Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Christopher Thornton; Gemma Johnson; Samir Agrawal

doi:10.3791/3721

Summary

提出了一种快速，准确点保健侵袭性肺曲霉病的试验。侧流技术的优势，使用绑定到一个特定的单克隆抗体

Abstract

侵袭性肺曲霉病（IPA），是一种在血液系统恶性肿瘤患者造血干细胞移植¹的发病率和死亡率的首要原因。检测的"近期行动计划"表示诊断的一项艰巨的挑战，并在一个'黄金标准'的情况下，结合临床资料和微生物学和病理学在可行的情况下依靠。 IPA的诊断必须符合欧洲组织的研究和治疗癌症和美国国立过敏和传染病真菌研究组（EORTC / MSG）的定义"证明"，"可能"，"可能"侵入真菌病害的共识研究所。目前，没有核酸为基础的测试外部被验证为"近期行动计划"的检测和聚合酶链反应（PCR），不包括在当前EORTC /味精的诊断标准。

曲霉鉴定组织切片是问题，因为西米在与其他侵袭性真菌病原体^3，证明鉴定菌丝形态larities需要隔离在纯培养的病原体。依靠活检标本的可用性文化为基础的方法，但这些都不是生病的病人总是访问，并不总是可行的繁殖产生的文化时获得。

曲霉发病的一个重要特征是血管的入侵，提供机会跟踪真菌免疫试验检测血清和支气管肺泡灌洗（BAL）流体的特性抗原签名分子的一个特点。这导致的发展的Platelia酶免疫（GM-EIA）的检测曲霉半乳甘露聚糖和"泛真菌检测（Fungitell测试）检测保守的真菌细胞壁成分（1→3）-β-D葡聚糖，而不是在缺乏这种成分在细胞壁^1,4毛霉菌。是起诉周围这些测试的准确性^1,4-6已导致最近开发的新一代单克隆抗体（MAB）为基础的检测^1,5感染的替代指标的检测。

桑顿⁵最近一个曲霉特异性抗体（JF5）的产生，利用杂交瘤技术，其开发利用免疫色谱横向流动设备，点照护（POC）诊断为"近期行动计划"（LFD）。一个LFD的主要优点是它能够探测到活动以来单克隆抗体JF5只有⁵木耳的积极增长过程中分泌到细胞外的糖蛋白抗原结合。这是一个重要的考虑因素，如肺灌洗诊断"近期行动计划"，自曲霉菌孢子的吸入空气的共同组成部分时，使用的液体。该设备在诊断"近期行动计划"的效用已被证实感染的动物模型，利丰显示改善的敏感性和规范ificity相比的Platelia通用和Fungitell（1→3）β-D-葡聚糖检测^7。

在这里，我们提出了一个简单的LFD的过程曲霉抗原检测人体血清和BAL液。它的速度和准确性在血液系统恶性肿瘤患者的近期行动计划"的诊断提供了一种新的辅助测试点照顾。

Protocol

1。血清和支气管肺泡灌洗液的收集，存储和制备

收集血液凝固允许在4°C和分装血清于-20°C间商店使用前未经处理的血液样本血清。支气管肺泡灌洗液（BAL），也应在-20°C储存为等分注:存储血清和BAL等分限制为靶抗原的降解样品反复冻融过程中重复检测的潜力。
解冻样品和血清和BAL样本彻底涡旋混合1分钟14,000转的离心机。
对于常规检测人血清样品，稀释血清与组织培养基（中医）1:1（V / V）。中医组成的RPMI-1640培养基，10％（V / V）胎牛血清，1％（V / V）为200mm L-谷氨酰胺的解决方案，和叠氮化钠作为防腐剂（0.02％W / V）。中期提前做好准备，可在4°C保存几个月。适用于100μL的dilut编辑血清对LFD的。
为人类灌洗液，从动物模型灌洗的液体，适用于100μL整齐的样品利丰，没有预先处理。
从动物模型的血清，稀释1:2（V / V）的血清磷酸盐缓冲液含4％（W / V）EDTA在沸水浴中，在14000转离心5分钟，3分钟热，适用于100微升利丰设备整齐上清。

2。血清和BAL的横向流动装置中的应用

储存在室温（23℃）的横向流动装置。在此温度下，设备的稳定，为12个月。删除设备，从他们的邮袋和水平表面的地方。
使用无菌枪头，适用于100微升血清或利落的BAL样本前处理设备释放端口。
允许试验，运行15分钟，在室温下，当时的测试结果应记录。注:流体在几秒钟内将是SEEN迁移一直在观察窗的硝酸纤维素膜的毛细作用。

