耐力训练方案及黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的纵向性能检测

摘要

我们描述了针对重要遗传学模型物种黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的首个耐力训练方案，并概述了多种用于评估训练后运动能力改善的检测方法。

摘要

现代医学研究人员面临的最紧迫问题之一是肥胖水平的急剧上升，以及随之增加的相关疾病，如糖尿病和心血管疾病^1-3。针对这些相关健康问题的一项重要研究课题，是耐力运动作为有益干预手段所发挥的作用。

运动训练是一种经济、非侵入性的干预手段，具有多种有益效果，包括减少过多体脂⁴、提高骨骼肌胰岛素敏感性⁵、增强抗炎和抗氧化反应⁶，以及改善心肌细胞的收缩能力⁷。已知低强度运动可增加人类⁸和小鼠的线粒体活性及生物合成，其中转录共激活因子PGC1-α发挥重要的中介作用^9,10。

尽管运动是防治多种重要年龄相关疾病的有效手段，但由于缺乏适用于短寿命遗传模型物种的耐力训练方案，大规模的纵向遗传学研究一直受到阻碍。Drosophila 拥有丰富的遗传操作工具，加之其寿命短、饲养成本低，使其成为深入研究这些遗传机制的理想模型。基于此，我们开发了一种名为 Power Tower 的新型装置，用于对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行大规模的运动训练¹¹。Power Tower 利用果蝇天生的负向趋地性行为，反复诱导其快速攀爬。每当装置将果蝇所在的平台抬起后迅速下落时，果蝇便会本能地向上攀爬。只要设备持续运行，或直到果蝇疲劳至无法响应为止，它们都会持续作出攀爬反应。因此，研究人员可利用该装置同时对大量年龄一致且基因型相同的果蝇进行训练。此外，我们还描述了若干配套的检测方法，可用于追踪果蝇群体在训练过程中的纵向变化情况。

方案

1. 功率塔的设置与操作

1. 将动力塔放置在一块矩形胶合板上，该胶合板通过夹具固定在桌面上。一个来自Grainger的4.5 rpm齿轮电机安装在四块2英寸×6英寸木板和一块¾英寸厚胶合板的顶部。电机、交直流调速器、保险丝和开关通过接线盒连接在一起。
2. 为了冷却电机，在一块垂直放置的½英寸厚胶合板上切割出一个直径为3英寸的孔。在一侧，将一个3英寸风扇固定在胶合板上；在另一侧，则安装一个直径为3英寸的金属圆筒。
3. 一根定制的旋转臂，其末端装有滚轮，与电机相连。电机及其连接的旋转臂顺时针旋转，向下推动一根弯曲的¾英寸方管的一端，该方管通过门铰链固定在胶合板上。在方管顶部、平台下方的位置安装有一个轮子，使其能够沿正上方的平台滚动。
4. 旋转臂向下推动方管的一端，从而抬起另一端，使一个双层平台上升（图1D）。当旋转臂上的滚轮脱离方管后，旋转臂可回转至起始位置，使平台回落（图1F）。
5. 平台由放置在胶合板上的支架构成，并通过绑在螺丝扣上的弹力绳固定。平台沿着由支架固定在胶合板上的抽屉滑轨上下滑动。
6. 将样品管插入支架中，并用一个由弹力绳固定的方形网格筛网加以固定。
7. 在平台下方放置一块泡沫塑料垫，以缓冲下落时的冲击力。
8. 调节电机功率，使完整旋转一圈的时间为15秒。

2. 运动方案

1. 果蝇饲养在温度为 25 °C、湿度为 50%、光照/黑暗周期为 12 小时的培养箱中。运动训练及运动能力评估均在温度受控（25 °C）的室内进行。
2. 果蝇在相互之间 1–2 天的年龄范围内收集并匹配。为纵向监测耐力和负向重力趋向（爬行）能力这两种反映运动训练效果的生理指标，至少需要 240 只果蝇。纵向监测可排除不同群体间变异的干扰，单独分析每个群体相对于起始值的诱导变化。其他实验所需的果蝇应根据需要进行收集。
3. 收集后，果蝇被分为 120 只实验组果蝇（将接受运动训练方案）和 120 只对照组果蝇（不进行运动）。果蝇以每瓶 20 只的方式储存于小瓶中。实验组果蝇的小瓶使用坚固的醋酸纤维素 Flugs 密封，对照组（未运动）果蝇的小瓶则使用柔软的海绵塞密封，后者可在 Power Tower 上使用时向下按压以固定果蝇。选用海绵作为固定材料，是因为其可调节的尺寸便于将其放置在小瓶底部附近；较软的海绵材料也可减少由较硬的 Flugs 所致的损伤。
4. Power Tower 上的果蝇储存在含有 5 mL 食物的小瓶中进行运动训练，这使得果蝇着陆更柔和，优于在空瓶中训练的果蝇。食物通常由 10% 蔗糖、10% 酵母和 2% 琼脂溶于水中制成，尽管在训练过程中我们通常观察到果蝇进食较少。若在训练期间使用空瓶，果蝇受伤的比例将显著增加。
5. Power Tower 在温度受控（维持在 25 °C）的房间内运行。将实验组果蝇放置于 Power Tower 上并使其爬行。对照组果蝇也放置于 Power Tower 上，但将海绵塞向下压至果蝇上方约 3 mm 处，以限制其活动。该组用于控制与运动无关的 Power Tower 本身可能带来的任何影响。尽管这些果蝇仍有一定活动空间，但我们反复观察到在此条件下果蝇活动极少，且未表现出对运动的生理反应。此外，也可考虑增设一组完全不放置于 Power Tower 上的额外对照组。
6. 果蝇每周连续五天进行训练，采用递增式训练计划（图 2）。第一周每次训练 2 小时，第二周每次 2.5 小时，第三周每次 3 小时。尽管已测试过其他训练方案，但该方案在不同基因型和不同实验条件下均能产生一致的结果。然而，该方案仍可根据特定实验需求进行多种调整。

