方法文章

简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

DOI：

10.3791/3780

⸱

2012年9月30日

 ,  , 
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

本文内容

摘要

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一种无需麻醉的简易微流控装置已被开发出来 体内 成像 秀丽线虫完整 果蝇 幼虫和斑马鱼幼鱼。该装置利用可变形的PDMS膜固定这些模式生物，从而对心跳、细胞分裂和亚细胞神经元运输等多种过程进行延时成像。我们展示了该装置的使用方法，并呈现了从不同模式系统中采集的各类数据示例。

摘要

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微加工流体装置为微环境研究提供了便捷的平台 体内 小型生物研究。利用软光刻技术可采用简单的制造工艺制备微流控装置 1-3微流控设备已用于亚细胞成像 4,5, 体内 激光显微手术 2,6 以及细胞成像 4,7. 体内 成像需要对生物体进行固定。这可通过使用负压吸附来实现。 5,8，锥形通道 6,7,9可变形膜 2-4,10，附加冷却的抽吸 5麻醉气体 11，温度敏感凝胶 12，氰基丙烯酸酯胶水 13 以及左旋咪唑等麻醉剂 14,15常用的麻醉剂影响突触传递 16,17 已知会对神经元亚细胞运输产生不利影响 4本研究中，我们展示了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜的装置，该装置可实现对完整遗传模式生物的无麻醉固定，例如 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫), 果蝇 幼虫和斑马鱼幼鱼。这些模式生物适用于 体内 由于其直径较小且身体具有光学透明或半透明特性，可在微流控装置中进行研究。早期幼虫阶段的体径范围约为 10 μm 至 800 μm。 秀丽隐杆线虫 斑马鱼幼体需要不同尺寸的微流控装置，以通过压缩氮气经液柱施加压力实现完全固定，从而进行高分辨率的延时成像。固定后的生物体利用倒置显微镜进行观察，释放后动物在10分钟内恢复正常的运动活动。

我们展示了延时成像在C. elegans中的四种应用，即神经元中线粒体运输的成像、在运输缺陷型突变体中突触前囊泡的运输、谷氨酸受体的运输以及Q神经母细胞的分裂。通过此类影像获得的数据表明，与麻醉动物相比，微流控固定是一种获取细胞及亚细胞事件体内数据的有效且精确的方法（图1J和3C-F 4）。

设备尺寸经过调整，以实现对不同阶段的延时成像 秀丽隐杆线虫一龄幼虫 果蝇 幼虫和斑马鱼幼虫。在完整的一龄幼虫中，感觉神经元内由GFP标记的突触结合蛋白（syt.eGFP）所标记的小泡运输显示出胆碱能感觉神经元中突触小泡标志物的定向运动 果蝇 幼虫。类似装置已被用于对受精后约30小时（hpf）的斑马鱼幼虫进行心跳延时成像。这些数据表明，我们开发的简单装置可应用于多种模式系统，以研究多种细胞生物学和发育学现象。 体内.

方案

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1. SU8 母版制作

  1. 使用 Clewin 软件设计微流控结构，并使用 65,024 DPI 激光绘图仪在电路板膜上打印，最小特征尺寸为 8 μm。
  2. 用 20% KOH 清洗带有天然氧化层的 2 cm × 2 cm 硅片 1 分钟，然后用去离子水冲洗；每个流动层及其对应的控制层各使用一片硅片。
  3. 用氮气吹干硅片，并在热板上 120 °C 下脱水 4 小时。待硅片冷却至室温后，再进行下一步操作。
  4. 依次将硅片放置在旋涂机卡盘上，打开真空。在硅片表面覆盖约 20 μl 六甲基二硅氮烷（HMDS），使用 SPIN150 旋涂仪以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 3,000 rpm 旋转 30 秒进行涂覆。
  5. 在硅片上完全覆盖约 1.5 ml SU8-2025（http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm），使用 SPIN150 旋涂仪以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 2,000 rpm 旋转 30 秒进行涂覆。该旋涂程序可获得约 40 μm 厚的光刻胶层，适用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）早期幼虫阶段的控制层和流动层。
  6. 使用 SPIN150 旋涂仪对约 1.5 ml SU8-2050 以 5....

