结核分枝杆菌 生物膜的培养

摘要

Mycobacterium tuberculosis 在特定培养条件下会形成耐药性生物膜。本文介绍了培养 M. tuberculosis 生物膜并测定耐药持留菌频率的方法。这些实验方案将有助于进一步研究 M. tuberculosis 耐药性的机制。

摘要

Mycobacterium tuberculosis 是人类结核病的致病因子，具有在包括抗生素在内的各种环境压力下长期存活的非凡能力。尽管 M. tuberculosis 的应激耐受性很可能是导致结核病需要长达6个月化学治疗的原因之一¹，但这种病原体表型特征背后的分子机制仍不明确。许多微生物通过形成一种高度有序、附着于表面并被基质包裹的自组装结构——即生物膜（biofilm），以适应恶劣环境并实现存活^2-4。以群体形式生长似乎是微生物优先选择的生存策略，这一过程依赖于调控表面附着、细胞间通讯以及胞外聚合物（EPS）合成的遗传组分^5,6。环境应激耐受性可能由EPS所介导，也可能源于单个杆菌对生物膜复杂结构内部异质性微环境的生理适应⁷。

在一系列近期论文中，我们证实了 M. tuberculosis 和 Mycobacterium smegmatis 具有强烈的倾向形成称为生物膜的有序多细胞结构，这些生物膜可耐受超过抗结核药物异烟肼和利福平最低抑菌浓度50倍以上的药物浓度 ^8-10. M. tuberculosis 然而，有趣的是，形成成熟生物膜需要特定条件，特别是 9:1 的顶空:培养基比例，以及与大气有限的气体交换。 ⁹. 对特殊环境条件的需求可能与以下事实相关： M. tuberculosis 是一种专性人类病原体，因此已适应人体组织环境。在本出版物中，我们展示了培养该病原体的方法 M. tuberculosis 瓶中和12孔板格式中的生物膜培养，便于进行细菌学及遗传学研究。我们已描述了一种减毒菌株的实验方案 M. tuberculosis, mc²7000，两个位点发生缺失， panCD 和 RD1, 至关重要的 体内 病原体的生长 ⁹该菌株可在生物安全二级（BSL-2）条件下安全使用，用于研究结核病病原体的基本生物学特性，从而避免使用昂贵的生物安全三级（BSL-3）设施。通过适当调整培养基，该方法还可扩展用于培养其他可培养分枝杆菌物种的生物膜。

总体而言，一种培养分枝杆菌生物膜的标准化方案将有助于研究人员探究分枝杆菌的基本耐受特性。此外，一种清晰简洁的分枝杆菌生物膜培养方法，也将帮助临床和药物研究人员评估潜在药物的有效性。

方案

1. 生物膜的培养 M. tuberculosis 在250 mL带螺口盖的瓶中

1. 培养基制备：将 0.5 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄、4 g L-天冬酰胺、2 g 柠檬酸、0.05 g 枸橼酸铁铵和 60 mL 甘油溶解于 900 mL 水中。用 NaOH 调节 pH 至 7.0。高压灭菌后冷却，在开始实验前加入无菌的 ZnSO₄，使其终浓度为 0.1% w/v。由于 mc²7000 是泛酸缺陷型菌株，该菌株还需添加终浓度为 10 μg/mL 的泛酸。

注意：这是用于结核分枝杆菌的Sauton培养基的标准配方。但是，如有需要，其他特殊培养基也可用于其他分枝杆菌种类。

2. 接种物制备：将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在含0.05%吐温-80的7H9OADC培养基中培养一周，或至OD₆₀₀达到0.7至1.0。该培养物可直接用作接种物，按1:100稀释使用。
3. 取25 mL Sauton培养基加入250 mL带螺旋盖的聚苯乙烯瓶（Corning）中。向培养基中加入250 μL接种物， tightly 拧紧瓶盖，将瓶子置于37°C恒温湿润培养箱中静置培养3....

讨论

由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的结核病（TB）仍然是全球公共卫生的重大威胁。据估计，全球近三分之一的人口无症状感染了该病原体，每年约有900万新发病例出现活动性结核病的临床症状，约170万人死于该感染¹¹。这一巨大疾病负担主要源于缺乏有效的疫苗，以及需要长达六至九个月的复杂联合化疗方案。长期化疗的主要原因是病原体中存在一小部分具有表型耐受性的亚群，这些细菌需要更长时间的抗生素暴露才能被清除¹²。尽管靶向这些持留菌对于实现短程且有效的结核病治疗至关重要，但这些持留菌形成背后的机制仍不明确。

大多数微生物物种在其自然生境中会自发形成一种称为生物膜的、附着于表面的多细胞自组装群落，这类群落对抗生素具有高度耐受性³。最近研究表明，多种分枝杆菌在体外（in vitro）具有强烈形成生物膜的倾向，而生物膜可提供一种促进耐药持留菌形成的微环境^9,13-15。尽管快速生长的环境分枝杆菌（如 M. smegmatis

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养箱	VWR international	型号 # 1923/25
聚苯乙烯培养瓶	Fisher Scientific	03-374-300
12孔组织培养板	VWR international	62406-165
50 mL 圆底离心管	VWR international	89039-660
摇床	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
层析冰箱	VWR international	55702-520
培养皿	VWR international	25384-342
KH2PO4（单碱式）	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-天冬酰胺	Sigma-Aldrich	A4284-100G
柠檬酸	Sigma-Aldrich	C1857-100G
柠檬酸铁铵	Sigma-Aldrich	F5879-100G
甘油	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-泛酸	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 肉汤	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC 增补剂	BBL	212351
吐温-80	Fisher Scientific	T164-500
250 mL 储存瓶	Corning	430281
12孔板	Falcon BD	353043
利福平	Sigma-Aldrich	R3501-1G
甲醇	JT Baker	9070-05
10 mL 注射器	BD Biosciences	301604
1–200μL 移液器吸头	VWR international	89079-458
Parafilm M 封口膜	VWR international	PM-996
15 mL 离心管	Greiner Bio-One	188-285
Difco 分枝杆菌 7H11 琼脂	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4（双碱式）	Sigma-Aldrich	S0876-500G