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基于气相色谱法检测经醛糖腈乙酸酯衍生化的葡萄糖胺和胞壁酸以测定土壤中微生物残体

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DOI：

10.3791/3767

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2012年5月19日

 ,  , 
1DOE-Great Lakes Bioenergy Research Center, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin, Madison, 3Department of Soil and Water Science, University of Florida

本文内容

摘要

我们描述了一种基于气相色谱（GC）分析从土壤中提取的葡萄糖胺和胞壁酸的醛糖腈乙酸酯衍生物的方法流程。为了阐明其化学反应机制，我们还提出了一种策略，用于确认该衍生物的结构及其在电子轰击电离过程中产生的离子碎片。

摘要

对微生物进行表征的定量方法对于更全面地理解生态系统中微生物的状态和功能至关重要。目前的微生物分析策略包括传统的依赖实验室培养的技术，以及基于直接提取和测定某些生物标志物的方法1, 2。生活在土壤中的微生物种类繁多，但其中仅有少数能够被培养，因此依赖培养的方法会引入显著偏差，而生物标志物分析则不存在这一局限性。

葡萄糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺和胞壁酸已被广泛用作衡量活体和死亡微生物生物量的指标，其中葡萄糖胺（含量最丰富）和胞壁酸（仅来源于细菌细胞）是土壤系统中最重要的组分3, 4。然而，由于对分析方法的知识缺乏，限制了其在科学界同行中的广泛应用。在所有现有的分析方法中，衍生化为醛糖腈乙酸酯后结合气相色谱（GC）分析，已成为一种较优的选择，因其在精密度、灵敏度、操作简便性、良好的色谱分离效果以及样品储存稳定性之间实现了最佳平衡5。

本文介绍了一种可靠且相对简单的土壤中氨基葡萄糖和胞壁酸经转化为醛糖腈乙酸酯后的分析详细方案。该方案主要包括四个步骤：酸水解、样品纯化、衍生化和气相色谱测定。逐步操作流程根据先前发表的研究进行了优化6, 7。此外，我们提出了一种策略，用于在电子轰击电离条件下对衍生化产物的分子离子及其裂解离子片段进行结构验证。我们采用气相色谱-电子轰击电离-质谱-选择离子监测（GC-EI-MS-SIM）、液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS）以及同位素标记试剂，测定氨基葡萄糖和胞壁酸衍生化为醛糖腈乙酸酯后的分子量；并通过同位素标记衍生物在离子谱图中的质量位移，研究各衍生物的离子碎片特征8。除理论解析外，对衍生化产物分子离子及其离子碎片的验证，将有助于在生物地球化学研究中使用δ13C或这些生物标志物离子碎片的研究人员9, 10。

方案

1. 样品制备与酸提取

  1. 野外采集土壤样品后进行冷冻干燥。
  2. 使用球磨机、土壤研磨仪或研钵与研杵将土壤样品研磨并均质化。
  3. 称取土壤样品（含氮量 > 0.3 mg）至25 mL水解瓶中。
  4. 向每个水解瓶中加入10 mL 6M HCl，通入N2气体，并 tightly 密封。
  5. 使用自动定时开关，在培养箱中于105 °C水解8小时。

2. 样品纯化

  1. 从培养箱中取出烧瓶，冷却至室温。
  2. 向每个烧瓶中加入 100 μL 内标肌醇（1 mg mL-1 水溶液），轻轻旋转混匀。
  3. 安装带有 ST/NS 24/40 接口的塑料漏斗，使其流入 200 mL 梨形烧瓶，并将烧瓶置于塑料杯上以保持稳定。
  4. 将 Whatman #2 定性滤纸圆片（直径 11 cm）折叠成四分之一，放入漏斗中。
  5. 轻轻旋转每个水解烧瓶，将悬浊液倒入漏斗进行过滤（可用约 3 mL 水进一步冲洗每个烧瓶）。
  6. 使用旋转蒸发仪在约 45 °C 下减压干燥滤液。
  7. 用 3~5 mL 水重新溶解每个梨形烧瓶中的干燥残渣（如需要可使用超声浴），然后转移至 40 mL 聚四氟乙烯（Teflon）管中；再用一份水冲洗烧瓶。
  8. 用 1 M KOH 溶液调节 pH 至 6.6–6.8，以沉淀金属离子和其他有机分子。
  9. 在 2000 rcf 下离心 10 分钟，去除沉淀物。
  10. 将上清液倒入 40 mL 玻璃管中，用封口膜覆盖管口，在 -20 °C 冷冻后，在封口膜上刺孔。
  11. 冷冻干燥已冻结的上清液，以完全去除液体。
  12. 用 3 mL 干燥甲醇溶解残渣，充分涡旋振荡（如需要可使用超声浴）；盖紧管盖，然后在 2000 rcf 下离心 10 分钟以沉淀盐分。
  13. 将上清液转移至 3 mL 锥形反应小瓶中，在 45 °C 下使用 RapidVap 仪器蒸发至干燥（或如需要可在干燥氮气流下蒸发）。
  14. 向每个小瓶中加入 100 μL 回收标准物 N-甲基葡糖胺（1 mg mL-1 水溶液）和 1 mL H2O，用封口膜覆盖瓶口，在 -20 °C 冷冻，刺穿封口膜，然后进行冷冻干燥。
  15. 制备标准品：向小瓶中加入 100 μL 胞壁酸（0.5 mg mL-1 甲醇溶液）、100 μL 葡糖胺（1 mg mL-1 水溶液）、100 μL 肌醇（1 mg mL-1 水溶液）、100 μL N-甲基葡糖胺（1 mg mL-1 水溶液）以及 1 mL H2O，用封口膜密封每个小瓶，在 -20 °C 冷冻，刺穿封口膜，然后进行冷冻干燥。

