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Drosophila 幼虫和蛹中本体感受器的可视化

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DOI：

10.3791/3846

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2012年6月13日

 ,  , 
1Department of Genetics and the Rappaport Institute for Research in the Medical Sciences, Rappaport Faculty of Medicine, Technion-Israel Institute of Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫和蛹的 chordotonal 器官进行免疫染色和可视化的方法。

摘要

本体感受是指通过响应来自身体内部的刺激，感知身体部位的运动或位置的能力。在果蝇和其他昆虫中，本体感受由一种称为弦音器官（chordotonal organs, ChOs）的特化感觉器官提供2。与黑腹果蝇（Drosophila）的许多其他器官一样，ChOs在果蝇的生活周期中会发育两次：首先，幼虫期的ChOs在胚胎发生期间发育；随后，成虫期的ChOs在幼虫的成虫盘中开始发育，并在变态过程中继续分化。

在胚胎发生过程中，幼虫弦音器官（ChO）的发育已被广泛研究10,11,13,15,16。每个弦音器官的核心是一个由神经元和鞘细胞组成的感受单元。该感受单元被拉伸于两类附属细胞之间，这些附属细胞通过特化的表皮附着细胞与角质层相连1,9,14。当果蝇幼虫运动时，表皮附着细胞之间的相对位移会导致感受单元被拉伸，从而引起树突外段特定的瞬时受体电位香草素（TRPV）通道开放8,12。所产生的信号随后被传递至中枢神经系统中的运动中枢模式发生器环路。

已在成年果蝇中描述了多种弦音器官（ChO）7。这些器官位于成年果蝇附肢（腿、翅膀和平衡棒）的关节附近，以及胸部和腹部。此外，数百个弦音器官共同构成了位于成年果蝇触角内的约翰斯通氏器官（Johnston's organ），该器官可将声学信号转化为机械能3,5,17,4。

与对胚胎期 chordotonal 器官（ChOs）发育的深入了解相比，关于这些器官在幼虫阶段形态的研究知之甚少。此外，除股节 chordotonal 器官18和约翰斯顿器官外，人们对成虫果蝇中 chordotonal 器官的发育与结构了解仍极为零散。

本文介绍了一种用于对三龄幼虫和蛹中的刚毛器官（ChOs）进行染色和可视化的方法。该方法可与遗传学工具结合使用，以更深入地表征果蝇中各类刚毛器官的形态，并理解其发育过程。

方案

开始前准备

  1. 培养所需的果蝇品系。保持培养瓶内果蝇密度适中（每50 ml培养瓶约30只果蝇）。每瓶仅让果蝇产卵一天，以确保幼虫有充足的食物供应，并在爬离培养基前达到最大体积。将培养瓶置于适宜温度下培养，直至三龄幼虫开始在瓶壁上爬行。
  2. 配制新鲜的磷酸盐缓冲液（PBS）和含0.1% Tween的PBS（PBT）。取10 ml PBS置于冰上预冷。
  3. 配制1–5 ml新鲜固定液（含4%甲醛的PBT），并置于冰上预冷。我们以市售的37–38%甲醛溶液作为储备液。

1. 三龄幼虫的解剖与固定

  1. 从培养瓶壁上选取一只游走期三龄幼虫，将其置于组织培养皿中硅胶解剖板（由DOW Corning Corporation的Sylgard 184硅弹性体试剂盒制成）上的一滴50 μl冰冻PBS液滴中。
  2. 用精细镊子（Dumont #5 镊子）夹住幼虫口钩附近部位，使其背面向上，并用一枚昆虫针（minutien，0.1 mm，不锈钢）穿过幼虫脑部固定。
  3. 用镊子夹住幼虫后端，轻轻牵拉，沿纵轴方向适度拉伸，并在两个后部气门之间插入另一枚昆虫针固定。
  4. 使用弹簧剪在体壁上做两个横向切口（垂直于前后轴），切口位置靠近前、后方的昆虫针。
  5. 使用弹簧剪从前方切口至后方切口沿背中线纵向剪开幼虫体壁。
  6. 用精细镊子去除内部器官（如肠道、唾液腺、马氏管等）及气管系统，随后用PBS轻柔清洗一至两次。
  7. 用镊子抓住两侧体壁瓣，将其展开，并在每侧使用两枚昆虫针将组织固定于解剖板上。
  8. 吸去PBS，加入50 μl固定液（含4%甲醛的PBT溶液），室温孵育20分钟。
  9. 移除固定液，用PBS洗涤两次；取出昆虫针，使用弹簧剪切除幼虫头部和尾部，保留矩形肌片组织；将固定好的组织转移至含有PBS的预冷Eppendorf管中。
  10. 当获得足够数量的固定幼虫后，可直接进行抗体染色。若不立即染色，应将固定幼虫用95%乙醇洗涤3次，每次5分钟，并在-20 °C条件下保存于95%乙醇中。

