Moxi Z 微型自动细胞计数仪是一种新型仪器，结合了库尔特原理、专利的薄膜传感器技术以及专有的软件算法，能够对广泛粒径范围的颗粒进行粒径测量和计数，并评估单分散哺乳动物细胞培养物的整体健康状态。本方案描述了使用该仪器对细胞培养物进行计数和健康状态评估的操作方法。
本文内容
摘要
摘要
颗粒和细胞计数被广泛应用于多种领域，包括常规细胞培养、血液学分析以及工业控制1-5。细胞/颗粒计数技术的一项关键突破是50多年前由Wallace Coulter开发的库尔特（Coulter）技术。该技术通过在微米级小孔两端施加电场，并利用流体动力学将单个颗粒聚焦通过小孔。当颗粒通过小孔时会暂时阻塞孔道，导致电阻抗发生可测量的变化，这种变化可直接且精确地与细胞的大小/体积相关联。该方法之所以被公认为细胞/颗粒计数的基准，是因为其在颗粒尺寸测量和计数方面具有极高的精确性和准确性，尤其相较于人工计数和基于成像的技术而言（库尔特计数器的准确率约为98%，而人工和视觉系统仅为75–80%）。这主要归因于库尔特技术与基于成像的细胞计数方法不同，它对细胞/颗粒进行真实的三维（3-D）测量，通过计算细胞/颗粒的精确体积信息，显著减少了碎片和细胞聚集对计数结果的干扰。总体而言，该技术提供了一种比其他计数方法更准确、更省力、更节省时间且主观性更低的细胞计数与 sizing 方法6。
尽管库尔特技术在细胞计数中具有重要地位，但由于传统仪器的成本高昂且体积庞大，其在常规生物学研究中的广泛应用受到限制。虽然已开发出一种成本较低的基于库尔特原理的仪器，但在校正“重合事件”方面仍存在局限性，即当两个或更多细胞同时通过小孔时会被误测为单个细胞，其性能不及更昂贵的同类设备。现有库尔特技术的另一项局限性在于缺乏对细胞样本整体健康状况的评估指标。因此，通常需要结合其他技术与库尔特计数共同评估细胞活力。由于传统的活力检测方法需要对细胞进行染色和/或使用流式细胞仪等昂贵且笨重的设备，这进一步延长了实验准备时间并增加了成本。
本文所述的Moxi Z迷你型全自动细胞计数仪是一种超小型台式仪器，结合了库尔特原理的精确性与薄膜传感器技术，能够精确测定和计数颗粒，其可测粒径范围为3-25微米，具体取决于所使用的细胞计数卡盒。M型卡盒可用于计数平均直径为4-25微米的颗粒（动态范围为2-34微米），S型卡盒则可用于计数平均直径为3-20微米的颗粒（动态范围为2-26微米）。由于该系统采用体积测量法，4-25微米对应细胞体积范围为34-8,180 fL，而3-20微米对应细胞体积范围为14-4200 fL，这在测量非球形颗粒时具有重要意义。使用Moxi Z进行哺乳动物细胞计数时，首先将待测细胞用ORFLO或类似稀释液进行稀释。将细胞计数卡盒插入仪器中，然后将样品加载至卡盒的进样口。在8-15秒内，数千个细胞以单列形式被吸入并通过薄膜膜上的“细胞感应区”（CSZ）。运行结束后，仪器结合专有的曲线拟合方法与专有软件算法，对重合事件进行校正，并通过确定目标细胞群数量与总颗粒数的比值，评估整体培养物的健康状况。总颗粒计数包括皱缩和破裂的死亡细胞，以及其他碎片和污染物。结果以直方图形式呈现，并自动进行曲线拟合，门控可根据需要手动调整。
最终，Moxi Z 能够实现与当前金标准 Coulter Z2 相当的精确度和准确度进行细胞计数，同时提供额外的细胞培养健康信息。此外，与同类技术相比，它能在更短的时间内完成检测，占用更小的空间，操作和维护显著简便，并且成本仅为同类技术的一小部分。
方案
1. 样品制备
- 使用ORFLO稀释液或适当的稀释液稀释细胞悬液，使细胞浓度处于仪器的工作范围内（对于M型盒，为3,000至500,000个细胞/mL；对于S型盒，为3,000至2,500,000个细胞/mL）。
