从小份人血样本中单核细胞和树突状细胞谱系特异性Toll样受体介导信号通路的定量成像

摘要

我们介绍了ImageStream技术（www.amnis.com）的应用，该技术结合了定量流式细胞术与同步高分辨率数字成像，用于量化来自明确定义的患者队列的原代免疫细胞的细胞机制。我们的研究为转化研究提供了蓝图，可用于量化来自受试者队列小样本中谱系特异性的细胞反应。

摘要

免疫状态的个体差异决定了机体对感染的反应，并影响疾病的严重程度和结局。随着年龄增长，机体对病毒和细菌感染的易感性增加，对疫苗的应答能力下降，这与体液免疫和细胞介导免疫反应的显著衰退密切相关^1,2。我们近期研究了衰老对Toll样受体（TLRs）的影响，TLRs是先天免疫系统的关键组分，能够识别微生物感染并启动宿主抗微生物防御反应³。在一项针对大量健康人类供体的研究中，我们发现老年人外周血单核细胞中某些TLRs的表达和功能降低⁴，且树突状细胞（DCs）中也存在类似的TLR水平下降和信号转导反应减弱；树突状细胞作为抗原呈递细胞，在连接先天性免疫与适应性免疫中起关键作用⁵。我们还发现，老年供体来源的巨噬细胞中TLR3表达失调，其树突状细胞在西尼罗河病毒感染后产生干扰素（IFN）的能力降低^6,7。

深入了解免疫衰老以及进行治疗干预的关键在于，明确响应免疫刺激的特定细胞类型及其信号转导机制。传统的免疫反应研究主要依赖于对原代细胞的成像分析，以及通过流式细胞术（FACS）或免疫印迹法检测细胞标志物，这些方法极大地推动了该领域的进展。然而，这些技术通常受限于患者样本量较小，且难以在多个个体样本上同时开展复杂的实验操作。ImageStream 技术结合了定量流式细胞术与同步高分辨率数字成像，从而能够同时分析多个细胞群体，高效地捕捉患者的免疫易感性差异。本文中，我们展示了利用 ImageStream 技术在树突状细胞（DCs）中评估 TLR7/8 激活所诱导的关键转录因子 NF-κB 的磷酸化水平升高及其向细胞核的转位过程，该过程可启动多种对免疫应答至关重要的基因转录⁸。利用该技术，我们近期还发现老年供者单核细胞中 TLR5 信号通路及 NF-κB 通路存在此前未被识别的功能改变，这可能与衰老过程中免疫应答能力的改变有关⁹。

方案

1. 免疫细胞的分离与刺激

1. 根据当地机构审查委员会的指南，在获得健康志愿者书面知情同意后，采集10-50 ml肝素抗凝血。对于衰老或疾病发病机制的研究，必须明确界定每位志愿者或患者的纳入与排除标准。
2. 使用CPT管或Ficoll-Paque Plus分离人外周血单个核细胞（PBMCs），操作按照制造商说明进行（GE Healthcare, NJ），并在分离当天进行实验⁷（试剂，表1）。
3. 将PBMCs（每管3 × 10⁶个细胞）置于1.5 ml离心管中，加入0.6 ml培养基单独孵育，或用TLR配体或其他激活剂刺激，例如TLR7/8配体R848（0.6 ml培养基加0.6 μl 10 mM TLR7/8配体R848，终浓度为10 μM），于37 °C孵育10-60分钟（InvivoGen, CA）⁹。

2. 细胞标记

1. 使用荧光标记的抗体对活细胞悬液中的细胞谱系及其他表面标志物进行标记。在1.5 ml离心管中，将3 × 10⁶个PBMCs与针对单核细胞或树突状细胞谱系的表面抗体混合物（表2）在100 μl PBS/2% FBS中于4 °C孵育20分钟。最佳抗体稀释度可通过预实验确定，样品应成批处理以尽量减少批间差异。对于浓度为0.1 mg/ml的供应商抗体原液，使用5 μl抗体（1:20稀释）。另设单独的细胞管，仅用单一荧光标记抗体染色，用于设定仪器的荧光通道。
2. 表面标记完成后，在室温下用4%多聚甲醛（PFA）/PBS固定细胞10分钟。若需在分析前储存样品，则在500 × g条件下离心细胞，用冻存缓冲液（含10% DMSO的90% FBS）重悬，并于-80 °C保存至检测当日。
3. 为进行评估，应将一组供体来源的未处理和刺激处理的细胞成批同时处理，以最小化实验变异性。在检测当天，将细胞在37 °C水浴中快速解冻，于500 × g离心以去除冻存缓冲液。
4. 为通透细胞以检测细胞内细胞因子或其他标志物，将细胞悬液重悬于100 μl BD Perm/Wash缓冲液（BD Biosciences, NJ）中。使用例如1:20稀释的兔抗NF-κB（p65）抗体（终浓度10 μg/ml，SantaCruz Biotechnology, CA）在室温下孵育20分钟标记细胞内信号分子；随后在500 × g离心，吸除上清液，并将细胞重悬于含1:250稀释的山羊抗兔IgG-Alexa647（Invitrogen, CA）的100 μl BD Perm/Wash缓冲液中，室温孵育20分钟。
5. 成像前立即用DAPI（0.2 μg/ml，Invitrogen, CA）或碘化丙啶（PI；20 ng/ml，Invitrogen, CA）对细胞核进行复染。

