本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。
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摘要
摘要
胚胎干细胞（ESC）具有两个主要特征：可无限传代扩增 体外 处于未分化状态，具有多能性，因此能够分化为多种细胞谱系。这些特性使胚胎干细胞在细胞治疗和再生医学应用中极具吸引力 1然而，要实现其全部潜力，必须将细胞分化为成熟且具有功能的表型，这是一项艰巨的任务。一种诱导细胞分化的有前景的方法是紧密模拟器官发生过程中的路径 体外 环境。已知胰腺发育以特定阶段进行 2，始于内胚层，内胚层可发育为多种器官，包括肝脏和胰腺。通过添加激活素A调节Nodal信号通路，可实现内胚层诱导 3 联合多种生长因子 4-7定形内胚层细胞随后通过抑制音猬因子（sonic hedgehog）信号通路实现向胰腺谱系的定向分化，该抑制作用可通过以下方式实现 体外 通过添加环杷明 8胰腺成熟由多个并行事件介导，包括抑制 Notch 信号通路、胰腺前体细胞聚集成三维细胞簇、血管化诱导等。迄今为止，最成功的方法 体外 通过添加DAPT抑制Notch信号通路，已实现由胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞的成熟 9尽管如此，这种方法获得的成熟表型产量较低，且功能有所下降。较少被研究的领域是内皮细胞信号在胰腺成熟中的作用，而该作用正逐渐被视为体内胰岛成熟的重要影响因素。 10,11.
本研究探讨了内皮细胞信号在人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞向胰岛样胰岛素生成细胞成熟过程中的作用。我们报道了一种多阶段定向分化方案：首先，通过激活素A（Activin A）联合抑制PI3K通路，将人胚胎干细胞诱导为内胚层；随后，通过环杷明（Cyclopamine）抑制音猬因子（sonic hedgehog）信号通路，并添加视黄酸（Retinoic Acid）以诱导视黄酸通路，实现内胚层细胞向胰腺特化的定向分化；最后，通过共培养体系介导的内皮细胞信号诱导细胞进入最终成熟阶段。尽管在共培养中已测试了多种内皮细胞，但本文主要展示与大鼠心脏微血管内皮细胞（RHMVEC）共培养的结果，主要基于分析的便利性。
方案
1. 细胞培养
- 人胚胎干细胞H1系（WiCell）在经hESC级Matrigel包被的培养孔中，使用mTeSR1培养基进行培养，每日更换培养基。Matrigel包被液的制备方法为：将300 μl hESC级Matrigel加入25 ml DMEM:F12中稀释。每孔六孔板加入1 ml该Matrigel溶液，或每孔十二孔板加入400 μl，室温孵育1小时以完成包被。当细胞集落直径达到1至1.5 mm时，以1:4的传代比例通过机械刮取方式进行传代。
- 人微血管内皮细胞（RHMVEC，VEC technologies）在MCDB-131培养基中培养，每隔一天更换一次培养基。当细胞融合度达到80%时，以1:3的传代比例通过胰酶消化法进行传代。本研究使用第3至第7代的内皮细胞。
2. 储备液的配制
- 将 Activin A 溶于含 0.1% 牛血清白蛋白的无菌 PBS 中，配制成 50 μg/mL 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。
- 将 EGF 溶于无菌 10 mM 乙酸中，配制成 500 μg/mL 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。
- 将胰岛素加入酸化 H2O（pH ≤2）中，配制成 10 mg/mL 的溶液；酸化水的制备方法为：将 0.1 ml 冰乙酸加入 10 ml 水中。
- 将 DAPT 溶于 DMSO 中，配制成....
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讨论
在胰腺发育过程中，分化中的胰腺细胞与来自主动脉的内皮细胞紧密相邻；此外，胰岛组织具有高度血管化特征，以促进血糖与胰岛激素的快速交换。鉴于这些事实，内皮细胞在胰腺器官发生过程中发挥重要作用也就不足为奇了。尽管内皮细胞在胰腺发育中的重要性正日益受到重视，但其在 体外 胚胎细胞的分化研究较少。在我们先前的报告中，我们证实了内皮细胞对小鼠胚胎干细胞胰腺成熟具有促进作用 13在本研究中，我们探讨了内皮细胞信号对人胚胎干细胞分化的影响。
本方案中使用了多种内皮细胞，尽管其分化效率存在差异，但总体效果相似。在本报告中，我们展示了人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞与大鼠心脏微血管内皮细胞（RHMVEC）共培养的效果。内皮细胞可通过乙酰化低密度脂蛋白（AC-LDL）染色进行方便地识别，该染色仅特异性地标记内皮细胞。将正在分化的胚胎干细胞与预先染色的内皮细胞共培养后发现，尽管大多数内皮细胞在培养中长期保持存活，但RHMVEC在培养4天后逐渐消失，至成熟培养第6天时已无法检测到。由于RHMVEC的消失简化了后续分析，避免了细胞分选的需要，因此本研究选择该细胞系用于共培.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院新创新者奖 DP2 116520 和橡树岭联合大学拉尔夫·鲍威尔青年教师提升奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| mTeSR1（含补充剂） | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| 适用于人胚胎干细胞的Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131（完全培养基） | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27补充剂 | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | 100 ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamine | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| 全反式维甲酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| 亚硒酸钠 | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | 10 ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10 mg |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey-Nagel | 740955 | |
| ImProm II 反转录系统 | Promega Corp. | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR 预混液 | Stratagene, Agilent Technologies | 600548 | |
| Sox17 山羊多克隆 IgG | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 山羊多克隆 IgG | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-14662 | 1/500 |
| C-肽 兔多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 驴抗山羊 IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
| 表2. 试剂与试剂盒 |
参考文献
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A.
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