迄今为止，尝试在Saccharomyces cerevisiae中表达囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）所获得的蛋白产量均相对较低。本实验方案及囊性纤维化基金会分发的相关试剂应可实现此类“难表达”真核膜蛋白的毫克级制备。
本文内容
摘要
摘要
囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种氯离子通道，其发生突变可导致人类囊性纤维化。因此，该蛋白受到广泛关注，但对其结构与活性的研究一直受到蛋白表达与纯化量不足的限制1-3。与许多“难表达”的真核膜蛋白类似，在快速生长的生物体中进行表达是理想选择，但具有挑战性；在酵母S. cerevisiae中，迄今为止获得的蛋白量较低，且观察到重组蛋白迅速降解4-9。已有研究描述了参与酵母中重组CFTR加工的蛋白质6-9。本报告中，我们介绍了一种在酵母中表达并大量纯化CFTR的方法。该方案阐述了如何克服早期的蛋白水解问题，以及如何通过优化细胞生长条件和控制诱导条件（特别是收获细胞前的时间段）显著提高CFTR的表达水平。本方案相关的试剂（表达小鼠CFTR的酵母细胞或酵母质粒）将通过资助本研究的美国囊性纤维化基金会进行分发。描述本报告所用CFTR构建体设计与合成的文章将另行发表（Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al.，未发表）。本文将从CFTR构建体转化酵母细胞开始介绍我们的方法——该构建体包含携带CFTR的酵母质粒（图1）。该构建体在其C末端融合了绿色荧光蛋白（GFP）序列，遵循Drew et al.（2008）10建立的系统。GFP的存在使得CFTR的表达与纯化过程能够被相对容易地追踪。JoVE可视化视频方案在从酵母细胞制备微粒体后结束，但我们也会提供一些从微粒体中进一步纯化蛋白的建议。读者可根据后续实验需求及本地可用设备，对微粒体纯化步骤进行适当修改。酵母表达的CFTR蛋白可通过金属离子亲和层析进行部分纯化，利用其内在的多聚组氨酸纯化标签。随后通过分子筛层析可获得纯度超过>90%的蛋白，该结果基于SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色分析判定。
方案
1. 培养基与缓冲液的制备
- YNB：每升溶液，将6.9 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基和0.77 g不含尿嘧啶的完全补充混合物溶于1 L水中。高压灭菌。4 °C保存。
- YNBA：配制400 ml，将2.76 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、0.38 g不含尿嘧啶的完全补充混合物和8 g细菌学琼脂溶于350 ml水中，高压灭菌。将8 g葡萄糖与50 ml水混合，轻轻加热至完全溶解。经0.2 μm滤膜过滤除菌后，在琼脂仍处于熔融状态时加入其中。室温保存。
- 20%葡萄糖培养基：配制500 ml，将100 g葡萄糖与500 ml YNB混合，轻轻加热至完全溶解。经0.2 μm滤膜过滤至无菌Duran瓶中。室温保存。
- 20%半乳糖培养基：配制2 L，将400 g半乳糖与2 L YNB混合，轻轻加热至完全溶解。经0.2 μm滤膜过滤至无菌Duran瓶中。室温保存。
- 蛋白酶抑制剂储备液：CFTR极易发生蛋白水解4。作者发现以下抑制剂可有效抑制蛋白水解，但读者可根据自身实验需求调整该列表。为避免反复冻融，建议分装为100 μl每份，-20 °C保存。所有抑制剂均需从储备液稀释至如下工作浓度：
| 抑制剂 | 储存浓度 | 储存液配制方法 | 工作浓度 |
| AEBSF | 200 mM | 将48mg溶于1ml蒸馏水中 | 0.2 mM |
| Benzamidine | 300 mM | 将36mg溶于1ml蒸馏水中 | 0.3 mM |
| Chymostatin | 4 mM | 将2.5mg溶于1ml无水DMSO中 | 4 μM |
