方法文章

利用停流分光光度法监测黄素依赖性单加氧酶的还原与氧化半反应

17.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3803

⸱

2012年3月18日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Virginia Polytechnic Institute and State University

本文内容

摘要

我们描述了使用停流仪来研究还原和氧化半反应的方法 Aspergillus fumigatus 铁载体A（SidA），一种黄素依赖性单加氧酶。随后，我们展示了SidA反应中各物种对应的光谱，并计算了其生成的速率常数。

摘要

Aspergillus fumigatus 铁载体 A（SidA）是一种含 FAD 的单加氧酶，在羟肟酸类铁载体（如铁铬菌素或 N',N",N'''-三乙酰基 fusarinine C）的生物合成过程中催化鸟氨酸的羟基化反应，而这些铁载体对致病性至关重要1。SidA 催化的反应可分为还原半反应和氧化半反应（方案 1）。在还原半反应中，Af SidA 结合的氧化态 FAD 被 NADPH 还原2,3。在氧化半反应中，还原态辅因子与分子氧反应生成 C4a-过氧黄素中间体，后者将一个氧原子转移至鸟氨酸。本文描述了一种在厌氧手套箱中使用停流仪测定 SidA 反应速率并检测其不同光谱形式的方法。在停流仪中，少量反应物被快速混合，随后由停止注射器停止流动（图 1），并实时记录观察池中溶液的光谱变化。实验的第一部分展示了如何在单混合模式下使用停流仪直接测定 NADPH 在厌氧条件下对 Af SidA 中黄素的还原过程。随后采用双混合模式：先在老化环路中使 Af SidA 在厌氧条件下与 NADPH 反应一定时间，再将其引入观察池中与分子氧反应（图 1）。本实验需使用厌氧缓冲液，因为在仅监测还原半反应时，若溶液中存在氧气，会与还原态黄素辅因子反应生成 C4a-过氧黄素中间体，该中间体最终将衰变为氧化态黄素，导致酶发生完全转化，从而无法准确测定还原速率。在研究氧化半反应时，必须在无氧条件下预先还原酶，以便仅观察还原至氧化之间的反应步骤。本实验所用缓冲液之一经氧气饱和，以研究高浓度氧气下的氧化半反应。这些操作通常是研究含黄素单加氧酶的还原或氧化半反应的标准流程。停流法进行的预稳态实验时间尺度为毫秒至秒级，可测定固有速率常数，并检测和鉴定反应中的中间产物4。本文所述方法亦可应用于其他依赖黄素的单加氧酶5,6。

方案

1. 厌氧缓冲液的制备

  1. 配制 1 L 100 mM 磷酸钾缓冲液，pH 7.5。将 250 mL 缓冲液倒入含有搅拌子的 500 mL 布氏烧瓶中。
  2. 用橡胶塞密封烧瓶，并将其置于搅拌台上。将烧瓶的短管连接至施伦克线。
  3. 在室温下对缓冲液进行真空脱气 5 小时，同时持续搅拌。在此期间，每隔 1 小时进行一次真空脱气并用氩气吹扫，共重复 5 次。
  4. 用氩气吹扫烧瓶 10 秒钟，然后将其从真空多通管上断开。将烧瓶放入手套箱中。
  5. 在手套箱中将烧瓶敞口放置过夜，并持续剧烈搅拌。

2. 从停流系统中去除氧气

  1. 配制 1 L 0.1 M 醋酸钠缓冲液，pH 5.0。取 125 mL 该缓冲液加入 250 mL 抽滤瓶中，并执行步骤 1.2–1.4。
  2. 分别使用 1.5 mL Eppendorf 管和 50 mL Falcon 锥形管称取 5 mg 来自Aspergillus niger（181300 U/g）的葡萄糖氧化酶和 0.9 g 葡萄糖。将两个容器均放入手套箱中。
  3. 将葡萄糖氧化酶和葡萄糖溶解于 50 mL 无氧的 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中（终浓度分别为 18.13 U/mL 和 100 mM）。用此溶液填充储液注射器（图 1）。
  4. 确保驱动阀处于“加载”位置，并填充驱动注射器（图 1）。将 F 阀转至“驱动”位置。在 Pro-Data 控制软件中点击Empty清空停止注射器。通过手动提升相应的驱动活塞，将缓冲液从 F 驱动注射器推入流路系统。总共重复此步骤十次。对另外三个驱动注射器执行相同操作。等待一小时。
  5. 用含有葡萄糖氧化酶和葡萄糖的相同缓冲液替换储液注射器中的溶液。重复步骤 2.4。
  6. 重复步骤 2.5，并让溶液在流路系统中静置过夜。
  7. 过夜孵育后，重复步骤 2.5。