3. ImageStream 分析

1. 使用 ImageStream 对批量样本进行成像，以减少人源样本之间的变异性。激光器功率的仪器设置如下：488 nm 激光为 200 mW，658 nm 激光为 10 mW，405 nm 激光为 250 mW。
2. 为分析数据文件（图 1），首先对具有正常 PI 强度和高 PI 长宽比（宽度：高度比）的事件设门，以将单细胞（R1）与碎片（PI 强度低）或多细胞事件（PI 强度高且长宽比低）区分开来。单核细胞位于 CD14 阳性细胞的设门范围内。mDCs 位于 CD11c 表达高、CD4 表达低（R2）且 Lin-1 标记物表达低（R3）的细胞设门范围内。
3. 使用 IDEAS 软件（Amnis, WA）对每个细胞的活化程度进行有效的定量评估。通过检测细胞质转录因子 NF-κB 与核染料 PI 的共定位（或相似性），判断其向细胞核的转位情况（R4）。NF-κB 与 PI 定位的高度相关性表现为较高的相似性评分，反映细胞活化程度¹⁰。
4. 比较不同处理组或患者群体之间的相似性比率，以评估细胞相对功能效率。通过绝对值或倍数差异的统计学比较，对样本间数据进行量化。使用 IDEAS 软件显示来自群体直方图关键区段的细胞图像（图 2）。

4. 代表性结果

我们通过使用TLR7/8配体R848刺激外周血单个核细胞（PBMCs），量化了对一种模型病毒配体的信号通路反应（图1）。我们在样本组中同时采集了细胞定位图像和群体统计学数据（图2）。ImageStream技术使我们能够直接从PBMCs中设门分选细胞亚群，并对设门后但未分选的细胞群体进行细胞反应成像。本文中，我们量化了TLR信号对Lin1-、CD4弱表达、CD11c+髓系树突状细胞（mDCs）中NF-κB（p65）核转位的影响。在基础状态下，我们观察到大量未刺激细胞中的转录因子NF-κB（p65）位于细胞质中。刺激后，处理组细胞中NF-κB（p65）与核染料PI的相似性评分显著升高，表明NF-κB（p65）在刺激后转入细胞核（中位相似性评分分别为1.52和3.01，图2）。在TLR5刺激的单核细胞中也观察到类似结果⁹。

图1. 染色与设门策略用于量化刺激对人源mDCs的影响。NF-κB转录因子调控多种免疫系统相关基因的表达。本研究检测了一名代表性受试者在TLR7/8配体刺激后，mDCs中NF-κB（p65）的核转位情况。通过选择PI阳性且核长宽比高的单个在焦细胞事件进行设门（R1）。mDCs（Lin1-、CD4dim、CD11c+）在R3区域设门。NF-κB（p65）的核定位结果在R4中展示。点击此处查看高清大图。

图 2. 刺激后 mDCs 中 NF-κB 的转位。 图示未处理与刺激后 mDCs 群体中 NF-κB（p65）在刺激后（R4）转入细胞核的情况；未处理样本的中位相似性评分为 1.52，刺激样本为 3.01（A）。同时采集的未处理或 R848 刺激细胞群体的数字图像显示了代表性细胞及 NF-κB 转入细胞核的荧光强度（B）。 点击查看大图。

讨论

在使用ImageStream进行转化研究时，关键步骤包括选择相关的对照组，以及优化和验证抗体的特异性。通过直方图和细胞图像，可以清晰地观察到不同受试组之间标记靶标的差异。结合对相关受体和信号通路变化的深入分析，这些数据将为特定人群中免疫失调机制提供有价值的见解。该技术的局限性在于针对特定靶标、具有足够亲和力的特异性抗体的可获得性。此外，该仪器最适合多用户共享平台使用，且其分析软件需要一定时间才能熟练掌握。

该技术是人类疾病转化研究的一种强大手段。基因组测序和芯片技术的进步使得许多疾病相关变异得以被识别，但通常难以明确所涉及基因的作用机制。我们的研究为个体层面的转化研究提供了范例，例如刺激后NF-κB的核质分布比例分析。通过少量血液样本，即可在个体自身细胞中以谱系特异性的方式识别出差异性信号处理或信号传导。利用该方法，我们已对大量年轻与老年受试者的单核细胞进行了细胞反应的定量分析，并证实了衰老过程中细胞信号通路的改变⁹。ImageStream技术可更广泛地应用于多种研究场景，例如区分治疗应答者与非应答者的关键细胞机制，或用于个体在治疗前后的比较，以及疾病发作期与...