| E-64 | 7 mM | 将2.5mg溶于1ml蒸馏水中 | 7 μM |
| Leupeptin | 20 mM | 将10mg溶于1ml蒸馏水中 | 20 μM |
| Pepstatin A | 15 mM | 将10mg溶于1ml无水DMSO中 | 15 μM |
| PMSF | 1 M | 将174mg溶于1ml无水DMSO中 | 1 mM |
- DTT（1 M）：将 154 mg 二硫苏糖醇溶解于 1 ml 蒸馏水中。于 -20 °C 保存。使用时按 1:1000 比例加入指定缓冲液中。
- EDTA（0.5 M）：将 29.22 g 乙二胺四乙酸与 100 ml 水混合，逐滴加入 10 N NaOH，直至 EDTA 完全溶解且 pH 达到 8。加水定容至 200 ml，经 0.2 μm 滤膜过滤至无菌 Duran 瓶中。室温保存。
- CRB（300 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.56 M 山梨醇，1 mM EDTA）：将 18.17 g Tris 碱溶解于 350 ml 水中，加入 HCl 调节 pH 至 7.4。加入 51.35 g 山梨醇，加水定容至 500 ml。高压灭菌。加入 1 ml EDTA 储存液，于 4 °C 保存。
- CFTR 缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，10% v/v 甘油）：将 6.06 g Tris 碱溶解于 500 ml 水中，用 HCl 调节 pH 至 8，加入 100 ml 甘油，加水定容至 1 L。高压灭菌后于 4 °C 保存。
- 2× 上样染料：50 mM Tris-HCl（pH 7.6），5% 甘油，5 mM EDTA（pH 8.0），0.02% 溴酚蓝，4% SDS，0.05 M DTT。配制 10 ml，分装后于 -20 °C 保存。
2. 筛选转化子
本实验方案假设CFTR-GFP-8His融合基因已插入酵母质粒中，位于GAL1半乳糖启动子的下游（图1），且该质粒已转化至FGY217细胞中，即S. cerevisiae10的Pep4缺失突变体。细胞可在YNBA平板上培养，并于4 °C保存数周。如需长期保存，应制备甘油菌种并于-80 °C冻存。克隆与转化的具体方法详见Drew et al. (2008)10的描述。
- 从转化平板上挑选5-10个分布良好的单菌落，将每个菌落分别转移至含有9 ml YNB培养基和1 ml 20%葡萄糖溶液的无菌50 ml Falcon管中。此步骤需确保培养液中葡萄糖的终浓度为2%（w/v），以维持细胞生长。于250 rpm条件下培养过夜，共16小时。 30 °C 在轨道摇床培养箱中。
- 为每个筛选出的菌落制备甘油菌种。无菌操作下，将0.8 ml过夜培养物加入含有0.2 ml无菌甘油的已标记螺旋盖小管中，短暂涡旋混匀后，于-80°C保存80 °C.
- 将剩余的过夜培养物用YNB稀释至终体积50 ml，包括 250 μl 20%葡萄糖培养基。此步骤中，必须将培养基中的葡萄糖浓度稀释至约0.1%（w/w），因为高浓度葡萄糖可能抑制 GAL1 启动子10在标记的250 ml锥形 baffled 烧瓶中培养菌液至OD600 250 rpm 下的 0.7–0.8 30 °C 在轨道摇床培养箱中。
- 通过向每个烧瓶中加入5 ml 20%半乳糖培养基诱导培养，并继续培养16小时。
- 使用荧光显微镜检测CFTR的表达。进行 100 μl 培养物并添加 100 μl 甘油以限制细胞在溶液中的运动。使用Delta Vision RT复原显微镜（或类似设备）在FITC滤光片下通过蓝色激光进行细胞观察（激发波长为490 nm，发射波长为528–538 nm）。CFTR-GFP融合蛋白的阳性表达表现为酵母细胞质膜处的环状荧光信号。未转化的酵母细胞可作为对照使用。
