小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的质量取决于合适的小鼠品系，例如 CF-1。来源于这些细胞的具有多能性支持能力的 MEFs 及其条件培养基（CM）应含有适量浓度的 Activin A、Gremlin 和 Tgfβ1，以协同维持 Activin/Nodal 和 FGF 信号通路，从而支持细胞的自我更新和多能性。
本文内容
摘要
摘要
通常情况下，人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs）1可在多种条件下培养。然而，建立一种有效的细胞培养体系并不容易。由于培养条件会影响赋予hESCs和hiPSCs多能性的基因表达，因此培养方法的优化与标准化至关重要。
最初建立人类胚胎干细胞（hESC）系时，使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层细胞，并采用含胎牛血清（FBS）的培养基2。随后，FBS被无血清替代物（knockout serum replacement, KSR）和FGF2取代，后者可促进hESC的增殖3。之后，无饲养层培养系统被开发出来，可在Matrigel包被的培养板上，使用含KSR的条件培养基（由MEFs条件化处理的培养基）进行细胞培养4。此后，hESC的培养条件逐步发展为在化学成分明确的条件下进行无饲养层培养5-7。此外，为避免病原体和动物源性蛋白可能带来的污染，已建立了使用无异源成分（xeno-free）的培养方法8。
为了获得更优的培养条件，小鼠饲养层细胞已被人类细胞系所取代（例如胎儿肌肉和皮肤细胞9、成人皮肤细胞10、包皮成纤维细胞11-12、羊膜间充质细胞13）。然而，使用人包皮成纤维细胞来源的饲养层维持未分化人胚胎干细胞（hESC）的效率仍低于小鼠饲养层细胞，这主要是由于其分泌的激活素A（Activin A）水平较低14。显然，小鼠与人类饲养层细胞在生长因子的产生方面存在显著差异。
对小鼠和人类饲养层细胞转录组的分析揭示了支持性细胞与非支持性细胞之间存在显著差异。外源性 FGF2 对维持 hESC 和 hiPSC 的自我更新至关重要，并已被确定为调控饲养层细胞中 Tgfβ1、Activin A 和 Gremlin（一种 BMP 拮抗剂）表达的关键因子。研究表明，Activin A 可诱导 hESC 中 OCT4、SOX2 和 NANOG 的表达15-16。
长期培养时，人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）可在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，或在基质胶包被的培养板上使用MEF条件培养基（MEF-CM）无饲养层条件下培养，以维持其未分化状态。这两种培养条件的成功完全依赖于饲养细胞的质量，因为饲养细胞直接影响hESCs的生长。
本文介绍了一种优化的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）分离与培养、条件培养基（CM）制备以及酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法，用于检测培养基中激活素A（Activin A）的水平。
方案
1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离
以下两个步骤在非无菌条件下进行。
- 通过颈椎脱位法处死一只怀孕小鼠（CF1，Harlan，USA），孕龄为13或14 d.p.c.（交配后天数）。
- 取出子宫角，用70% (v/v) 乙醇短暂漂洗，然后放入含有不含Ca2+和Mg2+的PBS（Gibco，Invitrogen）的Falcon管中。
以下步骤均在组织培养罩内以无菌条件并使用无菌器械进行。
- 将子宫角放入培养皿中，分离每个胚胎与其胎盘及胚囊。
- 解剖头部和红色器官，用 PBS 洗涤，并将所有胚胎置于干净的培养皿中。使用无菌剃刀片将组织切碎至可移液的程度。
- 每枚胚胎加入 1 ml 含 100 Kunitz 单位 DNase I（USB）的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（Gibco, Invitrogen）。
- 将组织转移至 50 ml Falcon 管中，在 37 °C 下孵育 15 分钟。每孵育 5 分钟后，通过反复吹打充分解离细胞。
- 加入约等体积的新鲜配制的 MEF 培养基以终止胰蛋白酶消化作用。
MEF 培养基（配制 500 ml 培养基的组分，混合所有组分后过滤）：
450 ml DMEM，50 ml FBS（10% (v/v)），5 ml 200 mM L-谷氨酰胺（1/100 (v/v)），5 ml 青霉素-链霉素（1/100 (v/v)）。 - 以低速（300 x g）离心 5 分钟，小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于温热的 MEF 培养基中。
