Mycobacterium tuberculosis 在特定培养条件下会形成耐药性生物膜。本文介绍了培养 M. tuberculosis 生物膜并测定耐药持留菌频率的方法。这些实验方案将有助于进一步研究 M. tuberculosis 耐药性的机制。
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摘要
摘要
Mycobacterium tuberculosis 是人类结核病的致病因子，具有在包括抗生素在内的各种环境压力下长期存活的非凡能力。尽管 M. tuberculosis 的应激耐受性很可能是导致结核病需要长达6个月化学治疗的原因之一1，但这种病原体表型特征背后的分子机制仍不明确。许多微生物通过形成一种高度有序、附着于表面并被基质包裹的自组装结构——即生物膜（biofilm），以适应恶劣环境并实现存活2-4。以群体形式生长似乎是微生物优先选择的生存策略，这一过程依赖于调控表面附着、细胞间通讯以及胞外聚合物（EPS）合成的遗传组分5,6。环境应激耐受性可能由EPS所介导，也可能源于单个杆菌对生物膜复杂结构内部异质性微环境的生理适应7。
在一系列近期论文中，我们证实了 M. tuberculosis 和 Mycobacterium smegmatis 具有强烈的倾向形成称为生物膜的有序多细胞结构，这些生物膜可耐受超过抗结核药物异烟肼和利福平最低抑菌浓度50倍以上的药物浓度 8-10. M. tuberculosis 然而，有趣的是，形成成熟生物膜需要特定条件，特别是 9:1 的顶空:培养基比例，以及与大气有限的气体交换。 9. 对特殊环境条件的需求可能与以下事实相关： M. tuberculosis 是一种专性人类病原体，因此已适应人体组织环境。在本出版物中，我们展示了培养该病原体的方法 M. tuberculosis 瓶中和12孔板格式中的生物膜培养，便于进行细菌学及遗传学研究。我们已描述了一种减毒菌株的实验方案 M. tuberculosis, mc27000，两个位点发生缺失， panCD 和 RD1, 至关重要的 体内 病原体的生长 9该菌株可在生物安全二级（BSL-2）条件下安全使用，用于研究结核病病原体的基本生物学特性，从而避免使用昂贵的生物安全三级（BSL-3）设施。通过适当调整培养基，该方法还可扩展用于培养其他可培养分枝杆菌物种的生物膜。
总体而言，一种培养分枝杆菌生物膜的标准化方案将有助于研究人员探究分枝杆菌的基本耐受特性。此外，一种清晰简洁的分枝杆菌生物膜培养方法，也将帮助临床和药物研究人员评估潜在药物的有效性。
方案
1. 生物膜的培养 M. tuberculosis 在250 mL带螺口盖的瓶中
- 培养基制备：将 0.5 g KH2PO4、0.5 g MgSO4、4 g L-天冬酰胺、2 g 柠檬酸、0.05 g 枸橼酸铁铵和 60 mL 甘油溶解于 900 mL 水中。用 NaOH 调节 pH 至 7.0。高压灭菌后冷却，在开始实验前加入无菌的 ZnSO4，使其终浓度为 0.1% w/v。由于 mc27000 是泛酸缺陷型菌株，该菌株还需添加终浓度为 10 μg/mL 的泛酸。
注意：这是用于结核分枝杆菌的Sauton培养基的标准配方。但是，如有需要，其他特殊培养基也可用于其他分枝杆菌种类。
- 接种物制备：将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在含0.05%吐温-80的7H9OADC培养基中培养一周，或至OD600达到0.7至1.0。该培养物可直接用作接种物，按1:100稀释使用。
- 取25 mL Sauton培养基加入250 mL带螺旋盖的聚苯乙烯瓶（Corning）中。向培养基中加入250 μL接种物， tightly 拧紧瓶盖，将瓶子置于37°C恒温湿润培养箱中静置培养3周。每天观察一次瓶子，确保无污染发生。
- 第三周结束时，松开瓶盖，以允许结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在液-气界面处进一步生长。若此时未松开瓶盖，则容器内氧气浓度不足，将抑制细菌的进一步生长。
2. 培养 M. tuberculosis 12孔板中的生物膜
- 按照 A1 和 A2 节所述方法准备培养基和 mc27000 菌种。
- 将 60 mL 培养基与 600 μL 菌种混合。将 4.5 mL 混合液分装至板的每个孔中。盖上板盖，并用封口膜包裹数圈。将板置于湿润培养箱中，于 37°C 静置培养 5 周。
3. 确定耐药持留菌的频率 M. tuberculosis 生物膜
- 按照 B 部分所述方法，在 12 孔板中培养 M. tuberculosis 生物膜。整个过程大约需要 5 周。
- 生物膜成熟后（培养 5 周后），使用移液器配合微量吸头，将选定浓度的抗生素注入生物膜下方的培养基中。
注意：菌膜下方培养基的体积减少至约 3.0 mL，因此研究人员应据此计算药物的用量。
- 轻轻旋转培养板，使抗生素在培养基中充分扩散。为获得具有统计学意义的结果，在四个孔中加入抗生素。同时，平行地在另外四个孔中加入等体积的溶解抗生素的溶剂，并保持板上最后四个孔不作处理。盖上培养板盖子，并在板周围重新包裹一层新鲜的 Parafilm。将培养板放回培养箱中，孵育所需的时间。
- 孵育结束后，打开培养板，向每个孔中加入 Tween-80，使其终浓度达到 0.1%（体积/体积）。轻轻旋转整个培养板，使去垢剂均匀分散。在室温下孵育 15 分钟。用移液器反复吹打每个孔中的内容物数次，确保能够将全部内容物均匀转移至一个 15 mL 的锥形管中。
- 在室温下以 4000 rpm 离心 10 分钟，沉淀管中的内容物。将沉淀重悬于 5 mL 新鲜洗涤缓冲液（含 10% 甘油和 0.05% Tween-80 的 PBS）中。重复洗涤三次。最后将沉淀重悬于 5 mL 洗涤缓冲液中，置于 4°C 摇床上过夜。
注意：尽管低温最初是为耻垢分枝杆菌开发的（以在分散过程中尽量减少其生长），并同样用于结核分枝杆菌，但生长缓慢的菌种很可能在室温下振荡而不会影响结果。如果在三级生物安全实验室（BSL-3）中操作，可能需要在室温下振荡。
- 准备一支无菌注射器，安装微尖头（2-200μl）：将注射器宽端剪至合适尺寸，套上尖头后用封口膜包裹。将管内全部内容物通过装有尖头的注射器推注，并收集至新的15mL离心管中。重复此步骤5到6次，直至观察到较为均匀的悬浮液。
- 对悬浮液进行系列稀释，并将不同稀释度的样品接种于7H11OADC平板，以确定每个孔中的活菌落数量。将平板置于37°C培养箱中培养三周。通过计算经抗生素处理组与溶剂对照组平板上获得的菌落数量之比，确定生物膜群体中持留菌的频率。
