内皮集落形成细胞（ECFCs）是一类具有强大克隆增殖潜能的循环内皮细胞，表现出固有的 体内 血管形成能力。对源自脐带血的外向生长型内皮细胞进行表型和功能特征鉴定，对于识别和分离这些细胞至关重要 真正有效的 用于修复受损组织的潜在临床应用的ECFCs。
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摘要
摘要
关于血管生成、血管发生和动脉生成促进新血管形成长期观点的最新综述1循环内皮祖细胞（EPCs）的存在最早由 Asahara 在成人外周血中发现。 等 1997年 2 为血管再生与修复带来了新的假说和策略。内皮祖细胞（EPCs）是循环血液中稀有但正常的组分，可归巢至血管形成或血管重塑部位，主要通过旁分泌方式刺激血管壁来源的既有细胞，促进出生后的血管生成、血管新生或动脉生成。3目前尚未发现可特异性识别内皮祖细胞（EPC）的标记物，该领域的现状是认识到多种细胞类型均具有促血管生成潜能，包括促血管生成的造血干细胞和祖细胞、循环血管生成细胞、Tie2+ 单核细胞、髓系祖细胞、肿瘤相关巨噬细胞以及M2活化型巨噬细胞在多种临床前动物模型系统及人类多种疾病状态下均参与促进血管生成过程4, 5内皮集落形成细胞（ECFCs）是一类罕见的循环活体内皮细胞，具有强大的克隆增殖潜能、再接种后形成二级和三级集落的能力，以及形成内在血管样结构的能力。 体内 移植到免疫缺陷小鼠体内后的血管6-8尽管内皮集落形成细胞（ECFCs）已成功从健康成人的外周血、健康新生儿的脐带血（CB）以及多种人体动静脉血管壁中分离获得 6-9，CB 中 ECFCs 的频率最高7 表现出最强克隆增殖潜能并形成持久且有功能血管的细胞 体内8, 10-13尽管已有关于从成人外周血中分离获得内皮集落形成细胞（ECFC）的报道14, 15在此，我们描述了衍生、克隆、扩增和 体外 以及 体内 人脐带血中内皮集落形成细胞的表征
方案
试剂与溶液
EMG-2 培养基（Lonza，货号 cc-3162，包含 EBM-2 基础培养基和 EGM-2 SingleQuot 试剂盒添加剂及生长因子）
EBM-2（Lonza，货号 cc-3156），添加全套 SingleQuot 套装补充剂和生长因子（Lonza，货号 cc-4176）、10%（v/v）胎牛血清（FBS）以及 1%（v/v）青霉素（10,000 U/ml）/链霉素（10,000 μg/ml）/两性霉素（25 μg/ml）。4 °C 条件下可保存长达 1 个月。内皮集落形成细胞（ECFC）培养推荐使用的 EGM-2 体积为：24 孔板每孔 500 μl，6 孔板每孔 2 ml，25 cm2 培养瓶每瓶 5 ml，75 cm2 培养瓶每瓶 10 ml，除非实验方案中有其他说明。
I 型胶原溶液
将0.575 ml冰醋酸（17.4 N）加入495 ml无菌蒸馏水中稀释（终浓度为0.02 N）。使用0.22 μm真空过滤系统对稀释后的醋酸进行无菌过滤。向稀释的醋酸中加入25 mg大鼠尾胶原I型，使其终浓度为50 μg/ml。所加胶原的量需根据胶原储备液的浓度进行调整。4 °C下保存，最长可保存一个月。
I型胶原包被的组织培养表面的制备
在6孔组织培养板的每孔中加入1 ml胶原蛋白I溶液（24孔板每孔使用300 μl，25 cm2培养瓶使用3 ml，75 cm2培养瓶使用8 ml）。在37 °C条件下孵育1小时至过夜。吸除胶原蛋白I溶液，用PBS洗涤表面两次，每次洗涤量为：24孔板每孔500 μl，6孔板每孔2 ml，25 cm2培养瓶5 ml，75 cm2培养瓶10 ml。立即使用该处理后的培养板进行细胞培养。
FACS 染色缓冲液
含2% (v/v) 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）。4 °C下可保存长达2周。
A. 内皮集落形成细胞的出芽、克隆与扩增
- 采集脐带血（CB），使用肝素（每毫升血液含10 U肝素）或EDTA作为抗凝剂，于室温下立即运送至实验室，并在婴儿出生后2小时内立即处理样本，以分离单个核细胞（MNC）。