3. 制备饱和氧气缓冲液

  1. 配制 100 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.5），取 50 mL 加入含磁力搅拌子的 50 mL 小瓶中。用 Wheaton 瓶塞和 Wheaton 铝盖密封小瓶。
  2. 将小瓶置于冰上。将连接纯氧气罐的长针插入溶液中，同时将另一根短针穿过瓶塞作为排气口。
  3. 在搅拌条件下，用纯氧持续鼓泡通气 1 小时。
  4. 首先从小瓶中移除短针，等待 10 秒后再移除长针。将密封的小瓶放入手套箱中。

4. NADPH 溶液的配制

  1. 在1.5 mL离心管中称取1 mg NADPH，并将其放入手套箱中。
  2. 用300 μL无氧的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.5）溶解NADPH。从手套箱中取出30 μL该溶液，用分光光度计测定NADPH浓度（ε340 nm = 6,270 M-1cm-1）。

5. 酶溶液中氧气的去除

  1. 从冷冻箱中取出 400 μL 酶储备液，在手套箱中解冻。该酶储备液（360 μM）先前用含 100 mM NaCl 的 100 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.5）配制，并用液氮速冻保存。
  2. 将酶溶液转移至一个带有搅拌子的 25 mL 小瓶中，用 Wheaton 瓶塞和 Wheaton 铝帽密封小瓶，然后从小 glove 箱中取出。
  3. 将小瓶置于冰上，并通过将针头插入瓶塞的方式将其连接到施伦克线（Schlenk line）。
  4. 在 1 小时内，每 20 分钟进行一次真空脱气并用氩气吹扫，重复 5 次，以对酶溶液进行除氧。
  5. 用氩气吹扫小瓶 10 秒钟，然后将其从真空多通管上断开。将小瓶放回手套箱内的冰上。

6. 还原半反应：黄素还原的监测

  1. 按照制造商的协议，将停流仪和 Pro-Data 控制软件设置为单次混合模式。
  2. 开启循环水浴（15 °C），并通过向水中通入氮气 20 分钟以去除氧气。这可防止流动系统中产生氧气污染。
  3. 将停流仪的驱动注射器和观察池连接至循环水浴，以维持其温度在 15 °C。
  4. 在 Pro-Data 控制软件的 控制面板 窗口中，选择 光电二极管阵列，外部 触发（以启动停流操作）和对数刻度。
  5. 启动 Pro-Data 查看软件，并定义数据文件的存储目录。
  6. 将储液注射器 C 和 F 中的溶液更换为无氧的 100 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.5）。将 C 和 F 的阀门转至“驱动”位置。在 Pro-Data 控制软件中点击 排空，排空停止注射器。通过手动将相应的驱动活塞总共上提五次，将缓冲液从两个驱动注射器推入流动系统（每次活塞移动前均需点击 排空）。
  7. 为确保葡萄糖氧化酶已完全从流动系统中清除，重复步骤 6.6 共四次。
  8. 在 Pro-Data 控制软件中点击 基线。
  9. 取 100 μL 酶储备液与 1100 μL 无氧的 100 mM 磷酸钾缓冲液混合（在停流混合后的最终浓度为 15 μM）。
  10. 将储液注射器 F 中的溶液更换为酶溶液。将 F 阀门转至“驱动”位置。在 Pro-Data 控制软件中点击 排空，排空停止注射器。通过手动上提相应的驱动活塞，将酶溶液从驱动注射器 F 推入流动系统，共操作三次。在 Pro-Data 控制软件中，将采集时间设置为 60 s。
  11. 确保两个驱动注射器均已装入相应溶液，且驱动活塞与注射器柱塞接触。将两个阀门均转至“驱动”位置，并在 Pro-Data 控制软件中点击 采集 以执行驱动操作。重复此步骤两次，共获得三组平行数据。由此可得到酶氧化态的光谱。
  12. 根据驱动过程中获得的 A452 nm 值，确定混合前的酶浓度（ε452 nm = 13,700 M-1cm-1），并配制 4 mL 浓度为该值 1.5 倍的 NADPH 溶液。
  13. 将储液注射器 C 中的溶液更换为 NADPH 溶液，并按照步骤 6.10 的描述，排空并重新填充停止注射器三次。
  14. 重复步骤 6.11。由此可得到酶还原过程中的光谱。

