TransFLP — 一种基于自然转化和FLP重组的对Vibrio cholerae进行遗传修饰的方法

摘要

本文介绍了一种快速修饰V. cholerae基因组的方法。这些修饰包括单个基因、基因簇和基因组岛的删除，以及短序列（如启动子元件或亲和标签序列）的插入。该方法基于自然转化和FLP重组技术。

摘要

目前已有多种方法可用于操纵细菌染色体^1-3。这些方案大多依赖于条件型复制质粒的插入（例如含有依赖pir基因或温度敏感型复制子的质粒^1,2）。这类质粒通过同源重组介导整合至细菌染色体中。此类插入突变体通常可直接用于实验研究。或者，也可通过筛选质粒的切除并使其丢失来实现基因改造，该策略在革兰氏阴性菌中常利用由sacB基因编码的反向选择性酶——果聚糖蔗糖酶来实现⁴。质粒切除后可能恢复插入前的原始基因型，也可能导致染色体与质粒上携带的修饰基因拷贝之间发生置换。该技术的一个缺点是耗时较长：首先需要克隆质粒；随后需通过接合（最常见的是与E. coli供体菌株交配）或人工转化的方式将其水平转移至V. cholerae中；此外，在无正向选择压力的情况下，质粒的切除是随机事件，可能恢复原始基因型，也可能产生目标修饰。本文介绍一种快速操纵V. cholerae染色体⁵的方法（图1）。该TransFLP方法基于近期发现的几丁质介导的该生物体自然感受态诱导机制⁶，以及弧菌属（Vibrio）其他代表性物种如V. fischeri⁷中的类似现象。自然感受态使得细胞能够摄取游离DNA，包括PCR扩增产生的DNA片段。一旦被摄入，只要存在至少250–500 bp的侧翼同源区域，DNA即可与染色体发生重组⁸。在两侧同源区域之间引入筛选标记，可便于频繁出现的转化子的筛选与鉴定。

该方法可用于对V. cholerae进行多种遗传操作，并可能同样适用于其他天然感受态细菌。除我们先前发表的单基因缺失和添加亲和标签序列的研究⁵外，本文还提供了三个利用该方法实现的新示例。本TransFLP方案整合了对几丁质诱导自然转化初始方案⁶的多项优化步骤，其中包括以商业化几丁质薄片替代蟹壳碎片⁸、使用PCR扩增产物作为转化DNA供体⁹，以及引入FLP重组靶点（FRT）序列⁵。FRT位点可介导Flp重组酶实现筛选标记的定点切除¹⁰。

方案

TransFLP 方法（图1）通过三种不同的方式加以示例：I）删除两个相邻的编码 V. cholerae 毒力决定因子的基因（例如，ΔctxAB）；II）移除一个致病岛（例如，ΔVPI-1）；以及 III）在目的基因上游整合一个依赖 T7 RNA 聚合酶的启动子序列，从而使其可在相应的菌株背景下实现人工表达（例如，T7-tfoX）（图2）。

1. 准备几丁质薄片

1. 在标准的 1.5 ml 塑料离心管中称取 50–80 mg 的几丁质碎片。可批量制备。几丁质碎片可从 Sigma 公司购得（货号 C9213）。
2. 将管盖保持打开状态，对几丁质碎片进行高压灭菌。
3. 高压灭菌完成后，待灭菌器冷却后立即盖上管盖。
4. 将高压灭菌后的几丁质碎片于室温下保存。

2. 可选：用编码 Flp 重组酶的质粒对V. cholerae进行人工转化

1. 使用标准方法制备电转化感受态 V. cholerae 细胞¹¹。将感受态细胞分装后于 -80 °C 保存。
2. 取 1–2 μl 常规质粒小提产物 pBR-flp⁵ 加入电转化感受态 V. cholerae 细胞中，混匀后转移至电穿孔杯（0.2 cm 间隙宽度）中。
3. 施加 1.6 kV 的电脉冲。
4. 加入 0.9 ml SOC 培养基，轻柔地将细胞转移至标准的 14 ml 离心管中，在 30 °C 静置培养 2.5 至 3 小时。
5. 分别涂布 100 μl 和 300 μl 菌液于含有 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上，30 °C 过夜培养。
6. 挑取单克隆进行纯化，并制备甘油保存菌种，用于后续 TransFLP 实验。

3. 寡核苷酸设计与聚合酶链式反应

1. 至少需要六条寡核苷酸引物，通过PCR扩增目标DNA区域以及FRT侧翼的抗生素抗性盒图3建议同时使用一对位于插入的PCR片段外侧的寡核苷酸引物，以检测插入情况以及FRT侧翼抗生素抗性盒的正确切除。例如 在图中表示为“chk-up”和“chk-down”引物 图3至图5).
2. 仔细设计寡核苷酸 #2、#3、#4 和 #5，确保它们能够充分退火（例如 约28 bp）与模板DNA结合。模板DNA对于引物#2和#5为基因组DNA（gDNA），而对于含有FRT-Kan-FRT的质粒DNA（如pROD17）则为质粒DNA。¹² 以及本研究中的 pBR-FRT-KAN-FRT（引物 #3 和 #4）图3A).
3. 设计引物#2至#5，使其5'端在#2与#3之间以及#4与#5之间具有广泛的碱基配对图3A 插图）。随后进行两轮PCR。
4. 进行三次独立的 PCR 反应作为一组^st PCR扩增的第一轮将利用引物#1和#2扩增目的基因/目的DNA区域的上游区。该PCR应产生至少500 bp长度的片段，以确保细胞内发生同源重组。较短的片段（约250 bp）也可能足够⁸ 但不推荐使用。
5. 同时进行第二轮PCR，扩增带有FRT侧翼的抗生素抗性盒。在本文提供的示例中，我们主要使用了 aph (kan^R）。此反应使用引物 #3 和 #4（图3A).
6. 同时，通过PCR扩增下游DNA区域（第三个样本）。PCR片段长度也应至少为500 bp。以基因组DNA为模板，使用引物#5和#6进行PCR扩增。图3A).
7. 在完成所有三个PCR片段的纯化后，进行第二次^nd PCR扩增轮次。以第一轮PCR获得的全部三种片段等量混合物作为模板，由引物#1和#6催化扩增反应。所得PCR片段（图3B）在自然转化实验中用作转化DNA图1).