3. 运动与运动机能疲劳

1. 在耐力运动中达到疲劳的时间是确认和/或量化特定群体运动能力的一个有用生理指标。疲劳检测可在将用于训练实验的群体中进行纵向评估。该检测可在训练前、训练方案完成后或两者时间点进行。如果需要追踪训练过程中的逐步进展，也可增加其他中间时间点。此外，疲劳检测还可用于测量除训练方案外其他干预措施（如饮食改变）对运动耐力的影响（图3B）。
2. 疲劳检测应在未进行训练的日期进行。将实验组和对照组果蝇分别以每瓶20只的密度放入Power Tower的玻璃瓶中，使其持续攀爬直至疲劳。疲劳的判定标准为果蝇无法对负向趋地性刺激产生攀爬反应。疲劳行为通过肉眼观察进行评分。
3. 当某瓶果蝇在连续四次下落后，能够攀爬超过2英寸的个体不超过5只时，该瓶果蝇即被视为“已疲劳”。在Power Tower仍在运行的同时，将已疲劳的玻璃瓶移除，并记录移除时间。移除时间可绘制为嵌套直方图，或以“失效时间”图（time-to-failure plot）形式展示。一个以“失效时间”图展示数据的示例如图3B所示。
4. 玻璃瓶每10分钟监测一次，最长监测时间为10小时（图3B）。

4. 运动、年龄与运动能力

1. 由于该训练方案依赖于诱导的奔跑行为，量化训练效果的主要检测方法是在训练过程中纵向测量平均奔跑速度的变化。在训练期间，每天对接受训练和未接受训练的120只果蝇群体进行负向趋地性刺激反应测试。采用Gargano等人（2005）描述的RING技术来测量果蝇的攀爬能力¹²。简而言之，该技术通过测量在诱导负向趋地性后，一定时间内一群果蝇在试管中爬升的平均高度来评估其能力。在规定时间内爬升的高度等同于攀爬速度。测量在每天训练前进行，以避免当日跑步后疲劳对结果造成干扰。
2. 在我们的标准方案中，果蝇接受为期三周的锻炼，攀爬能力共检测五周：包括锻炼期间的三周以及锻炼停止后的两周（图2）。这使得实验者能够绘制出运动对活动能力的影响是否在训练结束后仍然持续。
3. 分析攀爬能力时，使用每个群体每日RING表现的四张照片。每张照片包含六个试管。诱导负向趋地性后，使用定时相机在设定秒数后拍摄照片。我们通常使用2秒，但可根据实验条件调整时间。对于每张照片中的每个试管，将其等分为四个高度相同的象限，并使用图像处理软件根据果蝇在规定时间内到达的象限为其评分：爬至最上象限的果蝇得4分，次高象限得3分，第二高象限得2分，最低象限得1分；完全未从底部爬起的果蝇得0分。
4. 对于每张照片中的每个试管，通过计算该试管内所有果蝇得分的平均值生成“攀爬指数”。随后将同一试管在四张照片中所得指数再次取平均，得到该日的最终攀爬指数。
5. 所有负向趋地性实验均采用纵向方式进行。为减少不同群体间初始攀爬能力差异的影响，并突出运动训练引起的能力相对变化，结果均以初始“运动前”得分进行归一化处理。初始得分取前三个测试日攀爬指数的平均值，并定义为1。后续各次测试结果则表示为初始指数的百分比。

5. 代表性结果

野生型果蝇在耐力训练方案下表现出与年龄相关的攀爬能力下降减缓，且在训练结束后该效应仍持续存在，这通过为期五周龄的纵向 RING 检测得以反映（图 3A）。这种负向趋地性衰退的延缓是一种标准的表型反应，可作为阳性对照，以确保野生型果蝇的运动反应正常发生。该数据集展示了如何利用 Power Tower 程序诱导运动作为行为输入的示例。随后可进一步评估各种遗传或环境因素对该效应的调节能力。