- 将15 ml脐带血分装至各50 ml锥形离心管中，每管加入20 ml PBS，并用移液器反复吹打混匀。用20 ml注射器吸取15 ml Ficoll-Paque，连接20G针头或混合套管。将混合套管尖端置于稀释血液管底部，小心地将15 ml Ficoll-Paque铺于液下。于室温下以740 × g离心30分钟，离心过程中不启用减速刹车。
- 用移液管小心吸取位于Ficoll-Paque与稀释血浆界面处的浑浊低密度MNC层。将MNC转移至含10 ml EGM-2培养基的50 ml锥形离心管中。于室温下以515 × g离心10分钟，启用高减速刹车设置。
- 小心吸除并弃去上清液。用EGM-2洗涤细胞沉淀两次（每次10分钟，515 × g），然后将MNC重悬于EGM-2中，浓度为1.25 × 107 个细胞/ml。通过每孔加入1 ml大鼠尾胶原I型（50 μg/ml）制备胶原I包被的6孔组织培养板，并于4℃孵育过夜。每孔加入4 ml上述MNC悬液，将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。第1天（24小时后），用移液器缓慢吸除用过的培养基（勿扰动贴壁较松的细胞），缓慢加入4 ml EGM-2，然后将培养板放回培养箱。第2天，用移液器缓慢吸除培养基（勿扰动贴壁较松的细胞），每孔加入4 ml EGM-2。此后每日更换培养基至第7天，之后每隔一天更换一次，直至内皮集落形成细胞（ECFC）克隆出现。通常克隆在第5至第14天之间出现7（图1）。
- 使用倒置显微镜（10倍放大）观察具有铺路石样形态的典型ECFC克隆，并用记号笔在培养板底部标记每个克隆的边界，以指示其位置。
- 第14天，用PBS洗涤这些原代克隆两次，使用克隆环及刚好足以覆盖克隆环内细胞的TrypLE express消化单个克隆。在最后一次PBS洗涤液吸除后，用无菌镊子将无菌凝胶包被的克隆环置于每个克隆周围，并用力压紧至培养板表面。每克隆环内加入2–3滴预温的TrypLE express，孵育3–5分钟，直至环内细胞开始脱落。在克隆环中央加入约250 μl EGM-2培养基，反复吹打形成单细胞悬液。将每个克隆环中的单细胞悬液分别转移至独立的微量离心管中。
- 用约250 μl EGM-2培养基对克隆环内区域洗涤2–3次，以收集所有残留细胞，并将每次洗涤液分别转移至对应的微量离心管中。在台式离心机上以高速（≤300 × g）离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1.5 ml新鲜EGM-2培养基中。将细胞悬液（包含来自各个克隆的全部细胞）从每根离心管分别转移至已预先包被500 μL大鼠尾胶原I型（50 μg/ml）的24孔组织培养板的一个孔中。
- 将培养板放入培养箱中进行扩增，每隔一天更换一次培养基。
- 当细胞融合度达到80–90%时，吸除用过的培养基，用PBS洗涤细胞两次，每孔加入500 μl TrypLE express培养基。将培养板放入培养箱中孵育3–5分钟，直至细胞开始变圆并脱落。每孔加入1 ml含10%定义型FBS的EGM-2培养基，通过吹打收集细胞，并转移至15 ml离心管中。用1 ml EGM-2培养基洗涤每孔以收集所有残留细胞，并将洗涤液分别转移至对应的15 ml离心管中。以300 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml新鲜EGM-2培养基（含10%定义型FBS）中。使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法对分样细胞进行活细胞计数。
- 将细胞以约5000个细胞/cm2的密度接种于预先包被胶原I的组织培养表面，在EGM-2培养基中培养，每隔一天更换一次培养基，待细胞融合度接近80–90%时再次传代扩增。