- 对于大多数哺乳动物细胞系，建议稀释倍数为1:5至1:20（M型盒）或无需稀释至1:5稀释（S型盒），但合适的稀释倍数取决于细胞类型和接种密度。准确计数所需的体积约为75 μL。
2. 运行样品
- 按下电源按钮启动 Moxi Z，屏幕将显示主界面。
- 按下托盘并插入一个检测盒至 Moxi Z 中，屏幕将显示吸取 75μL 样本…界面。
- 用移液器将 75 μL 样本加入检测盒的加样孔中（蓝色椭圆标记为 1 或 2，取决于检测盒插入仪器的一端）。这些检测盒为一次性使用，可进行两次检测。注意：将移液器吸头以约 45° 角直接插入加样孔，使吸头卡在孔口前缘下方。加样时，必须确保真空不会“超前”于液体的释放，否则可能导致空气泡进入检测盒。建议在加样过程中，使液体在加样孔上方形成一小滴（大小与孔口相当）。
- 对于大多数哺乳动物细胞计数，可触摸屏幕任意位置开始检测。对于非常小的颗粒（M 型平均直径为 4 至 8 μm，S 型平均直径为 3 至 8 μm），Moxi Z 可在小颗粒模式下运行。注意：屏幕顶部黑色条带中会显示检测盒类型。在此模式下，Moxi Z 将默认直径范围设为 2 至 10 μm，并采用优化参数进行小细胞检测。按下触摸此处 小颗粒模式按钮（黑色方块）即可启动该模式下的检测。
- Moxi Z 将开始检测，细胞计数结果大约在 8 秒（M 型检测盒）或 15 秒（S 型检测盒）后完成。
- 曲线拟合与 MVI 计算将自动开始，仅需额外几秒时间。当获得合适的拟合结果后，结果将自动显示在屏幕上。
- 若要将设门设为默认采集模式，可按下曲线拟合计数按钮以切换至设门模式。
- 此时可将检测盒从仪器中取出。
3. 数据管理
- 如果AutoMode缩放功能关闭，结果将最初以2-34 μm（M型卡式盒）或2-26 μm（S型卡式盒）的直径尺度显示曲线拟合计数。如果AutoMode缩放功能开启，则Moxi Z会自动将横轴（x轴）缩放到最接近曲线拟合群体宽度的范围，同时确保所有曲线拟合数据均被显示。
- 如果AutoMode缩放功能关闭，要手动以更高分辨率显示结果，请点击2-26 μm图标（M型）或2-18 μm图标（S型）。注意：卡式盒类型在屏幕左上角的蓝色框中标示。建议在计数较小细胞或颗粒时使用此设置，以提升曲线拟合能力以及用户对数据细微差别的视觉分辨能力。
- 提高横向分辨率后，缩放按钮将动态调整，允许在可用的x轴尺度范围之间切换：M型卡式盒为2-34、2-26、2-18和2-10 μm；S型卡式盒为2-26、2-18和2-10 μm。此功能仅在完成一次细胞计数后立即可用。
- 曲线拟合或设门区域的计数信息（细胞/毫升）显示在直方图左侧下方的黑色框中。平均细胞大小信息显示在直方图右侧下方的黑色框中。
- MVI值显示在直方图右上角的蓝色框中。如果测试在小颗粒模式下运行，MVI不适用，将显示为“MVI=SPM”。此外，如果细胞浓度超出MVI工作范围，将显示“MVI=Out of Range”提示。
- 要保存当前直方图，请点击Done图标。数据将以“Test XXX”命名保存，其中XXX为相应的测试编号。
- 要手动对直方图设门，请点击切换Curve Fit计数结果按钮，使Gating成为默认采集模式。然后滑动每个蓝色设门标记以设定门限，或点击蓝色设门标记后出现的左右箭头进行精细调整。仅两个标记之间的细胞被计入。直方图纵轴将根据曲线拟合群体的幅度自动缩放。如需调整该纵轴尺度，可在直方图区域内上下滑动屏幕。
- 点击Gated Count结果按钮，将显示返回至曲线拟合模式，并使曲线拟合模式成为默认采集模式。
- 然后点击Done图标以保存结果并返回至Home屏幕。如需删除结果，可随时点击Delete图标以永久删除该次测试结果。
4. 已获取数据的分析
- 要打开已保存的测试，请按 Home 屏幕上的 Histogram 图标。
