简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

摘要

一种无需麻醉的简易微流控装置已被开发出来 体内 成像 秀丽线虫完整 果蝇 幼虫和斑马鱼幼鱼。该装置利用可变形的PDMS膜固定这些模式生物，从而对心跳、细胞分裂和亚细胞神经元运输等多种过程进行延时成像。我们展示了该装置的使用方法，并呈现了从不同模式系统中采集的各类数据示例。

摘要

微加工流体装置为微环境研究提供了便捷的平台 体内 小型生物研究。利用软光刻技术可采用简单的制造工艺制备微流控装置 ^1-3微流控设备已用于亚细胞成像 ^4,5, 体内 激光显微手术 ^2,6 以及细胞成像 ^4,7. 体内 成像需要对生物体进行固定。这可通过使用负压吸附来实现。 ^5,8，锥形通道 ^6,7,9可变形膜 ^2-4,10，附加冷却的抽吸 ⁵麻醉气体 ¹¹，温度敏感凝胶 ¹²，氰基丙烯酸酯胶水 ¹³ 以及左旋咪唑等麻醉剂 ^14,15常用的麻醉剂影响突触传递 ^16,17 已知会对神经元亚细胞运输产生不利影响 ⁴本研究中，我们展示了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜的装置，该装置可实现对完整遗传模式生物的无麻醉固定，例如 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫), 果蝇 幼虫和斑马鱼幼鱼。这些模式生物适用于 体内 由于其直径较小且身体具有光学透明或半透明特性，可在微流控装置中进行研究。早期幼虫阶段的体径范围约为 10 μm 至 800 μm。 秀丽隐杆线虫 斑马鱼幼体需要不同尺寸的微流控装置，以通过压缩氮气经液柱施加压力实现完全固定，从而进行高分辨率的延时成像。固定后的生物体利用倒置显微镜进行观察，释放后动物在10分钟内恢复正常的运动活动。

我们展示了延时成像在C. elegans中的四种应用，即神经元中线粒体运输的成像、在运输缺陷型突变体中突触前囊泡的运输、谷氨酸受体的运输以及Q神经母细胞的分裂。通过此类影像获得的数据表明，与麻醉动物相比，微流控固定是一种获取细胞及亚细胞事件体内数据的有效且精确的方法（图1J和3C-F ⁴）。

设备尺寸经过调整，以实现对不同阶段的延时成像 秀丽隐杆线虫一龄幼虫 果蝇 幼虫和斑马鱼幼虫。在完整的一龄幼虫中，感觉神经元内由GFP标记的突触结合蛋白（syt.eGFP）所标记的小泡运输显示出胆碱能感觉神经元中突触小泡标志物的定向运动 果蝇 幼虫。类似装置已被用于对受精后约30小时（hpf）的斑马鱼幼虫进行心跳延时成像。这些数据表明，我们开发的简单装置可应用于多种模式系统，以研究多种细胞生物学和发育学现象。 体内.

