制备矢状切片以研究啮齿类动物内侧内嗅皮层的背-腹向组织结构

摘要

我们描述了制备和记录保持内侧内嗅皮层（MEC）背腹轴完整性的脑切片并进行电生理记录的操作步骤。由于位置的神经编码在MEC内遵循背腹向的组织方式，这些操作步骤有助于研究与导航和记忆相关的细胞机制。

摘要

大脑中的计算依赖于神经元对突触输入作出适当反应。神经元在决定其对突触输入反应方式的膜离子通道的种类和分布上各不相同。然而，这些细胞特性与在行为动物中神经元功能之间的关系尚不明确。解决这一问题的一种方法是研究空间有序的神经环路，其中单个神经元的位置与其所编码的信息或执行的计算相对应¹。采用这种方法的实验揭示了感觉和认知环路中突触反应调节以实现信息编码的基本原理^2,3。

内侧内嗅皮层（MEC）沿背腹轴的空间表征拓扑结构为建立细胞机制与空间认知相关计算之间的关系提供了机会。啮齿类动物MEC第II层神经元通过类似网格的放电野来编码位置信息^4-6。位于MEC背侧区域的神经元，其构成网格的各个放电野之间的距离约为30 cm，而随着位置逐渐向腹侧移动，该距离增加至超过1 m。多项研究发现，MEC第II层神经元的某些细胞特性也随其在背腹轴上的位置不同而存在差异，这种差异与网格放电野间距的变化模式相似，提示这些细胞特性在空间计算中具有重要作用^2,7-10。

本文描述了制备脑切片并进行电生理记录的实验步骤，该切片保留内侧内嗅皮层（MEC）背侧-腹侧的完整范围，从而能够研究MEC神经元生物物理特性与解剖学特性的拓扑组织。使用水平切片制备MEC的传统方法^7,8,11,12难以精确定位已识别神经元相对于解剖标志的背侧-腹侧位置，因为难以确定切片确切背腹位置的参考点。本文所述方法可实现对记录细胞在MEC背侧-腹侧轴上位置的精确且一致的测量，同时可观察分子梯度分布^2,10。这些方法已针对成年小鼠（> 28天）优化建立，并已成功应用于年龄长达1.5岁的小鼠。经过适当调整后，也可用于更年轻的小鼠或其他啮齿类动物。标准化的制备与测量体系将有助于系统性地研究该脑区的细胞特性与微环路特性。

方案

1. 矢状切片制备

1.1 分离大脑半球

所有动物实验均应遵循当地的伦理审查和国家法规。就本文所述实验而言，研究工作符合英国《1986年动物（科学程序）法案》。我们通常在取出小鼠脑组织前，采用颈椎脱位法对小鼠实施非麻醉性安乐死。 alternatively，也可对小鼠实施终末麻醉，但在此情况下，可能需要确定所选用的麻醉剂是否会影响神经元的特性。

取出小鼠脑组织，并立即置于冰冷（4-8 °C）的切割用人造脑脊液（ACSF）中，该溶液用碳合气（95% O₂, 5% CO₂）饱和充气（溶液成分见表1）。

在最多三分钟内，用刮铲小心地将脑组织从切割用ACSF溶液中取出，并轻轻将其竖直放置（背侧朝上）于已用切割用ACSF溶液润湿的滤纸上（图1A）。

为便于准确安装半球，使用刀片或解剖刀尽可能去除小脑组织，但不得损伤内侧内嗅皮层（MEC，位于端脑的尾端极）；并通过冠状面切开，切除端脑的前三分之一部分（图1B）。

将脑组织沿中线的垂直平面进行半切，注意确保切面准确地位于中线矢状面（图1C

讨论

为了便于研究内侧内嗅皮层（MEC）回路特性中遵循背侧-腹侧排列规律的现象，本文详细描述了一种制备保留MEC背侧-腹侧范围的旁矢状切片的方法。

关键步骤

从动物体内取出脑组织。需特别注意避免对脑组织施加压力，这一点比快速取出脑组织更为重要。

切片。 切片应牢固地粘附于孵育室的底部。振动切片机应具有 z 轴振动幅度 < 2 μm，并应使用高振幅、低速度的设置。不同型号的设备其最佳设置可能有所不同，需通过反复试验确定。

监测溶液温度。我们发现，脑片质量在切割过程中及切割后对温度较为敏感。若超出推荐的温度范围，健康神经元的数量会减少，神经元更难进行膜片钳记录，且对突触输入的反应也会减弱。

成像。 在记录前可视化细胞时，科勒照明和视场光阑.......