- 屏幕上将显示最多九个已保存直方图的图标。按相应的图标以选择感兴趣的测试，或按 Page Up 或 Page Down 图标以查看更多测试结果。
- 每个直方图将根据其保存方式，以 Curve Fit Count 模式或 Gated Count 模式打开。在 Gated Count 模式下，可通过独立滑动每个蓝色门控标记来将其定位至所需位置。触摸目标峰以执行 Auto Gate。触摸以在 Gated Count 和 Curve Fit Count 模式之间切换。
- 按 Zoom 和 Unzoom 图标以调整直方图的垂直刻度。也可通过在屏幕上垂直向上（增加）或向下（减少）滑动手指来更改垂直刻度。
- 按 Delete 图标以永久删除该测试结果。
- 按 Done 图标以关闭测试结果并返回至 Home 屏幕。（注意：缩放后的视图不会被保存。）
5. 将数据传输到电脑
- 可通过 Orflo Moxichart 应用程序，或使用 Moxi Z 的 USB 数据线连接至 PC 或 Mac 进行 USB 传输，将数据转移至计算机。如需通过蓝牙传输（MoxiChart），请先在 Moxi Z 设备的 主屏幕 上点击 蓝牙 图标，以确定该设备的蓝牙 ID。
- 在计算机上打开 MoxiChart 应用程序，点击右上角的 蓝牙 图标，然后选择与 Moxi Z 蓝牙 ID 对应的设备，并指定上传文件的存储目标文件夹。
- Moxichart 将通过蓝牙连接自动将所有文件传输至指定目录。
- 通过蓝牙（MoxiChart）或 USB 传输的文件可直接在 MoxiChart 应用程序中打开并进行分析；此外，由于这些文件为 .csv 格式，也可直接导入 Microsoft Excel 或其他数据分析软件中进行进一步或自定义分析。
6. 代表性结果
为评估 Moxi Z 的精密度与准确度，使用 Coulter Z2 和 Moxi Z 分别对 HEK-293 细胞、HeLa 细胞、CHO-K1 细胞、酵母、Jurkat E6-1 细胞、PC12 细胞以及浓度范围为 0–500,000 个细胞/mL（M 型微流控卡盒）和 0–2–2.5e6 个细胞/mL（S 型微流控卡盒）的精密校准微球悬浮液进行计数并比较。所有哺乳动物细胞均购自美国模式培养物集存库（ATCC），并按照先前描述的方法进行培养7–11。简言之，细胞在 75 mm2 组织培养瓶中以悬浮形式培养，基础培养基分别为 RPMI 1640（Jurkat E6-1、PC12）、MEM（HEK-293、HeLa）或 F12K（CHO-K1）。所有培养基均添加 10% 胎牛血清和 100 U 青霉素/100 μg 链霉素。培养瓶置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中培养，每 3 天传代一次。酵母细胞（X5、C. albicans、Vin 13）由捐赠者提供，直接使用。使用 Coulter Z2 建立 M 型卡盒约 500,000 个细胞/mL 和 S 型卡盒约 2–2.5e6 个细胞/mL 的初始样品浓度，随后通过生理缓冲液（Isoton II 或 Hank's 平衡盐溶液）进行系列稀释，获得不同理论浓度。在每一浓度下，两种系统对相同样品进行测量并相互比对。如图 2所示，所有样品的计数结果之间均呈现高度线性相关性（M 型 r2>0.9886，S 型 r2>0.9781）。同时，Moxi Z 与 Z2 的实测浓度与预期/理论细胞浓度进行比较（图 3），同样显示出强线性相关性（M 型 r2>0.9758，S 型 r2>0.9774）。