方案

1. SU8 母版制作

1. 使用 Clewin 软件设计微流控结构，并使用 65,024 DPI 激光绘图仪在电路板膜上打印，最小特征尺寸为 8 μm。
2. 用 20% KOH 清洗带有天然氧化层的 2 cm × 2 cm 硅片 1 分钟，然后用去离子水冲洗；每个流动层及其对应的控制层各使用一片硅片。
3. 用氮气吹干硅片，并在热板上 120 °C 下脱水 4 小时。待硅片冷却至室温后，再进行下一步操作。
4. 依次将硅片放置在旋涂机卡盘上，打开真空。在硅片表面覆盖约 20 μl 六甲基二硅氮烷（HMDS），使用 SPIN150 旋涂仪以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 3,000 rpm 旋转 30 秒进行涂覆。
5. 在硅片上完全覆盖约 1.5 ml SU8-2025（http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm），使用 SPIN150 旋涂仪以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 2,000 rpm 旋转 30 秒进行涂覆。该旋涂程序可获得约 40 μm 厚的光刻胶层，适用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）早期幼虫阶段的控制层和流动层。
6. 使用 SPIN150 旋涂仪对约 1.5 ml SU8-2050 以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 2,000 rpm 旋转 30 秒，获得约 80 μm 厚的光刻胶层，适用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）晚期幼虫阶段的流动层、果蝇（Drosophila）/斑马鱼幼虫的基础流动层及其相应的控制层。
7. 将涂有 SU8 的硅片放置在热板上，光刻胶层朝上。在 65 °C 下预烘 1 分钟，随后在 95 °C 下烘 10 分钟。待硅片冷却至室温后，再进行下一步操作。
8. 将预烘后的硅片放置在曝光台上，SU8-2025 涂层朝上并面向紫外灯。对于秀丽隐杆线虫（C. elegans）早期幼虫阶段的流动层和控制层图案，分别使用带有设计 I（L1，图 1B）和设计 II（L2，图 1B）的光掩模。将光掩模置于 SU8 层上方，并确保其与涂层紧密贴合。打开紫外灯快门，通过光掩模对预烘后的 SU8 硅片进行 200 瓦紫外灯曝光 15 秒。
9. 在涂有 SU8-2050 的硅片（步骤 1.6 制备）上，使用带有设计 I（L1，图 1B）和设计 II（L2，图 1B）的光掩模，分别制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）晚期幼虫阶段的流动层和控制层。在涂有 SU8-2050 的硅片（步骤 1.6 制备）上，使用带有设计 I（L1，图 1C）和设计 II（L2，图 1C）的光掩模，分别制备果蝇（Drosophila）/斑马鱼幼虫的基础流动层和控制层。通过光掩模对 SU8 表面进行 200 瓦紫外灯曝光 15 秒。
10. 将曝光后的硅片放置在热板上，涂层朝上。在 65 °C 下后烘 1 分钟，随后在 95 °C 下烘 10 分钟。待硅片冷却后再进行下一步操作。
11. 使用 SU8 显影液对硅片显影 20 分钟。用异丙醇（IPA）冲洗硅片，并用氮气吹干。
12. 将硅片放入干燥器中，SU8 图案朝上。在干燥器中用 50 μl 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气对硅片进行 2 小时的表面修饰。

注意事项：进行KOH处理、光刻胶涂覆和显影时，需采取化学品操作的安全防护措施。硅烷蒸气涂覆应在通风良好的区域内的干燥器中进行。避免SU8光刻胶过度暴露于光照。使用紫外光源时，应佩戴护目镜。

