我们描述了制备和记录保持内侧内嗅皮层（MEC）背腹轴完整性的脑切片并进行电生理记录的操作步骤。由于位置的神经编码在MEC内遵循背腹向的组织方式，这些操作步骤有助于研究与导航和记忆相关的细胞机制。
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摘要
摘要
大脑中的计算依赖于神经元对突触输入作出适当反应。神经元在决定其对突触输入反应方式的膜离子通道的种类和分布上各不相同。然而，这些细胞特性与在行为动物中神经元功能之间的关系尚不明确。解决这一问题的一种方法是研究空间有序的神经环路，其中单个神经元的位置与其所编码的信息或执行的计算相对应1。采用这种方法的实验揭示了感觉和认知环路中突触反应调节以实现信息编码的基本原理2,3。
内侧内嗅皮层（MEC）沿背腹轴的空间表征拓扑结构为建立细胞机制与空间认知相关计算之间的关系提供了机会。啮齿类动物MEC第II层神经元通过类似网格的放电野来编码位置信息4-6。位于MEC背侧区域的神经元，其构成网格的各个放电野之间的距离约为30 cm，而随着位置逐渐向腹侧移动，该距离增加至超过1 m。多项研究发现，MEC第II层神经元的某些细胞特性也随其在背腹轴上的位置不同而存在差异，这种差异与网格放电野间距的变化模式相似，提示这些细胞特性在空间计算中具有重要作用2,7-10。
本文描述了制备脑切片并进行电生理记录的实验步骤，该切片保留内侧内嗅皮层（MEC）背侧-腹侧的完整范围，从而能够研究MEC神经元生物物理特性与解剖学特性的拓扑组织。使用水平切片制备MEC的传统方法7,8,11,12难以精确定位已识别神经元相对于解剖标志的背侧-腹侧位置，因为难以确定切片确切背腹位置的参考点。本文所述方法可实现对记录细胞在MEC背侧-腹侧轴上位置的精确且一致的测量，同时可观察分子梯度分布2,10。这些方法已针对成年小鼠（> 28天）优化建立，并已成功应用于年龄长达1.5岁的小鼠。经过适当调整后，也可用于更年轻的小鼠或其他啮齿类动物。标准化的制备与测量体系将有助于系统性地研究该脑区的细胞特性与微环路特性。
方案
1. 矢状切片制备
1.1 分离大脑半球
所有动物实验均应遵循当地的伦理审查和国家法规。就本文所述实验而言，研究工作符合英国《1986年动物（科学程序）法案》。我们通常在取出小鼠脑组织前，采用颈椎脱位法对小鼠实施非麻醉性安乐死。 alternatively，也可对小鼠实施终末麻醉，但在此情况下，可能需要确定所选用的麻醉剂是否会影响神经元的特性。
取出小鼠脑组织，并立即置于冰冷（4-8 °C）的切割用人造脑脊液（ACSF）中，该溶液用碳合气（95% O2, 5% CO2）饱和充气（溶液成分见表1）。
在最多三分钟内，用刮铲小心地将脑组织从切割用ACSF溶液中取出，并轻轻将其竖直放置（背侧朝上）于已用切割用ACSF溶液润湿的滤纸上（图1A）。
为便于准确安装半球，使用刀片或解剖刀尽可能去除小脑组织，但不得损伤内侧内嗅皮层（MEC，位于端脑的尾端极）；并通过冠状面切开，切除端脑的前三分之一部分（图1B）。
将脑组织沿中线的垂直平面进行半切，注意确保切面准确地位于中线矢状面（图1C）。
将半脑放回含有气泡的切割型ACSF溶液中，持续一个半分钟。
1.2 将半球体安装到振动切片机上
在安装前，确保振动切片机刀片的切割刃与水平方向成20度角（图1D）。在安装表面上，沿振动切片机刀片方向涂抹一条浅层的超级胶水，宽度约为一个半球，长度足以并排容纳两个半球。
小心操作以尽量减少物理损伤，用刮铲将每个半脑从切割用的ACSF中取出，并将其放置在刮铲上，使半脑的内侧面向刮铲，背侧朝向切片机刀片。轻轻地将每个半脑滑至超级胶水条上，注意确保每个半脑的内侧面与切片机底座平行。我们发现，为获得最佳效果，每个半脑的背侧面应与振动切片机刀片平行且朝向刀片（图1D）。
1.3 切片过程中组织样本的维持