为评估精确度，使用库尔特Z2、Moxi Z和血细胞计数板对HEK-293和HeLa细胞进行了计数。通过在200,000–300,000个细胞/ml范围内进行5次独立计数，计算了Moxi Z（M型微流控卡盒）、库尔特Z2和血细胞计数板细胞计数结果的平均变异系数（CV，n=19）。Moxi Z的平均变异系数较小（图4），与Z2相当，体现了仅库尔特计数技术才能达到的高精度水平。
接下来通过测量购买的精密校准聚苯乙烯微珠来评估 Moxi Z 仪器的粒径测量精度。将 Moxi Z 测得的平均粒径（n=5）与厂家提供的标称尺寸进行对比作图。从图5可以看出，Moxi Z 的测量值与厂家数据高度一致，具有良好的线性相关性（r2=0.9989）。
除了提供细胞大小和计数信息外，Moxi Z 还可通过报告的 Moxi 活性指数（MVI）值，无需使用试剂即可对哺乳动物细胞培养的健康状态进行总体评估。该指数由目标细胞群体数量与总颗粒数的比值生成。为展示 MVI 的测量能力，将 MVI 读数（Type M 试剂盒）与传统的手工计数法及流式细胞术的活/死细胞检测方法进行了比较。通过将活细胞在不含营养物质但含有氟化钠的稀释液（Isoton II，Beckman Coulter）中于 37 °C 下过夜孵育，制备出死亡率高（<10% 活性）的 HEK-293 和 HeLa 细胞群体。通过按比例混合已知浓度的活细胞与死细胞，制备出不同理论活性水平的细胞样本。所得溶液分别采用血球计数板计数和流式细胞仪测量进行双重复性活性分析。血球计数板检测采用传统方法，即 0.1% 台盼蓝溶液与细胞按 50/50 比例混合。流式细胞术检测使用 Guava PCA 流式细胞仪（Merck），并采用 Viacount 试剂及制造商指定的操作流程（Merck）。如图6所示，MVI 数据与血球计数板测得的活细胞百分比之间的线性拟合皮尔逊相关系数（r2）在 HEK 细胞和 HeLa 细胞中分别为 r2=0.9937 和 r2=0.9728。这些结果表明，该方法可在广泛的细胞活性范围内提供与流式细胞仪或血球计数板所得活/死细胞检测结果具有良好可比性的细胞培养健康信息。
表格与图示（源自 Dittami et al., 2011）15：
图 1. 薄膜库尔特计数：电流通过薄膜样品盒的细胞感应区。当细胞单列流经细胞感应区（CSZ）时，Moxi Z 仪器测量瞬时电压升高。
图2. Moxi Z计数与Coulter Z2计数具有可比性。 使用Coulter Z2和Moxi Z对相同的细胞和微球悬浮液进行计数。将Moxi Z的平均计数值（n=3–4）相对于Coulter Z2的对应计数值作图，并计算线性拟合的r2值。A）M型卡带——细胞浓度范围为0 – 500,000 个细胞/mL。B）S型卡带——浓度范围为0 – 2–2.5×106/mL。误差线表示±1个标准差。
图 3. Moxi Z 测量浓度与理论细胞浓度的比较。A）M 型盒 ——理论浓度通过将初始浓度为 500,000 个细胞/ml 的样本进行连续稀释制备。B）S 型盒 ——理论浓度通过将初始浓度为 2 - 2.5×106 个细胞/ml 的样本进行连续稀释制备。误差线表示 ±1 个标准差。
图 4. Coulter Z2、Moxi Z（M型卡盒）和血细胞计数板的变异系数（CV）。 每种方法对 HEK-293 和 HeLa 细胞计数的平均变异系数（CV，n=19）是基于在 200,000–300,000 个细胞/ml 范围内对 HEK-293 和 HeLa 细胞进行 5 次独立计数所测得的 CV 值计算得出。误差线表示 ±1 个标准差。
图 5. 使用 Moxi Z 进行颗粒大小测量的精确度 — Moxi Z 测量的珠粒大小（Type M 试剂盒）与制造商提供的珠粒大小对比。误差线表示 ±1 个标准差。