3. 衍生化

  1. 配制衍生化试剂：将 32 mg mL-1 盐酸羟胺和 40 mg mL-1 4-二甲氨基吡啶溶于吡啶-甲醇（4:1 v/v）中。
  2. 向每个反应小瓶中加入 300 μL 衍生化试剂，盖紧瓶盖，并充分涡旋混匀。
  3. 将小瓶置于 75–80 °C 水浴中加热 35 分钟（确保小瓶密封良好，防止水进入瓶内）。
  4. 从水浴中取出小瓶，冷却至室温。
  5. 向每个 3 mL 反应小瓶中加入 1 mL 乙酸酐，盖紧瓶盖，充分涡旋混匀，然后在 75–80 °C 水浴中重新加热 25 分钟。
  6. 从水浴中取出小瓶，冷却至室温。

4. 分离与测定

  1. 向每个小瓶中加入 1.5 mL 二氯甲烷，盖紧瓶盖，并充分涡旋混匀。
  2. 向每个小瓶中加入 1 mL 1 M HCl，盖紧瓶盖并充分涡旋混匀，静置至两相分离，使用 1000 μL 移液器吸取并弃去上层（水相）。
  3. 以相同方式用 1 mL H2O 对有机相进行 3 次萃取（最后一次洗涤时，需特别注意确保所有上层水相均被完全移除）。
  4. 使用 RapidVap 在 45 °C 下干燥最终溶液（或根据需要使用氮气吹干）。
  5. 用 300 μL 乙酸乙酯-正己烷（1:1 v/v）溶解，转移至含小体积内插管的 2 mL 棕色螺口小瓶中，盖紧瓶盖。
  6. 进行定量分析时，采用 GC-FID 分析，色谱柱为熔融石英非极性毛细管柱：柱长 30 m，内径 0.25 mm，膜厚 0.25 μm；固定相为 5% 苯基-95% 甲基聚硅氧烷（DB-5 或等效柱），载气为氢气或氦气，恒流 0.5 mL min-1。使用高纯度“惰性”固定相和氢气载气时色谱效果更佳，但普通类型固定相和氦气条件下也可接受。检测器温度设为 300 °C；空气流速 400 mL min-1，氮气和氢气补充气流速均为 30 mL min-1。进样口和柱温箱参数如下：1 μL 分流进样（分流比 30:1），GC 进样口温度设为 250 °C；初始柱温 120 °C，保持 1 min；以 10 °C min-1 升温至 250 °C，保持 2.5 min；再以 20 °C min-1 升至 270 °C，保持 2 min；再以 20 °C min-1 升至 290 °C，保持 5 min。调节载气流速，使肌醇、氨基葡萄糖和胞壁酸衍生物在 250 °C 时洗脱，N-甲基氨基葡萄糖在 270 °C 时洗脱。

5. 衍生品验证

  1. 采用软电离液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱法（LC-ESI-TOF-MS）鉴定分子离子，并测定衍生物的分子量。
  2. 采用气相色谱-电子轰击电离-质谱-选择离子监测法（GC-EI-MS-SIM）或气相色谱-电子轰击电离-串联质谱法（GC-EI-MSMS），通过提高灵敏度来研究目标衍生物的特定离子。
  3. 使用多种同位素标记试剂制备衍生物，然后利用这些同位素标记衍生物在质谱中的质量位移来研究分子离子及离子碎片。

6. 代表性结果

该方法的实验流程主要包括四个步骤：酸消化、样品纯化、衍生化和气相色谱测定（图1）。图2展示了来自标准品储备液和土壤样品中葡萄糖胺与胞壁酸分析的一个示例。除葡萄糖胺和胞壁酸外，甘露糖胺和半乳糖胺（葡萄糖胺的两种异构体）也可通过该方法同时测定。基于各标准品相对于内标肌醇的响应因子，可对土壤样品中的这些生物标志物进行定量。回收率标准品已被用于定性监测衍生化过程。葡萄糖胺和胞壁酸形成醛糖腈乙酸酯衍生化产物的反应路线如图3所示。