3。 LFD的结果记录和解读

利丰组成的内部控制线（塑料外壳上的字母C表示）和测试线（由字母T表示）。控制线应始终出现，不论曲霉菌抗原在血清或BAL样本。这表明，该法已正常运行。
曲霉抗原的血清或BAL样本中，检测线也将出现在15分钟的示例应用程序。因为测试线的强度是曲霉抗原目前在样品量成正比，检测线可出现弱阳性（+），中度阳性（+ +）或作为一个强大阳性（+）。然而，任何积极的测试线，无论强度，表明曲霉样品中的抗原存在。在日E的黑曲霉抗原的情况下，没有检测线就会出现，并把结果为阴性（ - ）记录。

4。代表结果

代表性的例子是阴性，弱阳性，中度阳性，强阳性，BAL和血清样品LFD的结果如图1所示。

抗原阳性LFD的测试（强和弱）或急性髓细胞性白血病（AML）患者的诊断，根据EORTC /味精诊断标准灌洗流体的负面LFD的测试结果如表1所示。包括在本表中有相应的临床和真菌学（半乳甘露聚糖和文化）的数据，和曲霉菌特异性PCR在圣Bartholomews医院⁸开发的测试，为每一个病人的结果。对疾病的诊断是基于宿主因素（嗜中性白血球减少症，长期使用糖皮质激素治疗，与其他公认的T细胞immunosuppressants），临床标准和通用的灌洗阳性（这里定义为通用指标值> 0.8）。根据2002年EORTC /味精指引¹⁰ 12，13和16，患者被诊断为"可能"的宿主因素和临床标准或通用的积极性的基础上的保险业监督。根据修订（2008）EORTC /味精的指导方针^，宿主因素和转基因阳性单独或宿主因素和临床标准将不会显示"可能"侵入性真菌感染，除非陪同下，分别从临床数据和真菌的证据支持。 6患者被诊断为"可能"保险业监督在2002年和2008年的指引，因为主机的因素，主要和次要的临床特点和转基因阳性。注，而利丰也不PCR检测既不是目前在EORTC /味精指引，有两个实验和商业半乳甘露聚糖试验表明曲霉抗原和核酸中存在的BAL样本之间的强有力的协议 6例和12 S的。试验证明疗效的利丰和PCR检测诊断国际音标额外的结果，可以发现⁸约翰逊等人。

图1负（仅控制线）和阳性（控制和测试线）利丰测试使用血清和BAL结果。测试线反应的强度是成正比的靶抗原在血清和BAL样本的浓度。反应通常从弱（+），通过适度的（+），以强（+）。无论测试线强度，所有三个血清阳性反应，表明侵袭性肺曲霉病，由于曲霉抗原在血液中循环的存在。灌洗反应阳性（弱，中度或强）表示可能在肺部的致病性菌丝萌发的孢子和发展。

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病人没有。	帕蒂耳鼻喉科信息	¹临床标准	灌洗文化²	通用汽车环境影响评估指数³	EORTC / ^{MSG（2002）4}	EORTC / ^{MSG（2008）5}	曲霉 PCR检测结果	LFD的结果
6	-	主要CT征象（结节和光环）和一个小	负	0.9（正面）	可能	可能	积极	弱阳性（+），
12	假定以前的真菌感染	没有大的，一个小	光滑念珠菌	6.43（强阳性）	可能	没有	积极	强阳性（+ +）
13	凝固酶阴性葡萄球菌ylococcus和E。大肠杆菌在血液中	没有大的，两个未成年的	负	0.25（阴性）	可能	没有	负	负（ - ）
16	肺部感染	3次要标准，包括新的渗透，加上复数积液	负	0.16（阴性）	可能	没有	负	负（ - ）

¹结节或晕在电脑断层扫描，提示真菌感染
BALF中光滑念珠菌将被视为污染物，因为它是第二个最常见的酵母作为正常人体菌群的一部分分离
³指数> 0.8在通用环境影响评估测试灌洗是曲霉菌感染的指标
⁴基于2002年EORTC /味精诊断标准"possiblE'，'可能'或'证明'侵袭性真菌病¹⁰
⁵的基础上修订（2008）EORTC /味精诊断标准"可能"，"很可能"或"证明"侵袭性真菌病²

表1。BAL样本，可能近期行动计划"，并从控制AML患者（没有证据表明感染）急性髓细胞性白血病患者，LFD的测试和EORTC /味精感染的诊断结果。

Discussion

我们什么都没有透露。

Disclosures

提出了一种快速，准确点保健侵袭性肺曲霉病的试验。侧流技术的优势，使用绑定到一个特定的单克隆抗体

Acknowledgements

辉瑞制药有限公司资助博士桑顿表示感谢。

Materials

试剂名称	公司	目录编号	评论
黑利丰	埃克塞特大学		可从相应的要求作者
的RPMI-1640	西格玛	R0883
L-谷氨酰胺	西格玛	G7513
胎牛血清	biosera	S9100	在中药制剂，可用于其他来源的胎牛血清
EDTA的	Fisher Scientific则	BPE120-1

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通过横向流技术检测在血液系统恶性肿瘤患者侵袭性肺曲菌病