B. 体外 ECFCs 表型表征：内皮细胞表面抗原表达及单细胞克隆增殖潜能测定
- 检测内皮细胞表面抗原表达时，使用 TrypLE express 消化细胞，按照内皮集落形成细胞（ECFC）克隆与扩增所述的方法收集细胞。
- 将细胞重悬于 FACS 染色缓冲液中（10 × 106 个细胞/1 ml FACS 染色缓冲液），然后加入 FcR 封闭试剂（20 μl/10 × 106 个细胞），轻轻混匀，冰上孵育 10 分钟。
- 将上述细胞悬液每份 100 μl 分装至微量离心管中，用于检测各内皮表面抗原及同型对照。加入适量荧光标记的人源单克隆抗体，以识别内皮抗原（CD31、CD144、CD146 和 CD105）或造血抗原（CD45 和 CD14），避光冰上孵育 30 分钟。注意：每项检测无需使用 1 × 106 个细胞。作者通常每管使用 0.5 至 1 × 105 个细胞，以获得约 2 × 104 个分析事件。此外，应遵循制造商推荐的每项检测所需抗体用量。部分抗体可能需要进行滴定以确定最佳浓度。作者所进行的所有染色均为单色染色。
- 冰上孵育 30 分钟后，将各管在台式离心机上高速离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 FACS 缓冲液中。
- 使用流式细胞仪分析样品，确定每种抗原阳性或阴性染色的细胞百分比。ECFC 对 CD31、CD144 和 CD146 均呈均匀强阳性，而对 CD45 和 CD14 呈阴性，与相应的同型对照相比具有明显差异。
- 为进行单细胞克隆增殖潜能检测，使用 TrypLE express 消化早期传代（第 2–3 代）细胞，采用与 ECFC 克隆和扩增类似的方法收集细胞。
- 用表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒16感染这些细胞，并通过荧光细胞分选技术收集表达 EGFP 的细胞。注意：慢病毒操作属于生物危害操作，必须严格遵守所有生物安全防护规范。
- 按照 ECFC 扩增部分所述方法进行细胞培养。
- 制备 I 型胶原包被的 96 孔板：每孔加入 50 μl 大鼠尾部 I 型胶原（50 μg/ml），4 °C 过夜孵育。使用 TrypLE express 收集 EGFP+ ECFC，并将其重悬于 EGM-2 培养基中，终浓度约为 106 个细胞/ml。
- 使用 FACS Vantage（Becton Dickinson）或其他性能相当的分选仪，以较低流速（20 个细胞/秒）将单个 EGFP+ ECFC 分选至 96 孔板的每个孔中，并用 EGM-2 培养基补足每孔终体积至 200 μl。使用倒置荧光显微镜确认每孔仅含有一个细胞。或者，可根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）以及 Sytox 核染料染色进行单细胞分选，后续可通过菌落染色进行细胞计数与定量分析。
- 将 96 孔板培养两周，分别在第 5 天和第 10 天使用多通道移液器更换培养基（每孔加入 200 μl EGM-2）。培养至第 14 天时，每孔先用 100 μl PBS 洗涤，再加入 100 μl 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。对于不表达 EGFP 的 ECFC，在多聚甲醛固定后加入 Sytox 试剂（一种绿色荧光核染料），4 °C 避光孵育过夜。
- 使用荧光显微镜观察每孔，定量分析由单个细胞在 14 天培养后扩增出的内皮细胞数量。进行定量分析时，将含有 2 个或以上内皮细胞的孔记为阳性（表示具有增殖能力），并进一步通过荧光显微镜目视计数，统计每孔内皮细胞总数。
- 为展示实验结果，将每孔内皮细胞数量分为以下三类：2–50 个细胞定义为内皮细胞簇；51–2000 个细胞定义为低增殖潜能 ECFC（LPP-ECFC）；2001 个及以上细胞定义为高增殖潜能 ECFC（HPP-ECFC）。ECFC 在单细胞水平培养 14 天后，可表现出完整的克隆增殖潜能层级，生成内皮细胞簇、LPP 和 HPP。7