相反，Power Tower 还可在多种实验设计中作为输出使用。例如，可以改变基因型、饮食或其他条件，然后利用 Power Tower 检测这些变化对运动生理学的影响。在此，我们展示了这种方法的一个示例：当测试饮食中蔗糖含量百分比不同的果蝇的疲劳时间时，蔗糖含量的增加与耐力能力的提高呈正相关（图 3B）。

图 1. 动力塔的操作。（A-C） 带电机的弯曲臂带动附着的滚轮顺时针旋转，直至接触到弯曲的方管。（D,E） 弯曲臂向下推动弯曲方管，使承载果蝇样品管的平台上升。（F） 当弯曲臂离开方管时，平台随之回落，迫使果蝇重新回到样品管底部。

图2. 推荐的运动实验方案。接受训练方案的果蝇每周进行五天运动，持续三周的渐进式训练计划，每周运动时间比前一周增加30分钟，从最初的2小时开始逐步延长。标准分析包括在运动程序开始前和结束后进行疲劳检测，以及从第1周到第5周进行RING检测。所有检测均以相同数量的未运动果蝇作为阴性对照，并进行双重复实验。研究人员可根据需要开展其他各类生理或生化检测。

图 3. 耐力运动改变活动能力的多个方面。 （A）在一对雄性 Y¹W^67C23 果蝇群体中，随年龄纵向进行的 RING 检测。对年龄匹配、基因相同的运动组与未运动对照组果蝇每日测量其平均攀爬速度。结果以攀爬指数表示，该指数标准化为前三个测量日的平均攀爬高度。与同龄未运动的同胞果蝇相比，经过运动训练的果蝇在不同年龄阶段表现出较弱的负向趋地性能力随年龄下降趋势（双因素方差分析，p < 0.005）。（B）对年龄匹配的雌性 Canton S 果蝇进行为期 8 小时的疲劳检测，结果显示饮食中蔗糖含量对疲劳时间有显著影响（Log-rank 检验，p < 0.0001）。实验前，果蝇饲喂含酵母/蔗糖/琼脂的饮食，其中酵母浓度为 10%（重量/体积），蔗糖含量百分比则有所不同。每种饮食条件测试五个装有各 20 只果蝇的试管。图中显示在特定时间点仍有多少试管中至少有五只果蝇在持续奔跑。这些结果可从统计学和图形上视为生存曲线（或失效时间曲线），其中每支试管的“失效”定义为少于五只果蝇继续对负向趋地性刺激作出反应的时间点。需注意，还可采用许多其他可能的研究设计和统计处理方法，数据处理和测量方式应根据具体研究目的进行调整。

讨论

本文所介绍的通用实验方案已成功用于记录训练后的生理效应。然而，该方案中若干部分可根据特定的实验需求进行修改。例如，可根据需要调整训练时长和训练轮次，以增加或降低训练强度。用于测量负向趋地性能力的容器高度也可调整，以扩大可记录的改善空间。此外，还可采用多种方法实现爬行速度定量的自动化。原则上，任何能够区分果蝇与背景的软件程序均可用于加快数据采集过程。

然而，该方案的某些方面只能在极为谨慎的情况下进行修改。例如，初步实验强烈表明，每周至少休息一天通常比持续每日训练更能促进更大的改善。此外，已知昼夜节律和温度会影响变温动物的活动。训练时间可以在一天中的不同时间进行，但在相互比较的特定组内应始终保持一致，以避免昼夜节律的混杂效应。温度控制也至关重要，我们建议使用专用的恒温房间来放置运动设备。最后，雄性和雌性必须分开饲养和测量，以避免生育能力以及运动能力上的性别差异可能带来的混杂效应。

该方法的潜在应用仅受限于研究者的想象力。在初步研究中，我们已将该方法应用于以下三个广泛领域：

1. 检测耐力运动对不同年龄野生型生物学多个方面的影响。
2. 检测耐力运动对特定突变表型的影响。
3. 筛选执行运动益处所必需的遗传因子。

这些应用中的每一项都包含多种具体的可能性。根据我们的初步经验，突变体表型的差异与运动水平的关系几乎与饮食因素同样重要。利用无脊椎动物模型来更好地理解饮食、运动与衰老生理学之间的关系，可能是本实验方案最重要的普遍应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dayton 齿轮电机	Grainger	1LRA6A
Raco 电气箱	Grainger	5A052
Raco 盖板	Grainger	5A053
Cooper Bussmann 保险丝	Grainger	6F043
Cooper Bussmann 保险丝座	Grainger	1DD33
Carling Technologies 开关	Grainger	2X464
Dayton 交流/直流调速控制器	Grainger	4X796
窄型塑料小瓶封口塞	Genesee Scientific	49-102