2. PDMS 模具的制备

1. 将50 g Sylgard 184基础剂与5 g固化剂加入塑料杯中，配制10:1的PDMS。手动混合约3分钟。将混合物置于真空干燥器中脱气，以去除混合过程中产生的所有气泡。
2. 在带有设计II型SU8图案的硅片上，轻轻倾倒一层5 mm厚的PDMS混合物，用于控制层，避免产生气泡。若倾倒过程中形成气泡，需在低真空条件下对SU8图案上的PDMS进行脱气处理，以彻底去除所有气泡。
3. 将带有设计I型SU8-2025图案的硅片（用于流体层）放置在旋涂机载物台上，并打开真空以固定硅片。在硅片上覆盖约1 ml PDMS混合液，使用SPIN150旋涂仪以500 rpm转速旋涂5秒，随后以1,500 rpm转速旋涂30秒。
4. 在带有设计I（L1）80 μm SU8-2050图案的硅片上涂覆约1 ml PDMS混合物， 图1B），用于晚期幼虫阶段的流体层 秀丽隐杆线虫 使用SPIN150旋涂仪，先以500 rpm转速旋转5秒，随后以1,000 rpm转速旋转30秒。在带有SU8-2050流动层设计I型（L1）图案的硅片上涂覆一层较厚的PDMS混合液， 图1C）用于 果蝇斑马鱼幼体，使用SPIN150旋转仪在500 rpm下旋转35秒。
5. 将设计I的PDMS包被硅片与用于控制层的含PDMS的设计II晶圆一同烘烤 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇斑马鱼幼体在50 °C的热风对流烘箱中处理6小时。
6. 从含有SU8图案II的硅基底上切下PDMS片 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇使用锋利的刀片将斑马鱼幼鱼切开。在PDMS模具中，利用Harris打孔器在连接主捕获区域的储液池顶部打一个直径约1 mm的小孔。
7. 将打孔的PDMS块（含有40 μm厚的控制层L2模具）放置在塑料托盘上，使控制层的模制面朝上。将涂有PDMS并带有40 μm厚SU8设计I的硅片放置在同一托盘上，PDMS涂层表面朝上。将托盘放入等离子清洗仪腔室内，开启真空泵抽真空2分钟。随后打开等离子电源，降低腔室压力，直至腔室内呈现淡粉色。在低真空条件下，用18瓦的空气等离子处理两个表面2分钟。
8. 将从含有晚期幼虫阶段图案II的80 μm厚SU8模具上取下的打孔PDMS块放置于 秀丽隐杆线虫 或 果蝇将斑马鱼幼体置于塑料托盘上，控制层的模压面朝上。将相应的经旋涂并烘焙的PDMS层（该PDMS层旋涂于含80 μm厚设计I的硅片上）放置一旁备用 C. elegans 阶段或 黑腹果蝇将斑马鱼幼鱼同时放置在同一托盘上，确保其平坦的PDMS涂层表面朝上。采用上述相同的方案，将其暴露于空气等离子体中。
9. 将两个经等离子体处理的表面放置于 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇将斑马鱼幼鱼轻轻压平后，置于50 °C的热空气对流烘箱中烘烤2小时。
10. 使用 SU8 设计 I 从硅基底上切割出键合的器件 秀丽隐杆线虫 和/或 黑腹果蝇斑马鱼幼体。在流道的入口和出口储液池处打穿通孔。
11. 将键合好的PDMS模具放置于塑料托盘中 C. elegans，使流体层设计的模制面朝上。取洁净的玻璃盖玻片（22 × 22 mm，1号厚度）并置于同一塑料托盘上。将载有PDMS模具和玻璃盖玻片的托盘放入等离子体腔室中。在低压条件下，对装置底部的PDMS表面和玻璃盖玻片施加18瓦的空气等离子体处理2分钟。将两个经等离子体处理的表面轻轻压合，并在50 °C的热对流烘箱中烘烤2小时。
12. 将设备存放在洁净环境中，以备后续使用。

3. 额外步骤 果蝇斑马鱼装置

1. 在干燥器中，将 2 cm × 2 cm 的洁净玻璃表面暴露于 50 μl 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气中处理 2 小时。
2. 将步骤2.1中制备的约1 ml 10:1 PDMS混合物滴加在硅烷化玻璃表面，使用SPIN150匀胶机以500 rpm转速旋转35秒。将涂有PDMS的玻璃基底放入热风烘箱中，在50 °C下烘烤6小时，涂层面向上。待PDMS层冷却至室温后，再进行下一步操作。
3. 使用定制的锋利金属冲头在PDMS中间位置冲压涂层层，以形成PDMS间隔层。该金属冲头的形状设计与流道设计相似 果蝇斑马鱼（L1， 图1C).
4. 暴露PDMS间隔层以及单键合模块（流体层和控制层，按步骤2.9制备） 黑腹果蝇将斑马鱼幼鱼置于低真空条件下，用18瓦空气等离子体在等离子清洗机中处理，随后将两个经等离子体处理的表面贴合，并在50 °C热风烘箱中烘烤2小时。
5. 从玻璃上切割下已键合的装置，在进样口和出样口储液区打孔，并使用等离子清洗仪按照步骤2.11所述方法将其键合到玻璃盖玻片（22 × 22 mm，1号厚度）上。该装置可用于固定一龄幼虫 果蝇 幼虫通道高度约为500 μm。对于斑马鱼幼鱼，需复制PDMS间隔层的制备过程，并增加一个键合步骤。双层PDMS-S可为30 hpf斑马鱼幼鱼提供900 μm的通道高度。

