细胞生物学的一个基本研究目标是阐明构成真核细胞的细胞器身份特征背后的机制。本文提出一种利用荧光显微镜和下一代测序技术鉴定植物细胞器形态与功能完整性的相关基因的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了一种基于荧光显微镜的筛选方法 拟南芥 幼苗，并描述如何定位隐性突变，这些突变会改变分泌途径中特定标记荧光标记物的亚细胞分布。 拟南芥 是一种强大的生物学模型，适用于遗传学研究，因其基因组大小、世代时间以及在不同生物界之间分子机制的高度保守性。与基于分子标记的传统方法相比，采用基因分型芯片作为定位突变的方法具有优势，因其相对更快速，并可在极短时间内实现多个突变体的定位。该方法可用于鉴定可能影响植物中任何细胞器完整性的蛋白质。在此，我们以实例提出一种用于定位影响内质网（ER）完整性的关键基因的筛选策略。然而，我们的方法可轻松拓展至其他植物细胞器（例如参见1,2因此，这代表了理解其他亚细胞结构分子基础的重要一步。
方案
1. EMS 处理
Arabidopsis thaliana 种子使用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）作为诱变剂进行诱变处理3,4，该试剂可诱导基因组中发生C-to-T的碱基替换，从而导致C/G到T/A的突变5-7。
- 称取携带细胞器荧光标记的拟南芥种子 0.8 g（约 40,000 粒），本研究中使用 ssGFPHDEL（信号序列-GFP-HDEL 四肽）作为内质网标记。
- 将种子转移至 50 ml 离心管中，加入 25 ml 蒸馏水。
- 加入 0.2%（v/v）甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate）。
- 在低速摇床上孵育 16 小时。
- 抽吸液体并弃入含有 1.0 M NaOH 的烧杯中，以灭活 EMS。
- 向含有种子的离心管中加入 25 ml 水，盖紧后倒置混匀 5 次以清洗种子；待所有种子沉降后，吸去上清液并弃入 1.0 M NaOH 烧杯中。
- 重复上述清洗步骤，共清洗 10 次。
- 最后一次清洗后，将种子重悬于少量水中。
- 进行种子灭菌：加入 25 ml 10% 次氯酸钠溶液，剧烈震荡 30 秒；待种子沉降后，倒去次氯酸钠溶液，用 25 ml 无菌水冲洗；倒去无菌水后加入 25 ml 70% 乙醇，震荡 30 秒；待种子沉降后，倒去乙醇，再用 25 ml 无菌水冲洗；重复无菌水冲洗两次，然后将种子转移至含有 3 MM 滤纸的塑料培养皿中，在通风橱内晾干。于 4 °C 保存 2 天。
- 将种子接种于 ½ MS 琼脂培养基（Murashige 和 Skoog 培养基半浓度）的 150 mm 培养皿中（每皿约 250–300 粒种子）。
- 在培养皿中培养 M1 代种子 2 周，然后移栽至土壤中。
- 从单株 M1 植株收获 M2 代种子，建立 M2 群体（共 1000 个独立株系）。
2. M2 和 M3 群体的共聚焦筛选
在本部分中，我们将描述如何使用共聚焦或荧光显微镜观察幼苗，方法如前所述8。
- 将每个M2代品系的六十粒种子种植在塑料培养皿中，使用½ MS琼脂培养基，培养7至10天；在同一培养皿中同时种植5株未用EMS处理的幼苗（对照）。
- 取5到10片子叶，将远轴面朝向物镜（40倍）放置于显微镜载玻片上，并加盖盖玻片。
- 在荧光显微镜下观察每片子叶，从皮层区域至中脉区域，检查细胞器标记物的亚细胞定位是否发生异常。
- 将阳性植株移栽至土壤中，收集其种子，并在M3代中再次筛选，以确认突变表型的遗传稳定性。
- 通过与野生型植株（可能携带目标细胞器荧光标记）至少回交三次，以消除背景中的污染性突变。
- 从母本植株上，使用精细剪刀或镊子去除成熟的角果和开放的花朵。
- 从分生组织上移除过小的花芽。
- 用一对镊子的尖端插入花瓣与萼片之间，打开一个花蕾，并完全去除其中的雄蕊。
- 用另一对镊子取父本植株上开放的成熟花朵，将花药在去雄植株的柱头上轻轻摩擦授粉。
3. 绘图
本部分主要介绍如何利用Borevitz9改进的实验方案对隐性突变进行定位，该方法相较于传统的定位方法10,11更为快速。该方法采用高密度寡核苷酸芯片，可在单次检测中识别大量单特征多态性（SFP）位点12。使用Affymetrix拟南芥ATH1基因芯片阵列，可分析约24,000个基因。将表现突变表型的F2个体群体与同一分离群体中采集的野生型F2植株群体进行比较。随后，突变位点将定位于突变群体中富集突变基因型等位基因的区域；相应地，在该同一区域，野生型群体将富集来自野生型亲本的等位基因13。
- 使用 Qiagen DNeasy 植物小型试剂盒从纯合突变体 Columbia (M3) 中提取基因组 DNA（3 μg），并提交至 Illumina Genome Analyzer II (GA II)14 进行测序。
- 将纯合突变体 Columbia (M3) 与 Landsberg erecta 杂交，以构建作图群体。