7. 氧化半反应：黄素氧化过程的监测

  1. 按照制造商的协议，将停流仪和 Pro-Data 控制软件准备为双混合模式。
  2. 重复步骤 6.2–6.5。
  3. 将四个储液器注射器中的溶液替换为无氧的 100 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.5）。将 F 阀门转至“驱动”位置。在 Pro-Data 控制软件中点击 Empty，排空停止注射器。通过手动提升相应的驱动活塞，将缓冲液从驱动注射器 F 推过流路系统。每个驱动注射器均重复此操作共五次。
  4. 总共执行步骤 7.3 四次，以彻底清除流路系统中的内容物。
  5. 在 Pro-Data 控制软件中点击 Baseline。
  6. 将 200 μL 酶储备液与 1000 μL 无氧的 100 mM 磷酸钾缓冲液混合（在停流混合后的最终浓度为 15 μM）。
  7. 将储液器注射器 A 中的溶液替换为酶溶液。将 A 阀门转至“驱动”位置。在 Pro-Data 控制软件中点击 Empty，排空停止注射器。通过手动提升相应的驱动活塞，将酶溶液从驱动注射器 A 推过流路系统。此步骤共执行三次。在 Pro-Data 控制软件中，将延迟时间设为 0.5 s，采集时间设为 60 s。
  8. 确保所有驱动注射器均装有对应的溶液，且驱动活塞与驱动注射器的推杆接触。将所有阀门转至“驱动”位置，在 Pro-Data 控制软件中点击 Acquire 以执行驱动操作。重复此步骤两次，共获得三组平行数据。由此获得酶氧化态的光谱。
  9. 将储液器注射器 B 中的溶液替换为 NADPH 溶液，其浓度为注射器 A 中酶溶液浓度的 1.5 倍。将 B 阀门转至“驱动”位置，并按照步骤 7.7 的描述，对停止注射器进行三次排空和重新填充。
  10. 将储液器注射器 C 中的溶液替换为含氧缓冲液。将 C 阀门转至“驱动”位置，并按照步骤 7.7 的描述，对停止注射器进行三次排空和重新填充。在 Pro-Data 控制软件中，将延迟时间和采集时间分别设为 15 s 和 900 s。
  11. 重复步骤 7.8。由此获得完全还原酶在再氧化过程中的光谱。

8. 数据分析

  1. 启动 Pro-Data 转换软件。点击 选项 图标，然后选择 保存为 ProDataCSV 格式。
  2. 打开存储数据文件的目录，将文件拖放到 APL Pro-Data 转换器窗口中。数据将自动以 CSV 格式保存在同一目录下。
  3. 使用 Microsoft Excel（Microsoft，美国华盛顿州雷德蒙德）打开 CSV 格式文件。通过减去 700 nm 处相应的吸光度，对停流曲线进行基线归一化处理。
  4. 使用 KaleidaGraph 软件（Synergy Software，美国宾夕法尼亚州雷丁）分析校正后的曲线，将对应最大吸收波长处的吸光度随时间变化的曲线拟合至适当的指数函数。如图 2B所示，将 452 nm 处的吸光度对时间作图，以确定酶与 NADPH 在停流仪中混合后黄素还原的速率。在此情况下，数据的最佳拟合采用双指数方程，计算得到还原反应第一相和第二相的速率分别为 0.65 和 0.23 s-1。为确定 C4a-过氧黄素中间体的生成速率以及还原酶与氧气反应后的再氧化速率，我们分别分析了 380 nm 和 452 nm 处的停流曲线（图 3B）。采用单指数方程，计算得到氧化半反应第一步和第二步的速率分别为 1.4 和 0.006 s-1。