- 将培养物转移至50 ml Falcon离心管中。在3500 x g条件下离心收集细胞， 4 °C 在台式离心机中离心10分钟。离心机运行期间，准备含约 500 μl 经酸洗的玻璃珠，置于冰上。弃去上清液，将每份沉淀重悬于 500-800 μl 冰冻的CRB 与 蛋白酶抑制剂。将悬浮液转移至含有珠子的微量离心管中，并置于冰上保存。
- 通过剧烈振荡或涡旋每个微量离心管，每次30秒，共10个周期，每周期之间将管置于冰上休息，以裂解细胞。也可使用珠磨器作为替代方法，例如使用BioSpec迷你珠磨器运行3分钟。
- 将试管放入台式微量离心机中，在3,500 x g条件下离心 4 °C 5 分钟。将含有粗膜组分的上清液转移至洁净的微量离心管中，置于冰上。加入 500 μl 新鲜冰冷的CRB 加入蛋白酶抑制剂至各管，并重复该步骤以富集膜组分。
- 通过高速离心收集粗制膜组分， 4 °C 在台式微量离心机中离心2小时。弃去上清液，将每份沉淀重悬于 50 μl 冰冻的CFTR缓冲液。
- 在洁净的微量离心管中混合 15 μl 每种悬液的 15 μl 用移液器反复吹打使样品与2x上样染料混合。室温孵育10分钟。切勿煮沸样品，因为这会导致CFTR及其他膜蛋白形成SDS不溶性聚集体，并使GFP标签变性。
- 将样品与 PageRuler Plus 预染蛋白标准品（Fermentas）一同上样至 4-20% Tris/甘氨酸梯度凝胶（NuSep），在 150 V 条件下电泳 40 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。
- 通过凝胶内荧光鉴定表达量最高的细胞。将凝胶放入荧光成像系统（如Typhoon扫描仪）中，使用蓝色激光在488 nm激发波长和526 nm发射波长下扫描凝胶。CFTR-GFP融合蛋白应在约220 kDa处可见。此外，在约70 kDa处可见一条微弱的荧光条带，该条带可能为酵母内源性的含FAD膜蛋白（如琥珀酸脱氢酶亚基A）。 11,12.
- 用考马斯亮蓝染色凝胶，脱色后使用合适的图像浏览软件扫描凝胶，以便与荧光扫描结果进行比较。经考马斯亮蓝染色的凝胶可在对每泳道所加载的总蛋白量进行归一化后，相对评估不同克隆株中CFTR-GFP的表达水平。
- 从甘油菌种（2.2）中划线接种表达量最高的细胞株至新鲜的YNBA培养基上 接种平板并在指定条件下培养 30 °C 2-3天。此平板可在 4 °C.
3. 大规模发酵罐培养
- 为发酵罐准备预培养物。用接种环刮取1cm²的菌苔2 来自YNBA的细胞区域 平板（2.13）用无菌接种环接种，加入45 ml YNB和5 ml 20%葡萄糖培养基，使OD600 约为 0.1。在 250 ml 三角摇瓶中，于 250 rpm 条件下培养， 30 °C 在轨道摇床培养箱中振荡培养直至OD600 达到1。
- 将培养物分装至两个2 L带挡板的锥形瓶中，每个锥形瓶中含有450 ml YNB和25 ml 20%葡萄糖培养基。在250 rpm条件下培养。 30 °C 在轨道摇床培养箱中振荡培养直至 OD600 达到 1.2。
- 在预培养物生长的同时，准备发酵罐。按照1.1中的描述配制11.2 L YNB培养基，但需额外溶解8.28 g YNB和0.95 g缺失营养补充剂，以补偿诱导时添加的甘油所导致的稀释效应。将11.2 L YNB培养基和75 mL 20%葡萄糖培养基无菌加入一个灭菌的20 L发酵罐中，并将运行温度调节至 30 °C.
- 无菌条件下将预培养物加入发酵罐中，设定搅拌速度约为 800 rpm，并将温度维持在 30 °C. 压缩空气的流速应约为 15 dm3分钟-1当发酵罐培养物达到指定OD值后600 1.2，通过无菌添加1.5 l YNB 20%半乳糖溶液和1.2 l甘油进行诱导。将温度降至 25 °C 培养16小时。
- 使用蠕动泵将发酵罐中的内容物转移至预冷的1 L离心管中，并置于冰上。在3,500 x g条件下离心收集细胞， 4 °C 在大容量转子（例如6升）中离心30分钟。将细胞重悬于150 ml含蛋白酶抑制剂的预冷CRB中。此后所有操作均应在低温条件下进行 4 °C.