- 在 70 至 100 株表现出异常表型的 F2 个体及其同等数量的野生型表型 F2 植株中进行基因定位。
- 使用打孔器从每株植物采集一片叶圆片（0.60 mm）。应从相同年龄的叶片上采集叶圆片，以确保获得相近量的 DNA。样品可单独或分组进行基因组 DNA 提取。在此情况下，可将 5–10 个样品收集至同一个 Eppendorf 管中，最终减少需要提取基因组 DNA 的离心管数量。
- 使用 MasterPure 植物叶片 DNA 纯化试剂盒（Epicentre）提取基因组 DNA。使用 Nanodrop 对每个样品获得的基因组 DNA 进行定量。
- 将每个样品等量的基因组 DNA 混合，总 DNA 量为 300 ng（约 30 μL）；加入 60 μL 2.5X 随机引物溶液 [125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mM MgCl2, 25 mM 2-巯基乙醇, 750 μg/ml 寡脱氧核糖核苷酸引物（随机八聚体）]（Bioprime 试剂盒）以及 42 μL 水（终体积为 132 μL）。
- 在 >95 °C 下变性 DNA 5 至 10 分钟。
- 置于冰上冷却。
- 向每份变性 DNA 中加入 15 μL 含生物素-dCTP 的 10X dNTP 混合液 [1 mM 生物素-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP，溶于 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA]（Bioprime 试剂盒），再加入 3 μL Klenow 聚合酶（Bioprime 试剂盒）补足。
- 在 25 °C 下孵育过夜。
- 次日，加入 15 μL 3 M NaOAc 和 400 μL 冷的 100% 乙醇；混匀。
- 在 -80 °C 下孵育 1 小时，然后在 20,500×g 下离心 15 分钟，弃去上清液，并用 500 μL 冷的 75% 乙醇洗涤。
- 在 20,500×g 下离心 10 分钟。
- 在 37 °C 下干燥 DNA 沉淀 10 分钟，然后溶于 100 μL 水中。
- 取 5 μL 样品在琼脂糖凝胶上检测产量和质量（图 2）。
- 将 95 μL 标记反应产物（分别来自野生型和突变体）送样进行 GeneChip 拟南芥 ATH1 基因组阵列杂交。
- 对芯片进行扫描，获得的 .CEL 文件使用 R 软件（http://www.r-project.org/）进行分析。
- 安装 R 软件后，打开程序并粘贴以下字符串：
source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite()
然后按回车键——这将安装标准的 Bioconductor 软件包（http://www.bioconductor.org）。 - 在桌面新建一个文件夹，从以下网站（http://www.naturalvariation.org/methods）下载以下文件：
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
将文件 ColLerCEL.zip 解压，并将解压后的文件复制到新建的文件夹中。 - 将 GeneChip 实验获得的数据重命名为 wildtype.CEL 和 mutant.CEL。
- 将 GeneChip 数据（wildtype.CEL 和 mutant.CEL）复制到该文件夹中。
- 打开 R 软件，a) Mac 系统：点击“Misc”，然后点击“Change working directory”；b) PC 系统：点击“File”，然后点击“Change directory”。
- a) Mac 系统：选择包含上述文件的文件夹，点击“Workspace”，选择“Load workspace file”并加载 ath1V5.RData；b) PC 系统：选择包含上述文件的文件夹，点击“File”，然后点击“Load workspace”，选择 ath1V5.RData。
- 使用记事本打开 readCEL.R，将全部文本复制到 R 中。
- 使用记事本打开 SFP.R，将全部文本复制到 R 中。
- 使用记事本打开 Map.R，将全部文本复制到 R 中。
- 在控制台窗口中将看到以下信息：
Chromosome x limits Mb y z
Search genes at TAIR paste in this link
3http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y&end=z - 将链接复制并粘贴至浏览器中。弹出窗口将提示打开或保存文件；请选择“保存”。输入文件名并添加“.xls”扩展名，然后点击“保存”。
- 打开“.xls”文件，其中可找到突变体的定位坐标（结果在 图 3 中以图形方式展示）。
- 在突变体基因组组装的 Illumina 测序读段中，于已定位区域内识别单核苷酸多态性中的特异性 EMS 转换4。通过标准转化程序15，使用野生型基因对突变体表型进行互补验证。