2. 蛹的解剖与固定

第一部分

  1. 处理样品瓶，方法与幼虫固定相同，直至三龄幼虫开始化蛹。每小时检查一次样品瓶，标记已化蛹的个体。将标记的蛹在24 °C下继续培养30–40小时，或在29 °C下培养24–27小时。
  2. 用精细镊子挑选20–30只适当年龄的蛹，放入一个暗色瓷质多孔解剖皿中。注意避免损伤目标组织。
  3. 从蛹壳中取出蛹。先剥离头端的前气孔盖（operculum），继续操作直至蛹完全脱离。将取出的蛹放入盛有PBT的孔中。依次完成所有蛹的取出。步骤2.4–2.6应每次处理五只蛹的小批量进行。
  4. 将五只蛹放置在解剖皿孔之间的平坦表面上。使用显微解剖刀切除头部顶端和腹部后端的尖部（也可使用两对镊子在蛹的两端撕开小孔）。
  5. 用精细镊子固定蛹体，使用1 ml注射器通过前端开口注入PBT，冲洗出蛹的内部器官。
  6. 将解剖后的蛹短暂浸入盛有PBS的孔中清洗，然后转移至预冷的固定液中，置于冰上的Eppendorf管内。
  7. 在4 °C下孵育过夜（ON）。

第二部分

  1. 弃去固定液，用 PBT 将蛹清洗三次，每次 5 分钟。将清洗后的蛹置于冰上保存。
  2. 在解剖皿的两个孔中加入 PBT。使用聚乙烯巴斯德吸管将数个蛹转移至其中一个孔中。
  3. 一次将一个蛹移入第二个孔中。使用两把尖端完全对齐的精细镊子，剥离翅部透明的蛹体角质层：用一把镊子将蛹固定在孔底，用另一把镊子轻轻撕开角质层。角质层撕开后，将其从翅面完整剥离。注意避免将翅从蛹体上完全分离。在剥离翅片区域的角质层后，继续剥离翅铰链部位的角质层（此处为翅本体感受器 ChOs 所在位置）。
  4. 在完成翅部角质层的剥离后，可采用类似方法尝试剥离腿部的角质层。此过程中可能会丢失较多腿部结构，尽管收获率较低，但仍强烈建议进行此步骤，因其可显著改善腿部本体感受器 ChOs 的染色效果。平衡棒和腹部的本体感受器 ChOs 无需进一步剥离角质层即可观察。
  5. 将已“去壳”的蛹放入装有甲醇的 Eppendorf 管中，于室温下保存。继续处理其余蛹体，并将所有处理完毕的样本加入同一管中。每次染色实验应至少收集 10 个剥离良好的蛹。
  6. 移除甲醇，用 95% 乙醇清洗三次，每次 5 分钟。固定后的蛹可在 -20 °C 条件下长期保存于 95% 乙醇中。

3. 幼虫和蛹的免疫染色

  1. 用 PBT 在室温下清洗固定组织三次，每次 30 分钟。幼虫可在旋转板上轻轻振荡清洗，蛹则无需振荡。
  2. 用封闭缓冲液（PBT + 5% 正常山羊血清）替换 PBT，并在 4 °C 下孵育过夜。
  3. 移除封闭缓冲液，加入一抗（用封闭缓冲液稀释），在 4 °C 下孵育过夜。
  4. 按照步骤 3.1 的方法，用 PBT 清洗四次。
  5. 移除 PBT，加入二抗（用封闭缓冲液稀释），在 4 °C 下孵育过夜。
  6. 按照步骤 3.1 的方法，用 PBT 清洗两次，再用 PBS 清洗一次。
  7. 用封片剂（Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)）替换 PBS，并在 4 °C 下孵育过夜。

4. 幼虫的固定

  1. 将幼虫置于载玻片上的一滴封片剂中，使表皮朝下，体壁肌肉朝上。在干净的盖玻片上滴加少量封片剂，用于覆盖样品。切勿对已封片的幼虫施加任何压力。

5. 蛹的固定

  1. 准备两张载玻片，每张滴加一滴封片介质，一张用于解剖，另一张用于封片。
  2. 将数只蛹放置在其中一张载玻片上。
  3. 使用弹簧剪除去头部和腹部后段。
  4. 在翅与足之间进行剪切，将胸部背侧部分与腹侧部分分离。
  5. 将解剖后的蛹体各部分置于第二张载玻片的封片液滴中，确保翅和足充分伸展，并尽可能减少组织重叠。
  6. 在盖玻片上滴加一滴封片介质，将其覆盖在样品上，切勿对封片后的样品施加压力。

