清醒小鼠的制备以记录神经反应和注射示踪剂

摘要

神经元反应的电生理表征对于理解脑功能以及指导通路示踪染料的放置具有重要意义。然而，许多研究是在麻醉动物中进行的。为了在无麻醉条件下理解脑功能，我们建立了一种在清醒小鼠中记录神经元反应特性并注射染料的方法。

摘要

众所周知，麻醉会显著改变大脑多个区域神经元的反应特性¹³。在听觉系统中，脑干神经元的基本反应特性，如阈值、频率特异性以及抑制性侧带，在麻醉状态下均会发生显著变化^1-2。这些发现促使生理学家寻求在不受麻醉干扰的情况下记录单个神经元活动的方法。其中一种方法是采用去大脑准备，即在中脑水平完全横断脑干⁴。该方法的缺点包括手术难度大、前脑下行投射被消除，以及无法利用感觉刺激来研究中脑以上的结构。另一种策略是长期植入电极阵列，以在动物清醒和/或行为状态下记录单个神经元和多单元簇的活动^5,6。然而，这些技术无法在首先通过电生理学手段对脑区进行表征后，再注射示踪染料。为了在记录单个神经元电生理反应特性的同时避免麻醉剂对神经反应特性的影响，我们借鉴了长期以来在蝙蝠中使用的一种头部固定技术^7-9，并将其应用于小鼠^10-12。利用该方法，我们能够在未麻醉的小鼠中进行持续数天的电生理记录。在记录结束后，我们可以注射染料以重建电极位置和记录位点，或注射示踪剂以确定记录位点的输入和输出通路。该方法实现了在多天内对单个神经元进行良好分离的记录，且无需使用麻醉剂。

方案

1. 头部固定概述

1. 组装定制的头柱时，将一根1/16英寸的不锈钢卷销垂直插入一根3/32英寸不锈钢杆上钻好的孔中，形成一个十字结构。头柱的垂直部分长度约为20 mm，水平横杆部分约为15 mm。在垂直杆的一端攻丝，以安装一颗#1-72螺钉。（图1）。
2. 在手术和记录过程中，头柱通过一颗#1-72螺钉固定在定制的黄铜或铝制安装条上（图2）。安装条的长段部分长度约为90 mm，宽度为5–10 mm。头柱插入安装条长段一侧延伸出的15 mm长、呈45度角的凸起部分上的凹槽中。为防止头部旋转，头柱的横杆部分嵌入安装条底部的一个小凹槽内。
3. 将安装条固定在定制的铝制安装块上（图3）。安装块尺寸约为30 mm × 30 mm × 25 mm。该安装块通过螺丝连接两部分组成，其中一块设有切口，允许安装条滑入并通过螺丝固定。安装块可连接至微操作器，以便精确地将头柱定位在中线位置及Bregma点。安装条与实验台表面保持平行。在记录过程中，将安装条固定于定制的立体定位架上（图4）。该立体定位架的设计可使安装条在记录时的位置与手术期间在安装块中的位置完全一致，从而确保小鼠在不同实验会话中始终与立体定位架对齐。
4. 截取一段直径为0.010英寸的....

讨论

头固定限制系统在小鼠电生理学和神经解剖学实验中的优势在于，可在未麻醉的清醒小鼠中进行实验，从而避免了麻醉药物可能带来的反应干扰。此外，该装置可在多天内重复使用，有助于更高效地利用实验动物。

头固定装置的大部分组件均可直接购买。只有头固定装置和安装装置需要定制，但这两部分都相对容易制作，并且可重复使用。如果所在机构没有机械加工车间，研究人员可以考虑使用http://www.emachineshop.com/来加工所需组件。

熟练的外科手术技能是必要的。外科医生必须精通精细的外科技术，其中一些操作最好在显微镜下完成。手术必须在无菌条件下进行。去除颅骨瓣是该手术过程中最精细的环节。通过在手术显微镜下观察，用手术刀沿矩形四边仔细而轻柔地多次划痕，可使颅骨瓣“弹脱”，出血极少，同时保持硬脑膜完整。熟悉下方的血管分布至关重要，因为在主要血管上方切割可能导致不必要的出血风险。由于我们的研究聚焦于听觉系统，因此我们避免使用钻头.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蚀刻凝胶，用于牙科水泥粘接前清洁颅骨	Henry Schein	101-5396	12支/包，含1.2 mL注射器
底涂剂，用于牙科水泥	Kerr Optibond	25881	8 mL瓶装
粘接剂，用于牙科水泥	Kerr Optibond	25882	8 mL瓶装
涂敷工具，用于牙科水泥	Kerr Optibond	24680	200支/包
牙科水泥	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4克注射器补充装
钨棒（接地针）	A-M Systems	717200	直径0.010"
经济型紫外固化灯	Henry Schein	CU-80
头固定柱	自制
安装杆	自制
安装块	自制
立体定位仪	David Kopf Instruments	902
小鼠和新生大鼠适配器	Stoelting Co.	51625
DeltaPhase等温垫	Braintree Scientific, Inc.	39DP