通过气相色谱-电子轰击电离质谱-选择离子监测（GC-EIMS-SIM）以提高灵敏度，或采用软电离液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS8）确定了衍生物的拟议结构；通过比较采用不同同位素标记试剂制备的样品所产生的离子谱图，研究了电子轰击电离条件下形成的离子碎片的拟议结构11。图4展示了在三种不同情况下制备的氨基葡萄糖腈乙酸酯衍生物的主要离子（m/z 187）的质量位移，这三种情况分别为：使用非标记试剂、D-乙酸酐以及U-13C-氨基葡萄糖制备的样品。其他详细信息和解释可参考我们近期的出版物8, 11。该策略可作为研究衍生化化学反应的模型。

测量流程图，提取过程；GC方法，衍生化，纯化步骤。
图1. 土壤样品中氨基葡萄糖和胞壁酸分析方法的测量流程图。该方法主要包括4个步骤：酸消解、纯化、衍生化和气相色谱测定。

分析化合物的色谱图；标准品与土壤样品的响应因子计算。
图 2. 肌醇、葡萄糖胺、胞壁酸、甘露糖胺、半乳糖胺和甲基葡萄糖胺的醛糖腈乙酸酯的标准品及土壤样品的气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）色谱图。

化学反应机理；结构式；有机合成；多步转化图示。
图3. 葡糖胺和胞壁酸衍生化为醛糖腈乙酸酯的反应路线图。数字1代表腈化反应，数字2代表乙酰化反应。

质谱图谱；片段分析；含结构式和分子峰的示意图。
图 4. 在 EI 模式下制备的与主要离子结构相关的脱氧糖腈乙酸酯衍生化葡萄糖胺的质谱图，样品分别使用 (A) 非标记试剂、(B) D-乙酸酐、(C) U-13C-葡萄糖胺处理。星号表示重同位素原子或同位素基团。请点击此处查看该图的放大版本。

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讨论

本文介绍的基于气相色谱（GC）的方法用于分析经醛糖腈乙酸酯衍生化的葡萄糖胺和胞壁酸，为定量检测从土壤中提取的这些氨基糖提供了一种相对快速的手段。衍生化产物化学性质稳定，可在一次分析中同时测定。该方法不仅限于土壤样品，也可简化后适用于非土壤基质的样品。

本方法所使用的真空泵具有耐酸设计。我们进一步建议在蒸发6M HCl溶液时设置碱性捕集装置，以保护真空泵。在衍生化步骤中，必须严格保持无水条件，包括试剂和玻璃器皿均需无水。操作应迅速进行，不得延误。玻璃器皿必须彻底清洁，可通过在550°C下灼烧或用溶剂冲洗实现。处理酸类物质以及蒸发过程中产生的强酸蒸气时，应采取适当的安全防护措施。氨基糖苷类抗生素是由土壤微生物产生的一类抗生素，已被确认可能造成干扰，因其在DB-5色谱柱上会与葡萄糖胺或胞壁酸共洗脱12，因此若以GC-FID作为定量这些氨基糖的主要方法，建议使用具有不同固定相化学性质的第二根色谱柱。我们建议在GC洗脱后采用确证型检测器用于后续分析。对于复杂基质中痕量生物标志物的明确鉴定，建议使用高精密度仪器，例如配备多反应监测模式的GC-MS/MS；在存在干扰物的情...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本工作得到了美国能源部大湖生物能源研究中心（DOE BER 科学办公室 DE-FC02-07ER64494）资助项目的资助。我们感谢张旭东博士及其团队成员在技术讨论以及完善本实验方案过程中提供的宝贵意见和帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胞壁酸Sigma-AldrichM2503-25MG
D-(+)-葡萄糖胺盐酸盐Sigma-AldrichG1514-100G
N-甲基-D-葡萄糖胺Sigma-AldrichM2004-500G
肌醇Fisher ScientificA307003G025
甲醇（无水）Acros OrganicsAC326950010
4-二甲氨基吡啶Acros OrganicsAC148270050
乙酸乙酯VWR internationalBJGC100-4
盐酸羟胺Fisher ScientificH330-100
吡啶Fisher ScientificP368-500
乙酸酐Fisher ScientificA10-100
二氯甲烷（亚甲基氯）Fisher ScientificD37-500
己烷Fisher ScientificH303-4
盐酸（6 M）Fisher ScientificS456-4
盐酸羟胺-15NIcon servicesIN5280
乙酸酐-2H (D6C4O3)Acros OrganicsAC174670050
D-葡萄糖-U-13CCambridge Isotope LaboratoriesCLM-1396-1
硫酸铵-15N Cambridge Isotope LaboratoriesNLM-713-1
Rapid-VapLabconco Corp.790002
真空泵KNF NeubergerD-79112
水解烧瓶Fisher Scientific06 423A
衍生化微量小瓶Fisher Scientific06-100E
GCHewlett-Packard6890
MSHewlett-Packard5972
LC-ESI-TOF-MSAgilent Technologies配备 Agilent LC/MSD-TOF 的 Agilent 1200 系列高效液相色谱系统

参考文献

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