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结果

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固定装置是一种双层PDMS模块，通过键合两层制成：流体层（第一层）和控制层（第二层），如图所示。 图1主要陷阱装置通过调压阀和三通旋塞连接至氮气钢瓶，以通过液柱向膜施加所需的3-14 psi压力。图1A）。发生偏转的膜实现固定 秀丽隐杆线虫, 果蝇 或在具有不同尺寸设计的流道中的斑马鱼幼鱼（图1B 和 1C）。光刻掩模用于设计具有不同几何结构的固定化装置层 秀丽隐杆线虫 (图1D), 果蝇 幼虫（图1F）和斑马鱼幼鱼（图1G）。流体层的通道高度（h1 在 图1E，1K）通过调节不同的旋涂速度，以适应不同直径的生物体在流动通道内的需求。流动层高度在制备时设定为 40 μm, 80 μm, 500 μm 和 900 μm 用于 秀丽隐杆线虫 幼虫阶段，成虫 秀丽隐杆线虫

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讨论

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PDMS 微流控装置具有光学透明性，因此可用于任何透明或半透明模式生物的高分辨率 in vivo 成像。我们的设计适用于在完整活体动物中对细胞及亚细胞事件进行高倍率时空成像。采用软光刻技术进行微加工，可方便地调节装置尺寸以适应不同大小的模式生物。我们已制备出适用于不同发育阶段的 C. elegans、Drosophila 幼虫和斑马鱼幼虫的多种尺寸装置。其流体层通道高度分别为 40 μm 和 80 μm 的装置，可分别显著改善早期（L1）和晚期（晚L4）C. elegans 的固定效果以及成像后的存活状态。我们在制备用于 C. elegans 以及 Drosophila/斑马鱼的装置时，实现了 100% 的成功率为，无任何缺陷装置。该装置可重复使用，直至控制通道被灰尘颗粒或细菌污染为止。与使用麻醉剂处理的动物相比，装置固定的 C. elegans 在野生型和突变型个体中均表现出更高的货物运输通量。该固定方法避免了技术上较为困难的解剖操作，尤其适用于 Drosophila 幼虫的早期发育阶段

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致谢

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我们感谢 Krishanu Ray 博士为本研究 果蝇 stocks，Tarjani Agarwal 负责维持 a 黑腹果蝇 笼子，Peter Juo 用于 nuIs25 以及 CGC 用于 秀丽隐杆线虫 菌株。SPK 制备 jsIs609 感谢Michael Nonet实验室的贡献。感谢Arpan Agnihotri（BITS Pilani）在活细胞成像技术中对线粒体运输过程的时间序列成像所提供的帮助 jsIs609 微流控装置中的动物实验。我们感谢Vatsala Thirumalai博士和Surya Prakash为我们提供斑马鱼胚胎。感谢Krishna博士以及NCBS的CIFF中心提供旋转盘共聚焦显微镜的使用权限，该设备由印度科学技术部—纳米技术中心资助（编号：SR/55/NM-36-2005）。我们还感谢Kaustubh Rau、V. Venkatraman和Chetana Sachidanand参与讨论。本研究由DBT博士后奖学金（S.M.）、DST快速通道计划（S.M.）以及DBT对S.P.K.的资助项目提供经费支持。S.A.的研究得到了DST和CSIR对S.P.K.的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅片University Wafer150 mm (100) 机械级 SSP Si
Clewin 软件WieWeb 软件版本 2.90
激光绘图仪Fine Line Imaging65,024 DPI
HMDSSigma-Aldrich440191-100ML
SU8MicrochemSU8-2025, SU8-2050
显影液MicrochemSU8 显影液
硅烷Sigma-Aldrich448931-10G
PDMSDow CorningSylgard 184
紫外灯Oriel66943200W Hg Oriel 光源
热风烘箱Ultra Instruments定制设定为 50 °C
加热板IKA 实验室设备3810000http://www.ika.com
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-32G
匀胶机半导体生产系统公司SPIN150-NPPwww.SPS-Europe.com
玻璃盖玻片Gold Seal22 × 22 mm，No. 1 厚度
C. elegansCaenorhabditis 遗传中心（CGC）e1265, ayIs4
DrosophilaBloomingtonP{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
斑马鱼印度野生型野生型
Tygon 管SigmaZ279803
微针SigmaZ118044切成 1 cm 长的片段
三通旋塞阀SigmaS7521
Harris 打孔器SigmaZ708631
压缩氮气本地气体供应商使用减压阀控制压力
体视显微镜NikonSMZ645
共聚焦显微镜Andor OlympusYokogawa 转盘共聚焦显微镜
ImageJ美国国立卫生研究院www.rsbweb.nih.gov/ij基于 Java 的图像处理程序

参考文献

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  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. ....

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重印与许可

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标签

PDMS

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