封片后立即将脑半球浸入冷切割人工脑脊液（ACSF，4 - 8 °C）中。在整个切片过程中保持溶液温度和碳氧饱和状态。如果无法在切片室中直接冷却并通入碳氧混合气体，应定期用新鲜的、预冷并已通入碳氧混合气体的切割ACSF溶液更换切片室中的溶液。
1.4 切片
使用振动切片机，在矢状面上从两个半球去除皮层，直至观察到内侧内嗅皮层（MEC）最外侧的边界（通常位于外侧表面下方约1 mm处）（图1F）。
每次切片后，将振动切片机刀片抬起约 200 μm，以避免刀片回拖时刮擦并损伤暴露的组织。同时从两个半球切取 400 μm 厚的旁矢状切片（若两个半球如图 1D所示对齐，则可同时切割），直至到达内侧内嗅皮层（MEC）的内侧边界。该位置可通过以下特征识别：海马腹尾侧弯曲处周围缺乏明显的白色条带（即外囊）、其头侧边界呈非凸形，以及背尾侧呈现明显的“角状”转折。图 1E展示了在MEC外侧的旁矢状切面上海马呈圆形的外观。图 1F-G展示了在不同外侧-内侧位置切片时，MEC区域内切片的形态变化。注意随着切片位置逐渐内移，海马形态逐步变为更明显的豆形。每个半球通常可获得两到三片 400 μm 厚、包含MEC的切片。
1.5 孵育切片
每次切割后，立即将切片置于盛有饱和碳氧混合气体的标准人工脑脊液（ACSF）中，并在35 °C水浴中保存。切片完成后，将其在35 °C的ACSF中孵育约15分钟。
将切片架从水浴中取出，在室温下继续用碳氧混合气体（carbogen）通气至少45分钟。
2. 矢状切片实验示例
使用该制备方法的典型实验是从内侧内嗅皮层第二层的星形细胞进行电生理记录。
2.1 优化光学系统
在开始记录之前，确保聚光镜聚焦在切片平面上（科勒照明），并在高倍物镜（例如 40x）下居中对准。
2.2 鉴定目标细胞
使用低倍镜（例如 4x）物镜确定内侧内嗅皮层（MEC）内的大致记录区域（图 2A-B）。切换至高倍镜物镜，以识别该区域内可存活的细胞（图 2C-D）。
例如，II层星形细胞可通过其多边形或卵圆形形态、多条直径相似的主要树突以及缺乏单一粗大顶树突的特征进行视觉识别2,13,14。这些细胞可靠地分布于I/II层交界边缘，此处细胞数量丰富，常成小群出现2,9（图2C-D）。其他类型的细胞，如中间神经元和锥体细胞，也应能够被识别。
此时可开展实验，例如采用全细胞膜片钳技术记录已鉴定神经元的膜电位或膜电流，以及利用电刺激或光遗传学方法激活记录神经元的突触输入。可通过记录神经元的电生理特性，并在细胞内溶液中加入荧光标记物来验证神经元的身份。
3. 测量背腹轴方向的位置
3.1 成像感兴趣区域及其周围切片的位置
为了确定记录到的神经元在背腹轴上的位置，首先使用低倍物镜对脑片中的内侧内嗅皮层（MEC）区域及其周围区域进行成像。可通过例如在图像中包含记录电极（图3A），或逐步收窄视场光阑以在另一幅图像中在目标位置周围留下一个明亮的圆圈，来标记感兴趣的位置。为了在图像中精确定位记录位置，可将后一幅图像叠加到原始的记录位置及其周围区域的图像上（图3B）。从腹侧记录位置至MEC背侧边界的区域可能需要最多3幅独立的低倍率（4x）图像进行覆盖。随后可使用图像处理软件将这些图像拼接成一幅完整的图像，用于进行距离测量（图3）。记录完成后，可通过在细胞内溶液中加入非活性标记物（如生物胞素或Alexa染料），并结合记录后对组织进行适当的处理，进一步验证神经元的身份和位置2。
3.2 确定内侧内嗅皮层的背侧边界
内侧内嗅皮层的背侧边界提供了一个方便的解剖标志，可用于测量背腹向位置。内侧内嗅皮层的腹侧边界则不那么清晰明确。
图4展示了在不同内侧-外侧位置的尼氏染色切片中定义的MEC细胞标志物在微分干涉差（DIC）照明下的表现。
图4 A 显示环形的海马结构（图4 (i)），以及无副下托突起伸入第I层（图4 (iv)），这些特征与包含外侧内嗅皮层（Lateral Entorhinal Cortex, LEC）的旁矢状切片相关。