- 使用 Constant Systems 细胞破碎仪，在 25、30、32 和 35 kPa 条件下各进行 1 次，共 4 次，破碎细胞，并在每次操作后将裂解物收集于冰上。或者，使用珠磨仪（Biospec），加入等体积经酸洗的 0.5 mm 玻璃珠，以最大功率振荡 3 分钟。将裂解物转移至 50 ml Falcon 管中，于 3,500 × g 离心，沉淀细胞碎片。 4 °C 在台式离心机中离心15分钟。
- 将上清液转移至预冷的离心管中。在14,000 x g离心， 4 °C 在离心机中离心30分钟以去除线粒体。
- 将上清液转移至预冷的超速离心管中，在200,000 x g条件下离心 4 °C 在超速离心机中离心90分钟以收集微粒体。
- 小心倾去上清液并弃去，向每管中加入2 ml冰冻的含蛋白酶抑制剂和1 mM DTT的CFTR缓冲液。用画笔轻轻重悬沉淀，用CFTR缓冲液补满每管，使用涡旋振荡器混匀。
- 以 200,000 x g 离心该悬液， 4 °C 在超速离心机中离心60分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于2 ml冰预冷的含蛋白酶抑制剂的CFTR缓冲液中 （不使用DTT）用画笔涂抹。
- 将重悬的微粒体合并，用CFTR缓冲液调节终体积至50 ml，并充分混匀。保留1 ml等分试样用于SDS-PAGE凝胶分析，具体步骤见2.9–2.11。微粒体现在可用液氮速冻，随后于-80℃保存80 °C 直到需要时
- CFTR 可使用以下其中一种去污剂从微粒体中提取：全氟辛酸锂盐（LiPFO）、十四酰基溶血磷脂酰甘油（LPG14）、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）。将微粒体与 CFTR 缓冲液、蛋白酶抑制剂及 5%（w/w）去污剂混合。若使用 DDM，还需在缓冲液中加入 300 mM NaCl。振荡混合 4 °C 在管式旋转仪上旋转15分钟。
- 以 100,000 x g 离心样品， 4 °C 在超速离心机中离心1小时。保留上清液，并取少量用于SDS-PAGE凝胶分析。现在可通过固定化金属亲和层析结合尺寸排阻层析，从溶解的样品中纯化CFTR。
4. 代表性结果
用含有CFTR的质粒转化酵母并非100%高效。在转化实验中，对所选菌落进行CFTR表达的小规模筛选，通常每4个菌落中约有1个表达该蛋白。图3的A面板展示了一个典型的从平板上挑取5个菌落进行筛选的结果。其中一个菌落显示出CFTR-GFP融合蛋白的高水平表达，其分子量通常介于250 kDa与130 kDa标记之间，如图所示。CFTR-GFP的荧光强度在不同实验间差异较大，图3中的菌落4其荧光强度比约70 kDa处的内源性荧光条带至少高出10倍。如果CFTR-GFP的表达水平所产生的荧光弱于70 kDa条带，则建议重新进行转化，并挑选CFTR-GFP表达水平更高的菌落。如图3A所示，即使CFTR-GFP表达量较高，通过考马斯亮蓝染色也难以在细胞裂解物中分辨出CFTR-GFP条带。
在选定的菌落经过大规模培养并分离出微粒体后，需要检测微粒体内是否存在CFTR-GFP，如图3B所示。本实验结果不仅对于评估诱导表达效率至关重要，同时也可用于判断微粒体制备过程是否操作得当，以及蛋白水解是否已被最小化。图3B所示结果表明，与小规模实验（图A）相比，该实验中CFTR-GFP的表达量相对较低（以内在的70 kDa条带为参照）。然而，这一印象受到本次检测中荧光检测器过度曝光的影响，因为实验者当时正在检查是否存在CFTR构建体的蛋白水解片段。本实验中在130 kDa与100 kDa标记之间可观察到微弱的荧光蛋白水解片段信号，但与全长CFTR-GFP条带相比非常微弱。使用本文所述的蛋白酶抑制剂后，我们发现细胞破碎后CFTR的蛋白水解降解现象极少。若观察到明显的蛋白水解，建议重新配制新鲜的蛋白酶抑制剂储备液。我们还发现，商用蛋白酶抑制剂混合片剂在本体系中的效果较差。细胞在诱导后培养超过16小时将导致CFTR表达量下降，如图4所示。这可能是由于蛋白质发生周转，或与酵母细胞内蛋白质质量控制机制上调有关6-9,13。因此，建议在半乳糖诱导后尽可能监测CFTR的表达水平，因为最适收获时间可能因实验室条件不同而有所差异。
图1. 含CFTR构建体的酵母质粒。CFTR-GFP-8His融合片段插入到2μ p424GAL1表达载体中，受半乳糖（GAL1）启动子调控。该载体还含有尿嘧啶筛选标记（URA）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）。
图2. 概括可视化实验方案的流程图。
图3. CFTR表达与纯化的代表性SDS-PAGE凝胶。图A 显示随机挑选的五个转化子菌落（泳道1-5），用于筛选CFTR的表达。图B 显示从15升发酵罐培养物中分离得到的微粒体。图C 显示通过亲和层析 followed by 尺寸排阻层析的两步纯化后获得的纯化小鼠CFTR。所有凝胶均显示激发GFP结构域荧光的成像结果（左）及考马斯亮蓝染色后的结果（右）。分子量标准蛋白的位置列于左侧（kDa）。
图4. 酵母中CFTR表达的代表性数据。图A显示了用半乳糖诱导后CFTR表达的时间进程。通过SDS-PAGE分析细胞提取物，并对CFTR-GFP蛋白条带的GFP荧光信号进行积分定量。图B显示了诱导16小时后表达GFP的细胞进行荧光显微镜观察的典型结果。通常，仅有部分细胞以高水平表达CFTR。
讨论
