM阳性，或仅凭宿主因素与临床标准，若无临床数据和真菌学方面的支持性证据，则不能诊断为“可能的”侵袭性真菌感染。患者6因存在宿主因素、主要和次要临床特征以及GM阳性，在2002年和2008年指南下均被诊断为“很可能的”IA。需注意的是，尽管LFD和PCR检测目前尚未纳入EORTC/MSG指南，但这两种检测方法与商用半乳甘露聚糖检测结果高度一致，表明患者6和12的BAL样本中存在Aspergillus抗原和核酸。有关LFD和PCR检测在诊断IPA中有效性的更多试验结果可参见Johnson et al⁸。

图1. 使用血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）进行侧向层析检测（LFD）的阴性（仅控制线）和阳性（控制线与检测线均出现）结果。检测线反应强度与血清和BAL样本中目标抗原的浓度成正比。反应强度通常分为弱阳性（+）、中等（++）到强阳性（+++）。无论检测线强度如何，三种血清阳性反应均提示存在侵袭性肺曲霉病，原因是血液中存在循环的Aspergillus抗原。BAL样本中出现阳性反应（弱、中或强）则提示孢子已在肺部萌发，并形成了潜在致病性的菌丝。

患者编号	患者信息	临床标准1	支气管肺泡灌洗液培养2	GM EIA 指数3	EORTC / MSG (2002)4	EORTC / MSG (2008)5	Aspergillus PCR 结果	LFD 结果
6	-	主要CT征象（结节和晕轮征）及一项次要征象	阴性	0.9（阳性）	拟诊	拟诊	阳性	弱阳性 (+)
12	疑似既往真菌感染	无主要征象，一项次要征象	Candida glabrata	6.43（强阳性）	可能	无	阳性	强阳性 (+++)
13	血液中检出凝固酶阴性Staphylococcus和E. coli	无主要征象，两项次要征象	阴性	0.25（阴性）	可能	无	阴性	阴性 (-)
16	肺部感染	三项次要标准，包括新发浸润影合并胸腔积液	阴性	0.16（阴性）	可能	无	阴性	阴性 (-)

¹ 计算机断层扫描（CT）中出现结节或晕轮征提示可能存在真菌感染
² 支气管肺泡灌洗液（BAL）中检出Candida glabrata通常被视为污染菌，因其是人体正常菌群中第二常见的酵母菌^9
3 BAL样本的GM EIA试验指数＞0.8提示存在Aspergillus感染
⁴ 根据2002年EORTC/MSG关于“可能”、“很可能”或“确诊”侵袭性真菌病的诊断标准^10
5 根据2008年修订的EORTC/MSG关于“可能”、“很可能”或“确诊”侵袭性真菌病的诊断标准²

表1. 急性髓系白血病患者支气管肺泡灌洗液样本的LFD检测结果，包括疑似侵袭性肺曲霉病（IPA）患者和对照组急性髓系白血病患者（无感染证据），以及EORTC/MSG对感染的诊断结果。

讨论

只有通过从活检样本中分离出致病病原体，才能真正实现对侵袭性肺曲霉病（IPA）的明确诊断，但在病情严重的患者中，往往难以获取合适的样本。 曲霉属 从血液中极少能分离出该病原体。尽管在侵袭性肺曲霉病（IPA）诊断中，胸部计算机断层扫描已取得重大进展，但提示肺部IPA的特征，如“晕轮征”或“空气新月征”，要么是短暂出现的，要么可能归因于呼吸伪影或其他真菌感染。^11,12因此，需结合血清学技术来检测患者血清中循环的真菌特异性分子标志物（GM和β-葡聚糖），或检测支气管肺泡灌洗液、痰液或尿液样本中的此类成分¹³尽管这些检测方法具有令人满意的灵敏度，但其特异性不足，或在某些条件下易受干扰^1,6.

本文所述用于检测侵袭性肺曲霉病（IPA）的侧向流动检测（LFD）试纸条技术，可实现IPA的“即时检测”诊断，其所采用的技术迄今已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫和毒素的检测^14-19，其中最为人熟知的是1988年由Unipath公司首次推出的家用妊娠检测试纸。在本研究所描述的Aspergillus LFD中，特异性针对Aspergillus的单克隆抗体JF5被固定在多孔硝酸纤维素膜上的捕获区（即检测线）。另一区域则固定有抗小鼠免疫球蛋白，作为检测的内部对照（对照线）。当将血清或支气管肺泡灌洗液（BAL）加入释放孔后，释放垫中的JF5单抗-胶体金结合物会与目标抗原结合，该复合物随后通过毛细作用沿多孔膜迁移。固定在捕获区的JF5单抗可特异性结合JF5-胶体金-抗原复合物，从而形成一条红色的检测线。任何未结合的JF5-胶体金结合物则会与内部对照线结合，表明该检测已正常运行，从而产生一条红色的对照线。

该检测快速，仅需15分钟即可完成，相较于基于GM和β-葡聚糖检测的血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）检测成本更低，且无需昂贵的设备或复杂的实验室设施即可开展。此外，单克隆抗体JF5不会与已知在GM和β-葡聚糖检测中引起假阳性反应的药物或污染物发生交叉反应^1,4,6。相较于现有的诊断方法，该侧向流动试纸条（LFD）另一项重要优势在于其能够检测出提示曲霉菌属（Aspergillus）侵袭性生长的活性。

LFD 检测过程中的一个关键步骤是，在将血清或支气管肺泡灌洗液（BAL）样本加入检测装置后15分钟内必须读取结果。不应在超过15分钟后才记录结果，否则可能导致结果判读偏差。延长孵育时间不会增强弱反应信号。研究发现，对感染动物模型的血清进行热处理可提高检测的灵敏度。该检测的一个局限性在于其为定性检测，依赖操作者主观判断阳性结果。检测线的强度随血清和 BAL 样本中抗原含量的不同而变化（图1）。然而，任何阳性反应（通过与已知阴性样本比较确定）均表明存在Aspergillus抗原，从而提示感染。为减少LFD检测的主观性，目前已可使用手持式设备，可对LFD检测线强度进行定量分析，并建立抗原检测的阈值标准²⁰。

LFD 未来的开发包括其商业化，以及开发一种多重 LFD，该检测方法可利用高度特异性的单克隆抗体（MAbs）³ 同时检测其他侵袭性真菌病原体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aspergillus LFD	埃克塞特大学		可向通讯作者申请获取
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
胎牛血清	Biosera	S9100	制备完全培养基时可使用其他来源的胎牛血清
EDTA	赛默飞世尔科技	BPE120-1