9. 代表性结果

前文所述实验结果表明，可通过监测452 nm处吸光度的变化来跟踪Af SidA的还原半反应，该变化对应于黄素氧化还原状态的改变。通过将数据拟合至适当的方程，可确定此步骤的反应速率（图2；步骤8.4）。所获得的还原速率（0.65 s-1）与通过稳态实验计算得到的kcat值相近2，表明还原步骤是该反应的限速步骤。利用停流装置的双混合模式，可进一步测定氧化步骤的速率及该半反应中的中间产物（图3；步骤8.4）。在Af SidA催化的反应中，C4a-过氧黄素中间体被明显检测到（λmax为380 nm），并可计算其生成与衰减速率。所测得的再氧化速率较慢（0.006 s-1），表明在缺乏鸟氨酸的情况下，C4a-过氧黄素非常稳定。

显示还原、氧化半反应及化学结构图的酶催化过程。
图式 1. Af SidA 的催化机制。图中显示了 FAD 辅因子的异咯嗪环。氧化态黄素（A）与 NADPH（B）结合，反应生成还原态黄素和 NADP+（C）。在与分子氧反应并结合鸟氨酸后，形成 C4a-过氧黄素（D），此为羟基化反应的活性物种。鸟氨酸经羟基化后，生成羟基黄素（E），随后必须脱水以再生氧化态酶。在整个催化循环中，NADP+ 保持结合状态，并在最后释放（F）。

用于瞬态吸收测量的光谱学装置，包含PC工作站；示意图及设备标签。
图1. 停止流动装置。A) Applied Photophysics SX20 停止流动分光光度计各组件的照片。B) 样品处理单元的照片。C) 双混合模式下流动回路的示意图。

吸收光谱和动力学数据；瞬态吸收分析；光子测量。
图 2. 停止流动仪中 NADPH 对 SidA 的厌氧还原。A) 等体积混合 30 μM SidA 与 45 μM NADPH 后记录的光谱变化。初始光谱（氧化态 SidA）和最终光谱（完全还原态 SidA）分别以蓝色和红色突出显示。B) 在 452 nm 处记录的随时间变化的吸光度轨迹。

吸光度与波长关系图；紫外-可见光谱；显示多种浓度；光谱峰。
图3. 停止流动仪中SidA的氧化反应。A) 将完全还原态SidA与含氧缓冲液等体积混合后记录的光谱变化。最终浓度分别为15 μM SidA、22.5 μM NADPH和0.95 mM 氧气。在0.034 s、4.268 s和727.494 s记录的光谱分别对应完全还原态酶、C4a-过氧黄素中间体（λmax为380 nm）和氧化态酶（λmax为450 nm）。B) 在382 nm和452 nm处随时间变化的吸光度轨迹。

讨论

催化氧化还原反应的酶通常含有辅因子，如血红素和黄素，这些辅因子在催化循环过程中会发生显著的吸光度变化。氧化态黄素在约 360 和 450 nm 处呈现吸收峰，其还原过程通常通过监测 450 nm 处吸光度的下降来跟踪7。一般而言，反应中会存在一些瞬时中间体，但其生成和衰变速率过快，常规分光光度计难以检测。利用 Applied Photophysics SX20 停流分光光度计（或类似仪器），可在毫秒时间尺度上测量吸光度变化（死时间：2 ms）。本文以黄素依赖型单加氧酶 Af SidA 为模型，研究其还原和氧化半反应。通过在无氧条件下将酶与 NADPH 混合，并监测 452 nm 处吸光度的变化，测定氢负离子转移的速率。随后，利用停流仪器的双混合模式，先将酶与 NADPH 反应至完全还原，再将生成的还原型酶-NADP+ 复合物与氧气混合。通过该方法，可检测瞬时的含氧黄素中间体，并测定其形成与衰变的速率。这些中间体的鉴定为催化过程中反应物种的性质提供了实验依据。对于 Af SidA 而言，可观察到 C4a-过氧黄素（通常在 370–380 nm 处监测），即羟基化反应的活性物种。此外，测定每一步的速率常数有助于确定反应的决速步，进而阐明酶的反应动力学与化学机制。