4. 几丁质诱导的自然转化

1. 培养 V. cholerae 在30 °C的丰富培养基中好氧培养细胞，直至其在600 nm处的光密度达到约0.5。
2. 通过离心收集细菌。用限定的人工培养基（DASW）将沉淀洗涤一次。⁶) 然后在 2 倍体积的 DASW 中重悬细胞。将 1 ml 培养物加入 50–80 mg 无菌甲壳素碎片中（见第 1 点说明）。如果细菌含有质粒 pBR-flp（可选第 2 点），在培养物中加入氨苄青霉素（50 μg/ml）。于 30 °C 静置培养 16–24 小时。
3. 加入 ≥ 200 ng 的 2^nd- 将PCR扩增得到的片段加入（详见第3点说明）。轻轻混匀，避免将细菌从几丁质表面过度剥离。在30 °C下静置孵育24小时。
4. 充分涡旋振荡培养物至少30秒。取100–300 μl涂布于选择性LB培养基平板上（例如 含有卡那霉素或庆大霉素的LB平板（如本示例所示）。若细菌含有质粒pBR-flp，则通过同时添加氨苄青霉素与其他抗生素制备双选择性平板。于30 °C培养16–24小时，或培养至菌落可见。
5. 从选择性平板上分离单个转化子。此类转化子由于发生双交换事件，已将原始染色体位点替换为PCR片段。若无需去除抗生素抗性盒，这些菌株可直接用于后续实验。

5. 通过 Flp 重组去除选择性盒

1. 如果在进行自然转化实验前尚未完成，可按照第2点所述方法，使用质粒pBR-flp对转化子进行人工转化。
2. 将细菌接种于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37 °C条件下培养16–24小时。可选操作：在培养过程中将温度提高至40 °C，持续2–3小时，因为质粒pBR-flp上的flp基因在较高温度下表达会解除抑制^5,10；或在培养约8小时后，将细菌转移至新的平板上。
3. 通过将克隆平行划线接种于含抗生素和不含抗生素的琼脂平板上，检测其对抗生素的敏感性（本实验以卡那霉素为例；图1）。挑选出单个敏感菌落。若计划后续使用TransFLP技术对菌株进行其他缺失或插入修饰，可将氨苄青霉素抗性的克隆保存为甘油菌种冻存。

6. 质粒消除

1. 在有氧条件下于 30 °C 过夜培养。使用不含任何抗生素的丰富培养基。
2. 可选：将过夜培养物按 1:100 比例接种至新鲜的无抗生素培养基中，于 3–6 小时内进行新鲜培养。
3. 将培养物进行稀释后涂布或划线接种于普通 LB 琼脂平板上，于 30 °C 培养 8–16 小时（直至可见菌落）。
4. 通过将克隆平行划线接种于含抗生素和不含抗生素的琼脂平板上，检测克隆对氨苄青霉素的敏感性（图 1）。将对氨苄青霉素敏感的菌株制备成甘油冻存液并保存。

结果

三个示例的代表性结果如图4至图6所示。第一种方法旨在删除邻近基因ctxA和ctxB，这两个基因共同编码霍乱弧菌（V. cholerae）的主要毒力因子——霍乱毒素。我们根据上述说明及图3所示设计了用于TransFLP方法的寡核苷酸。对亲本菌株、在ctxAB原始DNA位点处携带FRT侧翼抗生素抗性盒的中间菌株，以及最终删除了ctxAB并清除抗性盒的菌株，均进行了基因型检测（图4）。所采用的方法为全细胞PCR。我们使用的引物不与转化用PCR片段退火，而仅与染色体DNA结合（图3），从而可验证PCR片段与染色体同源区域之间的位点特异性交换（图4A）。通过标准琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物以确定其大小（图4B）。该策略可用于检测菌株中间体，并确认最终菌株构建体。

在第二个示例中，针对整个基因组岛的删除，...

讨论

上述及其他文献⁵中描述的TransFLP方法已在我们的实验室中得到广泛应用。可行的遗传操作包括但不限于：单个基因和基因簇的删除、基因组岛的删除（例如，VPI-1）、在目标基因上游插入序列（例如，启动子序列）以及在特定基因末端插入序列（例如，编码亲和标签的序列）。

TransFLP 的一个导入先决条件是相应的 V. cholerae 菌株具有天然感受态，但情况并非总是如此，尤其是在霍乱患者来源的分离株中。这类菌株的群体感应系统中常发生突变 例如，位于编码群体感应主要调控因子 HapR 的基因内¹⁷提供一份副本 hapR 在这些菌株中恢复自然转化能力⁶ 如HapR缺陷型菌株N16961所示¹⁸.

可以引入一些可能的改进措施，例如在自然转化后对细菌进行富集，以防转化频率过低⁸。请注意，在进行甲壳素诱导的自然转化实验时，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
几丁质碎片	Sigma	C9213	需高压灭菌
可选：微脉冲仪（若需通过 pBR-flp 质粒编码的 Flp 重组酶切除抗生素盒）	Biorad	165-2100	或性能相当的电穿孔仪