6. 代表性结果

三龄幼虫的免疫染色触角器官示例显示于 图1此示例显示了一个充分伸展的腹部节段，其中八个 chordotonal 器官（ChOs）中有七个清晰可见。神经元使用单克隆抗体 MAb22C10（1:20，购自爱荷华大学发育研究杂交瘤库）标记；帽细胞、韧带细胞、帽附着细胞和韧带附着细胞使用抗 αTub85E 抗体（1:10，Klein 等，2010）标记。荧光染色的二抗为 Cy3 或 Cy5 标记的抗小鼠/兔抗体（1:200，Jackson Immunoresearch Laboratories）。样品使用共聚焦显微镜（LSM 510，Zeiss）观察。

显示的是35小时龄蛹的腹侧径脉处的一簇翅本体感受器 图2.

神经网络示意图，蛋白质定位；荧光显微镜，神经连接分析。
图1. (A) 构成单个弦音器官（Ch organ）的六种细胞类型的示意图：帽附着细胞（CA）、帽细胞（C）、鞘细胞（S）、神经元（N）、韧带细胞（L）和韧带附着细胞（LA）。LCh5器官由五个弦音器官（ChO）聚集而成，横跨外侧横向肌群（LT1-4）。图中还展示了外侧纵肌（LL1）、腹侧纵肌（VL1-4）和外侧斜肌（LO1）。腱细胞以棕色球体表示（引自Klein等，2010）。 (B) 三龄幼虫一个腹部节段在10倍放大下的图像。每个腹部节段存在的八个弦音器官中有七个清晰可见：五个共同组成五小体器官（pentascolopidial organ）的外侧器官（LCh5），一个单独的外侧器官（LCh1），以及两个腹侧弦音器官中的一个（VChB）。弦音器官的神经元（N）用神经元标记物MAb 22C10（红色）标记。韧带（L）、帽细胞（C）以及附着细胞（LA、CA）用抗αTub-85E抗体（蓝色）标记。帽细胞和韧带细胞还用一种特异性表达于弦音器官的GFP报告基因标记，该报告基因含有来自dei位点的调控元件（Nachman 等，未发表数据）。

神经结构的荧光显微镜图像；光谱装置中显示的蛋白质 22C10、αTub85E 和 GFP。
图 2. 在40倍放大下观察位于腹侧径向脉的翅弦音器官。神经元（N）用神经元标记物22C10（红色，B）标记。韧带（L）和帽（C）细胞则共同标记了抗αTub85E抗体（蓝色，C）以及一种弦音器官特异性的GFP报告转基因（Nachman 等，未发表数据）。

讨论

本视频中描述的方案提供了一种在幼虫和蛹期可视化本体感受型壳器官（ChOs）的方法。迄今为止，关于本体感受型壳器官结构与发育的研究主要局限于胚胎期以及幼虫的成虫盘阶段。因此，幼虫后期及成虫壳器官发育的许多方面仍知之甚少。该方案结合常用的遗传学工具，可有效拓展对这些发育阶段的研究。 果蝇可用于鉴定和研究在眼形体（ChOs）发育后期阶段发挥作用的新基因与信号通路。本方案已针对眼形体的可视化进行优化，但亦可调整用于其他组织的染色，例如蛹翅。 6.

致谢

作者感谢爱荷华大学发育研究杂交瘤库为我们提供抗体。本工作由以色列科学基金会资助（项目编号：29/08）。A.S. 还获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）研究基金的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜蒙特 #5（或 #55）镊子，生物学尖头F.S.T.11252-20 或 11252-10（或类似规格的镊子）
Austerlitz 不锈钢昆虫针，微型针 0.1 mmRoboz 外科器械公司RS-6083-10
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒道康宁240.4019862
Vannas 微型剪刀（直头，7.5 cm，刀刃 3 mm）AS Mdeizintechnik GmbH11-590-00具有相同规格的 Vannas 弹簧剪刀可从 Roboz 外科器械公司购买
轨道摇床 - Rotamax-120Heidolph不适用
Dako 荧光封片介质Dako
10 倍浓度 PBS 配方PBS 的质量对本实验方案的成功至关重要2 g/L KCl，2 g/L KH2PO4，80 g/L NaCl，
21.7 g/L Na2HPO4·7H2O
PBT1× PBS 加 0.1% Tween 20

参考文献

  1. Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
  2. Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
  3. Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
  4. Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
  5. Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
  6. Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
  7. Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
  8. Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
  9. Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
  10. Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
  11. Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
  12. Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
  13. Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
  14. Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
  15. Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
  16. Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
  17. Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
  18. zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).

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