图4 B-C 显示包含内侧内嗅皮层（MEC）的典型切片。在微分干涉相差（DIC）照明切片中，显著的深色背侧内嗅/副下托边界区域的背侧部分包含副下托区域。在第(iii)列对应的尼氏染色图像中，副下托区域清晰可见。MEC的背侧边界（图4B和4C第(iv)列中的黑色箭头）位于副下托细胞群的腹侧，这些细胞明显突入第I层（图4B和4C第(iv)列中的红色箭头）。
比较图4B和4C中的(ii)和(iii)列可见，Nissl染色切片中内侧内嗅皮层（MEC）的背侧边界对应于微分干涉差（DIC）切片中较暗的内嗅皮层/副下托边界区域背侧边缘的腹侧位置（黑色箭头）。该边界的定位可通过DIC图像并结合参考图像进行估计（另见参考文献14）。未来利用分子标记物对MEC背侧边界进行进一步验证，将有助于提高该定位的准确性。需要注意的是，染色的参考切片以及用于形态学鉴定标记神经元的切片可能会发生显著收缩。因此，在DIC图像与参考切片之间基于解剖标志物比较绝对距离时，必须首先测量并校正组织收缩的影响（例如参见参考文献2）。
3.3 校准并测量距离
为了便于在图像中测量距离，应使用相同的低倍物镜对参考网格成像，以建立像素与距离之间的换算比例。使用图形软件测量从内侧内嗅皮层（MEC）背侧边界到目标位置沿MEC轮廓的像素距离，并将像素距离转换为以μm为单位的实际距离（图5A）。如果神经元被生物胞素等标记物填充，则可通过适当的处理方法进一步确定所记录神经元的位置（参见例如参考文献2）。
4. 代表性结果
图5A 显示了一个记录后获得的旁矢状切面低倍率（4x）复合图像示例，图中标注了记录神经元的位置以及叠加的测量参考标记。标记的背侧和腹侧星形细胞的记录结果如图5B所示。这些记录有助于确定细胞的身份，并展示了内侧内嗅皮层II层星形细胞在背侧与腹侧位置上电生理特性的差异。
图 1. 矢状切片的制备。A 整个大脑背侧朝上放置在用切割用人工脑脊液（ACSF）润湿的滤纸上。B 去除小脑和额叶皮层前三分之一后的脑组织。C 已半切的大脑，准备固定。D 将半脑固定在胶条上，使其与振动切片机刀片的切割边缘平行，随后浸入切割用 ACSF 中进行切片。E 在切除外侧组织后、但尚未达到标准内侧内嗅皮层（MEC）矢状切片所需足够内侧位置时，含有外侧内嗅皮层（LEC）的切片外观。F 进一步切除 400 μm 组织后的 MEC“外侧”部分（该表面比 (F) 中所示位置内侧 400 μm）。G 切下一块 400 μm 厚的矢状切片后，MEC 的“内侧”部分外观。H-I 分别对应 E-F 的示意图，标示了解剖标志：c：小脑，L：外侧内嗅皮层（LEC），m：内侧内嗅皮层（MEC），h：海马，橙色：外囊，蓝色：胼胝体，青色：齿状回，绿色：CA3 和 CA1。含有 LEC 的切片中，海马前端边界的形态呈凹形（H 中黑箭头），而在仅含 MEC 的切片中，该边界可呈直线形（I 中红箭头）或凹形（J 中红箭头）。彩色解剖结构的大致形状来源于艾伦脑图谱中的标注（http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html）。
图 2. 在微分干涉差（DIC）照明下识别内侧内嗅皮层（MEC）第 II 层细胞。A 低倍率（4x）下旁矢状脑切片的示例复合图像。多张单独图像经过对齐和融合处理，以消除干扰性的边缘和渐晕效应。重要解剖标志区域：h：海马体，m：内侧内嗅皮层（MEC）。B 包含 MEC 第 II 层的单张低倍率（4x）图像的裁剪区域，该层在图像右侧边缘附近表现为一条深色垂直条带。C 高倍率（40x）下采用 DIC 照明的 MEC 第 II 层图像。该图像由多张图像对齐并融合而成。中央密集的“柱状”细胞群即为第 II 层。D 单张高倍率 DIC 图像，显示第 II 层中一组健康的假定星形细胞和中间神经元。如图所示，星形细胞常成簇分布于第 I/II 层交界处，而锥体细胞则更靠近第 II/III 层交界区域。A–C 中的虚线框分别标示了 B–D 图像区域的范围。比例尺：A 和 B 中为 500 μm，C 和 D 中为 100 μm。