- 将相当于 3–4 枚胚胎数量的细胞接种至经 0.2% 明胶（牛皮来源，B 型，Sigma）包被 2 小时的 T150（TPP）培养瓶中。成纤维细胞（P0，第 0 代）是唯一能够贴附于明胶包被培养瓶的细胞。
- 理想情况下，细胞在 24 小时后达到 80–90% 汇合度，此时大部分 P0 细胞应冻存以备将来使用。
- 将剩余的 P0 细胞培养瓶扩增至 P3 或 P4 代，随后灭活并用作饲养层以重铺 hESC，或用于制备条件培养基（CM）。
2. MEF细胞（饲养层细胞）的灭活与铺板
所有步骤均在组织培养罩内以无菌条件进行。
- 用0.2%明胶包被T150培养瓶，在室温下孵育至少2小时。
- 将丝裂霉素C用PBS稀释（1 mg/ml），并过滤。
- 吸除MEF培养基，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤。
- 向MEF中加入20 ml含有10 μg/ml丝裂霉素C的培养基。
- 在37 °C下用含丝裂霉素C的培养基孵育2小时，然后用PBS洗涤两次，消化（胰蛋白酶处理），离心（300 × g，5分钟），并将细胞重悬于预温的培养基中。
- 计数细胞，并以56,000个细胞/cm2的密度接种于T150培养瓶中，用于后续6天的条件培养基（CM）制备。
3. 条件培养基（CM）的制备
所有步骤均在组织培养罩内以无菌条件进行。
- 在以 56,000 个细胞/cm2 的密度接种灭活 MEF 后的第二天，将 MEF 培养基更换为添加了新鲜 4 ng/ml FGF2 的 hESC 培养基（UM，未条件化培养基）（0.5 ml/cm2）。
- 在 24 小时培养后，收集饲养层培养瓶中的条件培养基（CM），并向饲养层中加入含有 4 ng/ml FGF2 的新鲜 hESC 培养基。
- 在接下来的 6 天内重复此操作。每天将收集的 CM 储存于 -20 °C。
- 6 天后，混合所有培养基等分试样并过滤（Corning，0.22 μm，PAS）。分装成 50 ml 每份，储存于 -80 °C。
- 在将 CM 用于 Matrigel 上培养的 hESC 前，额外补充 4 ng/ml FGF2。
4. 条件培养基中激活素A的测定（ELISA）15
- 将所有样品和试剂恢复至室温。
- 用含1% BSA的PBS稀释捕获抗体（Human\Mouse\Rat Activin A MAb, R&D Systems），每孔加入100 μl，于室温孵育过夜。
- 24小时后，用PBST（含0.05% Tween 20的PBS）洗涤孔板3次（每孔300 μl），然后加入封闭液（1% BSA/PBS，每孔300 μl），室温封闭1小时。
- 在此期间，配制Activin A（R&D Systems）标准曲线，包括7个稀释浓度（浓度低于30 ng/ml）及空白对照样品。Activin A的线性工作范围为0.25至32 ng/ml。
- 将标准品和样品各设复孔，每孔加入100 μl，室温孵育2小时。
- 用PBST洗涤孔板3次（每次每孔300 μl）。
- 加入二抗（生物素标记的抗体，Human/Mouse/Rat Biotinylated Activin A MAb, R&D Systems），用1% BSA/PBS稀释至0.25 μg/ml，每孔加入后室温孵育2小时。
- 用PBST洗涤孔板3次（每次每孔300 μl），加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP，用1% BSA/PBS稀释，R&D Systems），室温孵育20分钟。
- 用PBST洗涤孔板3次（每次每孔300 μl），每孔加入100 μl底物溶液（Quantikine, R&D Systems），避光室温孵育30分钟。
- 每孔加入100 μl终止液（Quantikine, R&D Systems），轻轻混匀。
- 将酶标仪（Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota）设定为450 nm检测波长，并以540 nm或570 nm作为校正波长，测定各孔的光密度值。
5. 代表性结果
分离流程的整体方案见图1。在不同培养条件下培养的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）的典型形态见图2。用于制备条件培养基（CM）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）及灭活饲养层细胞的形态见图3。通常情况下，细胞在分离后24小时应达到汇合状态，并可进行冻存或扩增。然而，有时可能需要2至3天才能获得汇合的细胞培养物。CM应使用第4代细胞制备，不应晚于该代次。这一点至关重要，因为原代细胞在出现衰老之前仅能传代4至5次。
细胞因子Activin A被认为是饲养层细胞分泌的、支持多能性细胞未分化生长的最关键因子14。检测CM中Activin A的水平（图4）是一种非常便捷的定量检测方法，可用于监测MEF细胞的质量。