4. 代表性结果
图1展示了利用共聚焦显微镜筛选鉴定分泌途径突变体的方法。图2展示了一种用于芯片杂交的标记基因组DNA的典型制备过程。图3展示了分析GeneChip拟南芥ATH1基因组芯片获得的数据后预期得到的典型结果。
图1. 表达ssGFPHDEL（内质网标记）的拟南芥转基因植株（1）被培养以获得足够用于EMS处理的种子（2）。经EMS处理的种子播种后产生M1代植株（3）。每株M1代植株代表一个不同的突变系，其种子被单独收集。M2代种子被点种于½ MS培养基上（4），并通过共聚焦显微镜检测内质网形态缺陷（5）。在筛选过程中，我们发现了保持野生型内质网形态的植株（6）以及表现出内质网异常表型的植株（7）。这些植株被继续培养以获得M3代，并确认表型的稳定性（8）。提取M3代植株的基因组DNA用于Solexa Illumina测序（a）。同时，该植株也与Ler-wt进行杂交，以获得F2作图群体（b）。
图2. Bioprime随机标记反应（100 μL中的5 μL）上样于1%琼脂糖凝胶。泳道a来自野生型F2植株混合样品，泳道b来自突变型F2植株混合样品。（Marker为1 Kb DNA Ladder-N3232，NEB公司产品）。
图3. 该图展示了利用GeneChip拟南芥ATH1基因组阵列杂交技术对Col-0突变进行定位的一个示例。本示例中的突变位于1号染色体上，由垂直线标出范围。水平线表示检测的阈值。
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讨论
本文描述了一种基于共聚焦显微镜的筛选方法，用于鉴定内膜系统突变体。该方法可轻松扩展至细胞中其他具有特异性荧光蛋白标记物的细胞器。该筛选基于识别那些在靶细胞器中或在本不应含有该标记物的细胞器中表现出荧光标记物异常分布的突变体。相应地，这些突变体分别代表了细胞器对标记物进行亚区室化的能力受损，或标记物在细胞器之间无法正常转运的群体。在筛选过程中，我们注意到某些突变体在萌发后7天的早期发育阶段即表现出表型；然而，另一些突变体仅在发育的较晚阶段才表现出表型。尽管这可能与多种因素有关（包括突变等位基因的表达具有发育依赖性），但建议在不同生长阶段（至少萌发后7至14天）对植株进行观察，以确保不会遗漏潜在的重要突变体。
本方案中描述的方法使我们能够在相对较短的时间内完成基因定位，与传统的定位方法相比具有明显优势。事实上，用于GeneChip阵列的F2群体所需个体数量较少，因此收集这些个体所需时间远少于传统精细定位所需的F2植株。然而，该过程中存在若干关键步骤必须严格遵守。在选择表现出或不表现出目标表型的F2群体样本时应格外谨慎，因为即使误加入少量表型判断错误的植株，也可能导致最终结果出现偏差。...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢美国能源部科学办公室基础能源科学司化学科学、地球科学和生物科学部（资助号 DE-FG02-91ER20021）以及国家科学基金会（MCB 0948584）（F.B.）提供的支持。我们感谢 Karen Bird 女士对稿件的编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲基磺酸乙酯 | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| 氢氧化钠 | JT Baker | 3722-05 | |
| 含甘博格维生素的Murashige和Skoog基础培养基 | Phyto Technolog Laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy 小量试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Master Pure 植物叶片DNA纯化试剂盒 | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA标记系统 | Invitrogen | 18094-011 | |
| 200度酒精 | Decon Laboratories | 2716 | |
| 乙酸钠 | JT Baker | ||
| Gene Chip 拟南芥 ATH1 基因组芯片阵列 | Affymetrix | 900385 | |
| 50 mL Falcon管 | Corning | 430290 | |
| 1.5 mL Eppendorf管 | |||
| 90 mm滤纸 | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| 分析天平 | Mettler Toledo | n.a | |
| 往复式（摇摆）振荡器 | Heidolph | n.a | |
| 离心机 | Eppendorf | n.a |
参考文献
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