通常，类似的方法也可用于其他黄素酶，或会发生吸光度变化的蛋白质，例如含有血红素、磷酸吡哆醛或非血红素铁的蛋白质8-10。该方法的一个局限性是需要大量纯化的酶，但可通过使用高表达产量的表达系统来克服这一问题。在记录光谱时，应通过使用足够量的蛋白质以获得足够强的信号，同时避免使用过多而导致酶浪费，从而确定最佳蛋白浓度。通常，在停流实验中，含黄素酶的最低酶浓度（混合后）为6–10 μM，该值需根据酶相应的摩尔消光系数确定。以Af SidA为例，其结合FAD的酶比例为50–65%2。在这些实验中，脱辅基蛋白被视为无活性，因为催化反应需要结合FAD辅因子。该方法的另一个可能局限是，若酶内过程的发生速度超过2 ms（停流法的死时间），则无法被观测到；但已有报道的策略可通过降低反应速率来克服此问题。其中一个例子是在铁氧还蛋白-NADP+还原酶反应中使用高浓度NaCl11。在实验中，从停流装置的流动回路中彻底去除氧气通常是一个棘手的步骤，需特别注意。本文所述的葡萄糖氧化酶-葡萄糖系统在大多数实验室中已成功应用，因其是一种高效且经济的方法。然而，该系统也存在一些缺点，例如会产生H2O2；在某些应用中，应考虑使用其他替代方案，如原儿茶酸双加氧酶-原儿茶酸系统12。使用厌氧手套箱可更方便地维持厌氧条件，但并非必需。必须从停流装置的流动回路中去除氧气，因为我们希望酶在无氧条件下被还原，或仅在我们指定的氧气浓度下与氧气发生反应。尽管停流仪置于手套箱内，但如果在先前实验中使用了含氧缓冲液，则流动回路中仍可能存在氧气。除了吸光度测量外，还可利用相应的附件在Applied Photophysics SX20停流分光光度计上进行荧光和圆二色性检测。

披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本研究由美国国家科学基金会资助项目 MCB-1021384 支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
真空泵Welch Allyn-
Bü细胞培养瓶Fisher Scientific70340-500
磁力搅拌子Fisher Scientific14-512-129
搅拌器Fisher Scientific11-100-49S
施伦克线Kontes Corp-
氩气罐 AirgasAR UPC300
氮气罐AirgasNI200
氮气罐，超纯级AirgasNI UHP200
氧气罐AirgasOX 40
5% 氢气，余量为氮气的气瓶AirgasX02NI95B200H998
SX20 停流分光光度计AppliedPhotophysics-
手套箱Coy Laboratories, Inc.-
水浴锅Lauda Brinkmann-
50 mL BD Falcon 管Fisher Scientific14-432-23
15 mL BD Falcon 圆锥形管Fisher Scientific05-527-90
1.5 mL Eppendorf 微量离心管Fisher Scientific05-402-18
50 和 25 mL 玻璃瓶Fisher Scientific06-402
橡胶塞Fisher Scientific06-447H
铝封膜Fisher Scientific06-406-15
磷酸二氢钾Fisher ScientificAC2714080025
磷酸氢二钾Fisher ScientificP288-500
乙酸钠Sigma-AldrichS-2889
葡萄糖氧化酶来源于 A. nigerSigma-AldrichG7141-250KU
D-葡萄糖Fisher ScientificD16-500
β-NADPHFisher ScientificICN10116783
L(+)-鸟氨酸盐酸盐Fisher ScientificICN10116783

参考文献

  1. Hissen, A. H. The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L-ornithine N5-oxygenase, is required for virulence. Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).
  2. Chocklett, S. W., Sobrado, P. Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor. Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).
  3. Mayfield, J. A. Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore-associated flavin monooxygenase. J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).
  4. Fierke, C. A., Hammes, G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , Elsevier. USA. (2009).
  5. Palfey, B. A., McDonald, C. A. Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases. Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).
  6. van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts. J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).
  7. Chapman, S. K., Reid, G. A. Flavoprotein Protocols. , Humana Press. Totowa, USA. (1999).
  8. Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism. Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).
  9. Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. Substituent effects on the reaction of β-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase. Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).
  10. Yun, D., García-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. (μ-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron-radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse. Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).
  11. Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry. Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).
  12. Patil, P. V., Allou, D. P. The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments. Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

NADPH

相关文章