4. 典型结果
在培养瓶中培养时，第一周结束时可在瓶底观察到结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的生长。第二周结束时，可在气-液界面观察到细菌呈斑块状生长，尽管气-液界面的生长通常在第三周结束时才稳定可见（图1A）。此时还可观察到细菌附着于容器壁的现象。此后，培养物的生长主要发生在气-液界面。表面以下的液体保持澄清。通常，菌膜结构在第五周结束时发育成熟（图1B）。若继续延长培养时间，菌膜结构将逐渐沉降至容器底部。值得注意的是，在培养的前三个星期将瓶盖拧紧是该过程中的关键步骤，原因尚不明确，但瓶盖松动的培养瓶会显著延迟气-液界面生长的启动9。
在12孔板体系中，经过五周培养后，每个孔的气-液界面均可见形成牢固的生物膜（图2A）。如果培养板未完全包裹，则会观察到生物膜生长不均一。在最严重的情况下，培养基的显著蒸发可能导致细菌生长停滞（图2B）。因此，包裹培养板是必要的，既可防止培养基蒸发，又能为生物膜的形成提供适宜环境（见上一段）。
采用该技术测定的生物膜中可存活分枝杆菌数量具有较高的可重复性。M. tuberculosis 生物膜对抗生素的反应随抗生素种类不同而有所差异。对于利福平这类杀菌性抗生素，其活性丧失呈双相趋势9。在最初三至四天内，菌体活性迅速下降，随后进入持续阶段，此时无论抗生素浓度高低或作用时间长短，仍有少量菌群完全耐受抗生素作用。图3显示了成熟生物膜在50μg/mL（高于最低抑菌浓度50倍）利福平中暴露7天后可存活分枝杆菌的数量。
图 1A。 结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在培养3周后于细菌的空气-培养基界面处的早期形态。
图 1B。 M. tuberculosis 在气-液界面培养五周后形成的成熟生物膜。
图 2A。 在12孔板中培养的5周龄 M. tuberculosis 生物膜。
图 2B。 在未使用封口膜的12孔板中培养结核分枝杆菌生物膜的失败尝试。
图3。 代表性图示，显示在12孔板中培养并暴露于50μg/mL利福平七天的 M. tuberculosis 生物膜中耐药持留菌的出现频率。
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讨论
由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的结核病（TB）仍然是全球公共卫生的重大威胁。据估计，全球近三分之一的人口无症状感染了该病原体，每年约有900万新发病例出现活动性结核病的临床症状，约170万人死于该感染11。这一巨大疾病负担主要源于缺乏有效的疫苗，以及需要长达六至九个月的复杂联合化疗方案。长期化疗的主要原因是病原体中存在一小部分具有表型耐受性的亚群，这些细菌需要更长时间的抗生素暴露才能被清除12。尽管靶向这些持留菌对于实现短程且有效的结核病治疗至关重要，但这些持留菌形成背后的机制仍不明确。
大多数微生物物种在其自然生境中会自发形成一种称为生物膜的、附着于表面的多细胞自组装群落，这类群落对抗生素具有高度耐受性3。最近研究表明，多种分枝杆菌在体外（in vitro）具有强烈形成生物膜的倾向，而生物膜可提供一种促进耐药持留菌形成的微环境9,13-15。尽管快速生长的环境分枝杆菌（如 M. smegmatis
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院和美国肺脏协会的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养箱 | VWR international | 型号 # 1923/25 | |
| 聚苯乙烯培养瓶 | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12孔组织培养板 | VWR international | 62406-165 | |
| 50 mL 圆底离心管 | VWR international | 89039-660 | |
| 摇床 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| 层析冰箱 | VWR international | 55702-520 | |
| 培养皿 | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4（单碱式） | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| 柠檬酸铁铵 | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| 甘油 | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-泛酸 | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 肉汤 | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC 增补剂 | BBL | 212351 | |
| 吐温-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250 mL 储存瓶 | Corning | 430281 | |
| 12孔板 | Falcon BD | 353043 | |
| 利福平 | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| 甲醇 | JT Baker | 9070-05 | |
| 10 mL 注射器 | BD Biosciences | 301604 | |
| 1–200μL 移液器吸头 | VWR international | 89079-458 | |
| Parafilm M 封口膜 | VWR international | PM-996 | |
| 15 mL 离心管 | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco 分枝杆菌 7H11 琼脂 | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4（双碱式） | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
参考文献
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