注意事项：在器件制备过程中应避免灰尘颗粒。两个经等离子清洗的表面必须完全无尘，以确保良好的键合效果。在没有专用洁净室的情况下，应将器件存放在干燥器中，以尽量减少灰尘颗粒在器件上的积聚。

4. 使用PDMS膜

1. 将微细软管一端（内径约1.6 mm，外径约4.8 mm）连接至加压氮气供应调节器，另一端通过一根18号针头（外径约1.25 mm，用胶固定于软管上）连接至主捕集器储液池。在软管连接中间安装一个三通旋塞阀，用于对膜施加或释放压力。
2. 在将连接至PDMS装置的管子与主捕集器的储液槽连接之前，先向该管子中加入10 cm高的蒸馏水液柱 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇斑马鱼幼虫装置
3. 将氮气供应阀调节至读数为14 psi，并在倒置显微镜低倍镜下观察主捕集阱膜向流动通道方向的形变情况。当三通旋塞打开时，微柔性管中水柱长度会被压缩。在透射光下可观察到形变膜的边缘（图1I 和 1J膜的形变导致PDMS膜下方的尘埃颗粒/气泡发生位移，并将其推向通道边界。
4. 等待液体前沿完全充满微通道，且无任何气泡残留。
5. 使用三通旋塞阀释放压力，使膜松弛至其静息位置。

5. 将 C. elegans、Drosophila 和斑马鱼幼虫装入装置，并在柔性的 PDMS 膜下固定

1. 用 M9 缓冲液 [3 g KH₂PO₄，6 g Na₂HPO₄，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO₄₄，H₂0至1升，通过高压灭菌进行灭菌]用于 秀丽隐杆线虫 18 或 1× PBS [8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄，0.24 g KH₂PO₄，H₂0至1升，通过高压灭菌进行灭菌] 果蝇实验前将斑马鱼幼鱼在 19°C 下孵育 10 分钟。
2. 定位单个 秀丽隐杆线虫 在NGM平板上所需发育阶段的 ¹⁸ （或一龄幼虫） 果蝇 来自琼脂卵板或人工去壳的30小时斑马鱼幼鱼（30 hpf），置于液体培养基中 ²⁰) 使用低倍立体显微镜进行观察。用微量缓冲液将单个动物样本吸入微尖移液头中。使用末端经切割处理的微尖移液头，以容纳较大的样本 果蝇 或缓冲液中的斑马鱼幼鱼。
3. 将单个生物体通过流动通道入口推入。调节移液压力，使单个动物位于主捕获区域下方。
4. 缓慢增加PDMS膜的压力，使动物紧贴通道边界，并以14 psi的压力将其固定 秀丽隐杆线虫，7 psi 用于 果蝇 斑马鱼幼虫为3 psi。
5. 将固定好的动物置于显微镜视野中心。使用倒置显微镜，根据需要设置高分辨率明场或荧光成像条件。以预设的帧率采集单张或延时荧光图像。
6. 释放捕获压力，在低倍镜下观察动物运动 5-10 分钟。
7. 冲洗动物并放入新的动物以重复上述步骤。
8. 使用注射器将蒸馏水注入废液储液池，清洗所有动物样本。随后用注射器向通道内推入空气，将其干燥，以备后续重复使用。