图3. 测量感兴趣位置的背腹向坐标。A 对齐的低倍率（4x）图像，包含内侧内嗅皮层（MEC）从感兴趣位置（由记录电极尖端标记）到深色的内嗅皮层/旁下托边界区域标志（用于确定MEC的背侧边界——见图4）之间的完整背腹向范围。B 与A相同，但叠加了使用缩小视野光圈的图像（以降低不透明度叠加），代替记录电极来标记感兴趣位置。
图4. 通过斜矢状切面的微分干涉差（DIC）图像估算内侧内嗅皮层（MEC）的背侧边界。A-C 来自内嗅皮层的斜矢状切面（由外侧至内侧）。DIC图像与尼氏染色切片来自不同的小鼠。A-C 第(i)列：完整的斜矢状切片（厚400 μm）（低倍镜（4x）图像拼接融合而成的合成图像）。A-C 第(ii)列：内嗅皮层的放大图像，每张图顶部可见特征性的深色内嗅区/副下托边界区域。A-C 第(iii)列：来自另一只小鼠的尼氏染色切片（厚40 μm），与第(ii)列图像对齐。其中颜色更深、细胞更密集的细胞层为II层。通过比较第(ii)列和第(iii)列，可看出尼氏染色的细胞在DIC图像中的表现形态。A-C 第(iv)列：尼氏染色切片的细节图像。B和C的第(iv)列包含副下托的细胞（对应DIC图像中深色内嗅区/副下托边界区域的背侧部分）以及背侧MEC的细胞。在B(iv)和C(iv)中，副下托的大片背侧细胞群明显向I层深处延伸（红色箭头所示）。这些细胞群的腹侧边缘即对应MEC的背侧边界（黑色箭头所示）。在A(iv)中，副下托细胞群缺失，表明该切片位置过于外侧，不适合标准的斜矢状MEC切片制备。所有图中，黑色箭头指示MEC的背侧边界，灰色箭头指示MEC的大致腹侧边界。
图 5. 代表性结果。 A 对 图 3A 中图像进行混合与裁剪后的部分。背侧细胞和腹侧细胞的位置分别由蓝色和绿色实心圆圈标示。黑色箭头标记了内侧内嗅皮层（MEC）背侧边界的估计位置，并通过白色虚线延伸至深层。白色实线为参考线，表示从 MEC 背侧边界到腹侧细胞位置的像素距离测量路径。比例尺：500 μm。B 来自 A 中标示细胞的电生理记录轨迹。从左至右：用于计算输入电阻的电流阶跃下的亚阈值反应、大正向电流阶跃下的放电反应、动作电位细节。
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讨论
为了便于研究内侧内嗅皮层（MEC）回路特性中遵循背侧-腹侧排列规律的现象，本文详细描述了一种制备保留MEC背侧-腹侧范围的旁矢状切片的方法。
关键步骤
从动物体内取出脑组织。需特别注意避免对脑组织施加压力，这一点比快速取出脑组织更为重要。
切片。 切片应牢固地粘附于孵育室的底部。振动切片机应具有 z 轴振动幅度 < 2 μm，并应使用高振幅、低速度的设置。不同型号的设备其最佳设置可能有所不同，需通过反复试验确定。
监测溶液温度。我们发现，脑片质量在切割过程中及切割后对温度较为敏感。若超出推荐的温度范围，健康神经元的数量会减少，神经元更难进行膜片钳记录，且对突触输入的反应也会减弱。
成像。 在记录前可视化细胞时，科勒照明和视场光阑...
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致谢
感谢以下机构的支持：英国联邦奖学金委员会资助（HP）、英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）（HP）、英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）（MFN）以及欧盟玛丽·居里行动计划（MFN）。
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