方法文章

来自人类脐带血内皮细胞集落形成细胞的表型和功能特性

DOI：

10.3791/3872

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2012年4月13日

 ,  , 
1Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine

本文内容

摘要

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具有强大的克隆增殖潜能内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）循环内皮细胞，显示内在在体内血管形成能力。会CB衍生内皮细胞生长的表型和功能特性，是重要的识别和分离善意 ECFCs修复受损的组织，为潜在的临床应用。

摘要

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新的血液通过血管生成，血管，小动脉血管的形成长期的看法，最近已检讨1。循环内皮祖细胞（EPCs）的存在，首次发现麻原等。成人外周血中，在1997年2将注入新的假说和血管再生和修复策略。内皮祖细胞是罕见的，但正常的血液循环的组成部分，血管形成或血管重塑的网站，并在很大程度上促进通过旁分泌刺激现有的血管壁细胞中的3任产后的血管生成，血管生成，或小动脉。没有特定的标记，以确定一个EPC已经确定，目前该领域的国家是理解，许多类型的细胞，包括血管形成的造血干细胞和祖细胞，循环血管细胞，Tie2的+单核细胞 ，髓系祖CELLS，肿瘤相关巨噬细胞和M2激活巨噬细胞在多种临床前动物模型系统和人类受试者在许多疾病状态4，5，刺激血管生成过程的参与。内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）是可行的罕见循环内皮细胞，特点是强大的克隆增殖潜能，二级和三级集落形成能力后replating，为6-8免疫缺陷小鼠在移植后体内血管形成的内在能力。虽然ECFCs已成功地从外周血中分离的健康成人受试者，健康新生儿脐带血（CB）的，和血管壁无数人的动脉和静脉血管6-9，CB拥有ECFCs 7的频率最高，显示最强大的克隆增殖潜能和耐用，功能血管的形式在体内 8，10-13。而推导从成人外周血ECFC已提交14，15，在这里，我们描述的推导方法，克隆，扩展，并在体外以及在从人脐CB ECFCs 体内表征。

方案

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试剂和溶液

肌电图-2媒体（龙沙，猫。编号:CC-3162包含的EBM-2培养基和临时股东大会-2 SingleQuot的套件补充，生长因子）

EBM-2（龙沙，货号CC-3156），辅以整个SingleQuot套件补充和生长因子（龙沙，猫。CC-4176号），胎牛血清（FBS）和10％（V / V） 1％（V / V），青霉素（1万U /毫升）/链霉素（10,000微克/毫升）/两性霉素（25微克/毫升）。在4°C存储长达1个月建议的临时股东大会，2册，使用ECFC文化500μL/ 24孔板，2毫升/ 6孔板，5ml/25-cm 2瓶，10 ml/75-cm 2瓶，除非中另有规定的协议。

I型胶原溶液

在495毫升无菌蒸馏水（0.02列印终浓度）稀释的冰醋酸（17.4N）0.575毫升。无菌过滤器的稀醋酸，用0.22微米VACuum过滤系统。添加25毫克鼠尾I型胶原的稀醋酸至终浓度为50微克/毫升。胶原蛋白的添加量会有所不同，具体取决于对胶原股票浓度。在4°C储存长达一个月

I型胶原涂层的组织培养表面的制备

I型胶原在每一个6孔培养板（使用300μL/ 24孔板，3ml/25-....

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讨论

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假定内皮祖细胞的表型和功能特性，是重要的，以确定是否真正是能够克隆，并连续在文化再镀的的善意 ECFCs和耐用和功能， 在体内植入血管引起。脐血丰富与ECFCs这些循环细胞老化或疾病的10下降浓度。最近的研究表明，ECFC可能在血管修复或再生血管损伤，心肌梗死，或视网膜病变17-19的情况下发挥重要作用。

在这里，我们描述了简单而有效的方法，推导，克隆，扩展，并在体外以及从人类脐带会CB ECFCs 体内表征。这些方法使研究人员能够识别和分离善意会CB内皮祖细胞具有克隆增殖潜能和在体内血管形成能力。

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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尤德博士是EndGenitor科技公司的顾问和Rimedion科技公司的董事会成员

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂名称 公司 目录编号
肝素钠注射液，USP APP的制药 504031
Ficoll分离，Pague Amersham Biosciences公司 17-1440-03
混合套管马士基医学 500.11.012
EGM-2 龙沙 CC-3162
定义胎牛血清胎牛血清 SH30070.03
TrypLE快递 Gibco公司 12605
大鼠I型胶原 BD公司 354236
基底膜 BD公司 356234
FCR座美天旎生物技术 130-059-901
hCD31，FITC标记conjuga特德屋宇署Pharmingen公司 555445
hCD45，FITC标记屋宇署Pharmingen公司 555482
hCD14，FITC标记屋宇署Pharmingen公司 555397
hCD144，体育共轭 eBioscience 12-1449-80
hCD146，体育共轭屋宇署Pharmingen公司 550315
hCD105，体育共轭 Invitrogen公司 MHCD10504
1，K抗体，IgG的女士FITC标记屋宇署Pharmingen公司 555748
1，K抗体，IgG的女士聚乙烯共轭屋宇署Pharmingen公司 559320
女士抗体2A，K抗体，FITC标记屋宇署Pharmingen公司 555573
抗人类CD31的 Dako公司克隆JC70 /
抗-谅解备忘录éCD31的屋宇署Pharmingen公司 553370
0.22微米的真空过滤系统 Millipore公司 SCGPU05RE
冰醋酸，17.4N 费舍尔 A38-500
抗生素，抗霉菌 Invitrogen公司 15240-062
胎牛血清（FBS）， 胎牛血清 SH30070.03
免疫组化锌定影液 BD公司 550523
sytox绿色试剂 Invitrogen公司 S33025
克隆缸，无菌 Fisher Scientific则 07-907-10

参考文献

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  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  2. Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  3. Urbich, C., Dimmeler, S.

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Endothelial Colony Forming CellsUmbilical Cord BloodClonal Proliferative PotentialSingle Cell AssayIn Vivo Vessel FormationFlow CytometryFluorescence MicroscopyGel Matrix ImplantationNod Scid MiceCD31 CD34 Markers

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