本文提供了一种在酵母细胞中表达小鼠CFTR蛋白的方法，该方法将有助于囊性纤维化相关研究。本研究旨在与小鼠CFTR DNA质粒构建体的发布同步进行，该构建体将通过囊性纤维化基金会（http://www.cff.org/research/CFFT/）提供。其他同源物也将在后续陆续提供。将含CFTR的载体转化至酵母细胞中的过程较为直接，但关键在于筛选出高表达CFTR的菌落。表达水平的差异可能由多种因素引起，但每个细胞中质粒拷贝数的不同可能是造成表达量变异的重要原因。本文所描述的关键步骤可实现表达CFTR的酵母细胞及含CFTR的微粒体膜的制备。一旦掌握酵母细胞的转化、培养、收获和裂解技术，即可进一步纯化目标蛋白；图3展示了在此条件下可达到的蛋白纯度示例，可作为有用的参考基准。本文并不旨在提供蛋白纯化的详细方法学。然而，针对酿酒酵母（S. cerevisiae）表达系统特有的某些关键下游纯化步骤，如细胞裂解和微粒体纯化，本文已进行了详细说明。需要指出的是，除本文所采用的两种方法外，也可使用其他酵母细胞破碎方法，例如使用法国压力细胞（French pressure cell）。该重组蛋白在其C末端带有一个TEV蛋白酶可切割的GFP结构域，可在诱导后用于追踪蛋白表达情况（图4）。酵母自身含有一种70 kDa的内源性蛋白（可能为琥珀酸脱氢酶12），在相同条件下会产生荧光11，该蛋白可作为全细胞提取物或微粒体中CFTR相对表达水平的有用内参对照（图3）。从图4所示数据可以明显看出，在以半乳糖诱导后，细胞收获的时间点至关重要。CFTR的产量在诱导约16小时后急剧下降，诱导24小时后酵母细胞中几乎检测不到CFTR蛋白。
每15升发酵罐培养物可获得约1-2 mg的纯化CFTR蛋白。从微粒体阶段之前的总CFTR-GFP蛋白计算，回收率约为70%，而纯化蛋白的回收率约为25%。对酿酒酵母（S. cerevisiae）表达的CFTR蛋白的表征工作正在进行中。如图4所示，可通过荧光显微镜监测该蛋白在细胞内的定位。尽管大部分荧光信号如预期分布在细胞周边10，但部分蛋白呈现点状分布，位于质膜内侧或紧邻质膜内侧，这可能是由于CFTR通过晚高尔基体/内体途径循环14，或可能与内质网出芽形成运输囊泡后的下游区室有关4。使用PNGaseF（一种去糖基化酶）处理后，CFTR蛋白在SDS-PAGE中的迁移率变化极小，表明该蛋白未糖基化或仅有极低程度的糖基化15。关于该蛋白磷酸化状态的研究正在进行中。在目前已测试的部分去垢剂中，纯化后的蛋白表现出ATP酶活性，且该活性可被CFTR特异性抑制剂所抑制16，其活性速率与先前报道的结果相似2,15。要测定CFTR通道活性，需将纯化蛋白进行重建，这意味着最终纯化步骤应使用临界胶束浓度（cmc）相对较高的去垢剂17。含有CFTR的酵母微粒体可用多种常用去垢剂溶解18，包括十二烷基麦芽糖苷（dodecyl maltoside）等通常被认为“温和”的去垢剂2。然而，迄今为止大多数高cmc去垢剂在溶解过程中效率较低，提示在纯化流程中应考虑在后期阶段再置换至此类去垢剂。
致谢
我们感谢囊性纤维化基金会（CFF）通过其CFTR三维结构联盟（资助编号FORD08XX0）对本工作的资助。我们感谢联盟内所有同事对本研究作出的巨大贡献，特别是在CFTR基因设计方面。我们还感谢希腊德谟克利特国家科学研究中心的James Birtley博士、英国卡迪夫大学的Mark Young博士以及英国伦敦帝国理工学院的David Drew博士在本研究早期阶段所作出的宝贵贡献。我们特别感谢美国德克萨斯理工大学拉伯克分校的Ina Urbatsch博士对稿件进行的审阅。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FGY217 S. cerevisiae 菌株，带有 pep4 基因缺失 10 | |||
| 不含氨基酸的酵母氮源基础培养基 | Formedium | CYN0410 | |
| 不含尿嘧啶的完全补充混合物 | Formedium | DCS0169 | |
| 细菌学琼脂 | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-半乳糖 | Fisher | BP656-500 | |
| D-葡萄糖 | Fisher | D16-500 | |
| 胃蛋白酶抑制剂A（Pepstatin A） | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| 亮肽素（Leupeptin） | Merck | 108975 | |
| 抑肽酶（Chymostatin） | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF） | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| 环氧琥珀酰-亮氨酰胺基丁烷（Epoxysuccinyl-leucylamido-butane, E-64） | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| 氨基乙基苯磺酰氟（Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride, AEBSF） | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| 盐酸苯甲脒（Benzamidine hydrochloride） | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| 二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide, DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT） | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA） | Fisher | BP120500 | |