C. 体内 功能表征内皮集落形成细胞：用于评估内皮集落形成细胞成血管潜能的 体内 血管形成实验
- 通过计算制备1 ml凝胶（后续将一分为二以生成2个植入物）所需以下各组分凝胶材料的总体积（ml）（括号内为最终浓度）来制备细胞化凝胶植入物：FBS（10%）、EBM-2 10:1（调节终体积至1 ml）、碳酸氢钠（1.5 mg/ml）、NaOH（调节pH至7.4）、HEPES（25 mM）、纤连蛋白（fibronectin）100 μg/ml），以及胶原蛋白 I（1.5 mg/ml）。
- 在计算凝胶材料后，使用 TrypLE express 消化细胞，采用与 ECFC 克隆和扩增所述相似的方法收集细胞。取部分细胞悬液，用血细胞计数板和台盼蓝染色法测定活细胞数量。将 240 万个活细胞转移至 50 ml 圆锥形离心管中，在室温下以 515 × g 离心形成细胞沉淀。同时，在冰上将计算体积的 HEPES、碳酸氢钠、EBM-2 10:1、FBS、纤连蛋白和胶原蛋白按所列顺序加入预冷的 50 ml 圆锥形离心管中，配制凝胶基质溶液。充分混匀，并在保持溶液冰浴的条件下用 NaOH 调节 pH 至 7.4。
- 离心后弃去上清液，将沉淀重悬于 360 μl 温热 EGM-2 并加入 pH 调整后的 840 μl 将细胞缓慢加入凝胶基质溶液中，直至细胞在凝胶溶液中充分悬浮，最终凝胶植入物体积为1 ml。
- 将1 ml含细胞的凝胶悬液转移至12孔组织培养板的一个孔中，孵育20–30分钟，直至凝胶聚合。轻轻加入2 ml预热的EGM-2覆盖凝胶，过夜孵育。
- 植入前立即使用虹膜剪将过夜孵育的凝胶均分为两等份，并将凝胶块放回含有EGM-2培养基的同一培养孔中。
- 使用动物外科设施，通过给予异氟烷麻醉对动物（5-6周龄NOD/SCID小鼠）进行镇静。剃除腹部下部毛发，并用酒精棉片和聚维酮碘或其他消毒剂彻底清洁手术区域。然后根据IACUC及机构指南，用手术巾隔离该区域。
- 使用无菌的锐利虹膜剪在腹部下象限处做一个约5 mm的切口，暴露皮肤与腹肌之间的皮下间隙。从腹肌向真皮层进行钝性分离，形成一个宽15–20 mm、向上延伸至腹部上象限的皮下腔隙。在同一只小鼠腹部的另一侧重复类似操作，创建一个相似的开放腔隙。
- 在切口后方稍靠尾侧处提起真皮层，将一块凝胶的一半插入腹侧口袋的一侧，另一半插入腹侧口袋的另一侧。
- 凝胶植入后，使用带切割针的5-0聚丙烯缝线对每处切口进行2–3针缝合。正确标记笼卡，并根据机构和实验方案要求进行术后监测和镇痛处理，术后恢复期为14天，以允许植入凝胶中的细胞充分生长。 从头合成 血管系统。
- 最后，通常在植入后14天处死小鼠，收获凝胶植入物。
- 用酒精棉片擦拭腹部区域，并在原切口线尾侧剪开腹部皮肤。仔细分离并切除位于凝胶可能位置尾侧的一片皮肤瓣，以暴露植入物。围绕凝胶进行环形切割，完整切除植入物，随后将其置于锌固定液（BD Biosciences，按制造商推荐条件以获得最佳效果）中，在室温下固定1–2小时。
- 使用标准组织化学方案制备石蜡包埋凝胶并进行后续处理 5 μm 将凝胶中的组织切片置于玻片上，使用苏木精和伊红、抗人CD31或抗小鼠CD31进行染色，以显示凝胶内的血管结构。内皮集落形成细胞（ECFCs）通过从头血管生成作用形成人源化血管。 在植入免疫缺陷小鼠体内14天的细胞化凝胶植入物中 4,8,11.
D. 代表性结果
采用这种ECFC衍生技术，我们已观察到在第5天即可出现原代集落形成的外延生长（图1）。出迁的ECFC克隆呈现出典型的鹅卵石样形态，并可进一步形成 >经克隆挑取菌落后长期扩增可实现40次群体倍增。扩增后的菌落表达内皮细胞抗原，但不表达造血细胞抗原。图 2）。重要的是，它们在单细胞水平上表现出克隆增殖潜能的完整层级结构（图 3此外，当植入免疫缺陷小鼠体内时，ECFCs 可形成人源化血管，并由宿主红细胞灌注。4, 6, 8, 11 (图 4).