图1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）分离流程的示意图。
图2. 未分化hESCs在(A)饲养细胞、(B)条件培养基和(C)确定成分培养基中培养时的典型形态。hiPSCs在(D, E)饲养细胞存在下培养时的典型形态。
图3. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的典型形态。(A) 接种/分离后第2天的第0代（P0）细胞，(B) 失活饲养层细胞，密度为56,000个细胞/cm2
图4. 采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测由CF1小鼠品系来源的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）制备的条件培养基（CM）中Activin A的浓度。CM收集6天后混合。CM"1"和CM"2"代表不同批次的培养基，UM代表未条件培养基。由于条件培养过程的功能是由MEFs向培养基中分泌Activin A，因此Activin A在UM中几乎无法检测到。
讨论
本文所述的MEF分离方法可建立标准化的hESC和hiPSC培养条件。此外，用于评估饲养细胞细胞因子分泌的基于ELISA的检测系统，是判断MEF来源条件培养基质量的有效指标。为避免培养基批次间的差异，需常规维持提供支持性成纤维细胞的小鼠品系（CF1）。同时建议从多只小鼠中同步分离胚胎，以获得质量稳定的细胞。新鲜分离的MEFs可在P0和P1代冻存保存。经灭活处理的MEFs也可根据细胞培养需求，分装为适当数量后冻存。通常，培养hESC和iPS细胞时，每孔6孔板接种约250,000个细胞即可。该方法经过建立与优化，可常规应用于减少不同实验间的变异性。
致谢
特别感谢 Boris Greber 博士建立了 Activin A ELISA 方案，该方案发表于 Greber et al. 2007。我们特别感谢 Monica Shevack 女士绘制了图示概览。我们非常感谢 Heiko Fuchs 博士在拍摄前及拍摄过程中提供的所有帮助和宝贵建议。我们谨向 Adjaye 实验室的全体成员致以谢意，尤其感谢 Elisabeth Socha 持续提供 MEFs 和 CM。我们还感谢马克斯·普朗克分子遗传学研究所动物实验中心的同事们给予的长期支持。本工作部分由马克斯·普朗克学会以及德国联邦教育与研究部（BMBF；资助号 0315717A）资助，后者为欧盟第七框架计划 ERA-NET Plus 项下的 ERASysBio+ 倡议合作伙伴。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM（高糖） | Gibco，Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco，Invitrogen | 25030-024 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco，Invitrogen | 15140-122 | |
| 真空过滤系统 | 康宁 | 431097 | 500 ml，0.22 μm，过碘酸雪夫染色 |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| 敲除DMEM | Gibco，Invitrogen | 10829-018 | |
| 无血清替代物 | Gibco，Invitrogen | 10828-028 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco，Invitrogen | 11140-035 | |
| β-巯基乙醇–乙醇 | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco，Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| 丝裂霉素C | 罗氏 | 10107409001 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | PeproTech | 100-18B | |
| 生物素标记的抗人/小鼠/大鼠激活素A抗体 | R&D Systems | BAM3381 | |
| 明胶 | Sigma | G9391 | |
| 人/小鼠/大鼠 Activin A 单克隆抗体 | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco，Invitrogen | 25300-054 | |
| 超薄虹膜剪 | FST | 14088-10 | |
| 超细格雷夫镊 | FST | 11150-10 | |
| 皮尔斯固定镊 | FST | 18155-13 |
参考文献
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