注意事项：需要较高移液压力才能进入主通道的动物在从捕获区释放后，往往表现出运动能力差或健康状况不佳，应避免用于成像。清除流道中残留的缓冲液痕迹，防止结晶导致通道堵塞。若使用油浸进行高分辨率成像，需清洁玻璃盖玻片，以确保后续实验具有良好的信噪比。

结果

固定装置是一种双层PDMS模块，通过键合两层制成：流体层（第一层）和控制层（第二层），如图所示。 图1主要陷阱装置通过调压阀和三通旋塞连接至氮气钢瓶，以通过液柱向膜施加所需的3-14 psi压力。图1A）。发生偏转的膜实现固定 秀丽隐杆线虫, 果蝇 或在具有不同尺寸设计的流道中的斑马鱼幼鱼（图1B 和 1C）。光刻掩模用于设计具有不同几何结构的固定化装置层 秀丽隐杆线虫 (图1D), 果蝇 幼虫（图1F）和斑马鱼幼鱼（图1G）。流体层的通道高度（h1 在 图1E，1K）通过调节不同的旋涂速度，以适应不同直径的生物体在流动通道内的需求。流动层高度在制备时设定为 40 μm, 80 μm, 500 μm 和 900 μm 用于 秀丽隐杆线虫 幼虫阶段，成虫 秀丽隐杆线虫

讨论

PDMS 微流控装置具有光学透明性，因此可用于任何透明或半透明模式生物的高分辨率 in vivo 成像。我们的设计适用于在完整活体动物中对细胞及亚细胞事件进行高倍率时空成像。采用软光刻技术进行微加工，可方便地调节装置尺寸以适应不同大小的模式生物。我们已制备出适用于不同发育阶段的 C. elegans、Drosophila 幼虫和斑马鱼幼虫的多种尺寸装置。其流体层通道高度分别为 40 μm 和 80 μm 的装置，可分别显著改善早期（L1）和晚期（晚L4）C. elegans 的固定效果以及成像后的存活状态。我们在制备用于 C. elegans 以及 Drosophila/斑马鱼的装置时，实现了 100% 的成功率为，无任何缺陷装置。该装置可重复使用，直至控制通道被灰尘颗粒或细菌污染为止。与使用麻醉剂处理的动物相比，装置固定的 C. elegans 在野生型和突变型个体中均表现出更高的货物运输通量。该固定方法避免了技术上较为困难的解剖操作，尤其适用于 Drosophila 幼虫的早期发育阶段

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅片	University Wafer	150 mm (100) 机械级 SSP Si
Clewin 软件	WieWeb 软件	版本 2.90
激光绘图仪	Fine Line Imaging	65,024 DPI
HMDS	Sigma-Aldrich	440191-100ML
SU8	Microchem	SU8-2025, SU8-2050
显影液	Microchem	SU8 显影液
硅烷	Sigma-Aldrich	448931-10G
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
紫外灯	Oriel	66943	200W Hg Oriel 光源
热风烘箱	Ultra Instruments	定制	设定为 50 °C
加热板	IKA 实验室设备	3810000	http://www.ika.com
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-32G
匀胶机	半导体生产系统公司	SPIN150-NPP	www.SPS-Europe.com
玻璃盖玻片	Gold Seal	22 × 22 mm，No. 1 厚度
C. elegans	Caenorhabditis 遗传中心（CGC）	e1265, ayIs4
Drosophila	Bloomington	P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
斑马鱼	印度野生型	野生型
Tygon 管	Sigma	Z279803
微针	Sigma	Z118044	切成 1 cm 长的片段
三通旋塞阀	Sigma	S7521
Harris 打孔器	Sigma	Z708631
压缩氮气	本地气体供应商		使用减压阀控制压力
体视显微镜	Nikon	SMZ645
共聚焦显微镜	Andor Olympus	Yokogawa 转盘共聚焦显微镜
ImageJ	美国国立卫生研究院	www.rsbweb.nih.gov/ij	基于 Java 的图像处理程序