图 6. 使用 MVI 进行培养健康评估 - 比较 MVI 测量结果（M 型卡式盒）、Guava PCA Viacount 活力测定与使用血细胞计数板进行的台盼蓝染色后目视计数的细胞活力。
讨论
库尔特法的底层实现对测量结果的整体准确性具有决定性影响。其中一个关键环节是对原始细胞计数中“重合事件”的校正，即两个或多个细胞同时通过小孔，被检测为单个电信号事件。“重合事件”会引入误差，其大小取决于多种因素，包括细胞尺寸和聚集程度（Davis 等，1967）6。因此，对于任意给定样本所需的重合校正无法预先确定，其值在不同细胞/颗粒类型之间，甚至在相同细胞类型的不同的培养物之间都可能存在显著差异。基于库尔特早期发表文献建立的理论，通常采用一种对原始计数进行对数校正的方法，该方法依据所观测到的事件数量以及一个通过实验确定的、针对特定颗粒的校正因子 z。尽管使用该校正算法可获得准确的计数结果，但由于不同细胞类型的 z 值差异较大，且难以准确预测其数值，该方法在实际应用中受到限制。本文中，Moxi Z 通过曲线拟合确定“真实”细胞计数，并结合重合校正算法，动态地对重合事件进行校正，从而获得真实的细胞浓度。与高端库尔特 Z2 仪器所得结果相比，Moxi Z 在 0 - 500,000 个细胞/ml（M 型微流控芯片）和 3,000 - 2-2.5×106 个细胞/ml（S 型微流控芯片）的浓度范围内均获得了相当的计数结果。此外，Moxi Z 在计数准确性方面表现出相似的低变异系数，其颗粒尺寸测量的精确性也达到了细胞计数领域金标准——库尔特技术的典型水平。
此外，本文提供的数据表明，Moxi Z 可以提供有关细胞培养物整体健康状况的有价值信息。Moxi Z 利用曲线拟合方法，并结合专有的软件算法来确定该培养健康评估结果。与细胞死亡相关的形态学变化（如起泡、破裂和体积畸变）（Kataoka 和 Tsuruo 1996，Liegler 等 1995，Sheridan 等 1981）12-14，使得 Moxi-Z 能够区分活细胞群体与死细胞/碎片群体之间的阻抗差异。MVI 是通过分析培养物/颗粒的大小分布，识别颗粒碎片、皱缩的坏死细胞以及目标曲线拟合细胞群体的相对贡献而生成的。因此，MVI 值反映了单一分散细胞群体计数相对于整体颗粒群体分布的群体指数或比率度量。该值随后会根据群体统计学和经验观察结果进行算法调整。由于 MVI 考察的是传统染色方法以外的参数，因此其结果并不预期与这些技术完全一致，而是为细胞培养的健康状态提供了有价值的补充视角，特别是在评估碎片和微生物污染物方面。
总之，Moxi-Z 细胞计数仪是一种超小型台式仪器，结合库尔特原理、曲线拟合软件算法以及专利的薄膜传感器技术，能够精确、可重复地检测细胞数量、细胞大小和细胞健康状态。使用 M 型样本盒时，可在 8 秒内对直径为 4–25 微米的颗粒进行计数（动态范围为 2–34 微米）；使用 S 型样本盒时，可在 15 秒内对直径为 3–20 微米的颗粒进行计数（动态范围为 2–26 微米）。此外，Moxi-Z 无需使用试剂即可完成细胞健康评估，相比人工计数，其劳动强度显著更低且主观性更小。与标准库尔特计数法相比，Moxi-Z 更快速、体积显著更小、提供更多信息、维护需求大幅减少、操作更简便，且成本仅为传统设备的一小部分。
披露
Gregory M. Dittami 和 H. E. Ayliffe 是 Orflo Technologies 公司的员工，该公司设计、制造并销售 Moxi Z。Richard D. Rabbitt 向 Orflo Technologies 提供兼职有偿咨询服务。
本文的制作与免费访问由 Orflo Technologies 赞助。
材料
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