图1. 从脐带血中分离单个核细胞（MNCs）以及在培养的MNCs中内皮集落形成细胞（ECFCs）的生长。 在采用Ficoll-Paque密度梯度法分离脐带血细胞过程中，MNCs形成位于中间的白膜层。将白膜层分离后接种于经大鼠尾胶原I包被的培养板上培养MNCs，可在5至14天内观察到ECFC集落的生长。生长出的ECFC集落（以箭头指示）呈现铺路石样形态7。
图2. 代表性 体外 内皮细胞和造血细胞表面抗原表达的表型评估 脐血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）免疫表型分析显示，ECFCs表达内皮抗原CD31、CD34、CD144、CD146、Flt-1、Flk-1、Flt-4和Nrp2，但不表达造血抗原CD45、CD14、CD11b、cKit、CXCR4和AC133。7, 8.
图3. 典型代表 体外 CB来源ECFCs的克隆形成能力与增殖潜能的定量分析(A) 脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）表现出克隆性增殖潜能，其集落具有层级性，从小至2-50个细胞的细胞簇到大至集落的 >2001年。（B）脐带血来源的ECFCs在单细胞水平培养14天后获得的克隆层级显微图像（克隆经Sytox染色，Sytox为绿色荧光核染料，用于获取更高质量的图像）。比例尺代表 100μm7, 8.
图 4. 脐带血来源的 ECFCs 的代表性 体内 功能表征。A) 脐带血来源的 ECFCs 包含的细胞化凝胶植入物的 H&E 染色显示，在植入后 14 天，胶原-纤连蛋白凝胶中形成微血管（内含宿主红细胞）。B) 抗人 CD31 染色（棕色染色）进一步证实了这些血管的人源性。
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讨论
内皮祖细胞表型及功能特征的鉴定对于识别其特性至关重要 真正 能够进行克隆性连续传代培养并形成持久且具有功能性的可植入血管的ECFCs 体内人脐带血富含内皮集落形成细胞（ECFCs），这些循环细胞的浓度会随着年龄增长或疾病而下降10近期研究表明，内皮集落形成细胞（ECFC）在血管损伤、心肌梗死或视网膜病变等情况下，可能在血管修复或再生过程中发挥重要作用。17-19.
在此，我们描述了简单且高效的衍生、克隆、扩增和 体外 以及 体内 从人脐带血中表征内皮集落形成细胞（ECFCs）。这些方法使研究人员能够识别并分离出具有克隆增殖潜能的真正内皮祖细胞（EPCs），源自脐带血 体内 血管形成能力
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致谢
Yoder 博士是 EndGenitor Technologies, Inc. 的顾问，并担任 Rimedion Technologies, Inc. 董事会成员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肝素钠注射液，USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Paque | Amersham | 17-1440-03 | |
| 混合套管 | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| 限定型胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO，Life Technologies 公司 | 12605 | |
| 大鼠 I 型胶原蛋白 | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FCR 封闭剂 | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| 人 CD31，FITC 标记 | BD Biosciences | 555445 | |
| 人 CD45，FITC 标记 | BD Biosciences | 555482 | |
| 人 CD14，FITC 标记 | BD Biosciences | 555397 | |
| 人 CD144，PE 标记 | eBioscience | 12-1449-80 | |
| 人 CD146，PE 标记 | BD Biosciences | 550315 | |
| 人 CD105，PE 标记 | Invitrogen | MHCD10504 | |
| 小鼠 IgG1,k 抗体，FITC 标记 | BD Biosciences | 555748 | |
| 小鼠 IgG1,k 抗体，PE 标记 | BD Biosciences | 559320 | |
| 小鼠 IgG2a,k 抗体，FITC 标记 | BD Biosciences | 555573 | |
| 抗人 CD31 | Dako | 克隆号 JC70/A | |
| 抗小鼠 CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm 真空过滤系统 | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 冰醋酸，17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | 15240-062 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC 锌固定液 | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox Green 染料 | Invitrogen | S33025 | |
| 克隆环，无菌 | Fisher Scientific | 07-907-10 |
参考文献
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