| Tris碱（Tris-base） | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-山梨醇（D-sorbitol） | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| 甘油（Glycerol） | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | Affymetrix | D310S | |
| 溴酚蓝（Bromophenol blue） | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus 预染蛋白标准品 | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-甘氨酸 4-20% 线性梯度胶 | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue 考马斯亮蓝染色液 | Novexin | ISB1L | |
| 酸洗玻璃珠 | Sigma | G8772 | |
| 50 ml 无菌 Falcon 管 | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2 ml 无菌螺口小瓶 | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250 ml 无菌带挡板锥形瓶 | BD Biosciences | 355119 | |
| 2 L 无菌带挡板锥形瓶 | BD Biosciences | 355131 | |
| 2 ml 微量离心管 | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μm 注射器滤器 | Sartorius | FC121 | |
| 超速离心管 | Beckman Coulter | 355618 | |
| 离心管 | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1 L 离心瓶 | Beckman Coulter | 969329 | |
| 带温控的轨道摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT 显微成像系统 | Applied Vision | ||
| 台式离心机 | HERMLE | Z300 | |
| 台式微量离心机 | Fisher | 13-100-511 | |
| 涡旋混合器 | Star Labs | ||
| Typhoon Trio 扫描仪 | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 成像系统 | Fuji | ||
| 20 L 发酵罐及控制系统 | Applikon | ||
| Constant Systems 细胞破碎仪 | Constant systems | ||
| BioSpec 珠磨式细胞破碎仪 | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 转子 | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 超速离心机 | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti 转子 | Beckman Coulter | 337901 |
参考文献
- Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
- Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
- Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
- Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
- Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
- Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
- Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
- Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
- Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
- Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
- Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
- Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
- Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
- Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
- Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
- Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).
重印与许可
标签
