采集感染蜱虫的血淋巴、唾液腺及唾液对于研究蜱传病原体如何致病具有重要意义。本实验方案中，我们演示了如何从吸血的肩突硬蜱（Ixodes scapularis）若虫中采集血淋巴和唾液腺，并演示了从雌性肩突硬蜱（I. scapularis）成虫中采集唾液的方法。
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本文内容
摘要
摘要
蜱虫在全球范围内均有分布，可引发多种蜱传疾病，危害人类健康。蜱是多种病原体的传播媒介，这些病原体可导致莱姆病和蜱传回归热（Borrelia spp.）、落基山斑疹热（Rickettsia rickettsii）、埃立克体病（Ehrlichia chaffeensis 和 E. equi）、无形体病（Anaplasma phagocytophilum）、脑炎（蜱传脑炎病毒）、巴贝西虫病（Babesia spp.）、科罗拉多蜱热（Coltivirus）以及土拉菌病（Francisella tularensis）1-8。这些病原体要成功进入宿主，需通过差异性调控基因表达、与蜱体内的蛋白质相互作用，并在蜱体内迁移3,9-13。例如，引起莱姆病的病原体Borrelia burgdorferi会通过差异性基因表达，适应蜱虫自然循环中的“饱食”与“饥饿”两个阶段14,15。此外，当硬蜱属（Ixodes）蜱虫吸食血液时，Borrelia在中肠内复制，并从中肠迁移至血腔，随后到达唾液腺，最终随唾液排出而传播至宿主9,16-19。
蜱虫吸血时，宿主通常会产生强烈的止血反应和先天免疫反应11,13,20-22。尽管存在这些宿主防御反应，I. scapularis仍可持续吸血数天，因为蜱虫唾液中含有具有免疫调节作用的蛋白、溶菌因子、抗凝剂和纤溶酶，有助于蜱虫取食3,11,20,21,23。蜱虫唾液或唾液腺提取物（SGE）所具有的免疫调节活性，可促进多种蜱传病原体的传播、增殖和扩散3,20,24-27。为了进一步了解蜱传感染因子致病的机制，必须对正在吸血的蜱虫进行解剖，并收集其唾液。本视频方案展示了在将幼虫接种至小鼠后48小时和72小时，对正在吸血的I. scapularis若虫进行解剖以收集血淋巴及分离唾液腺的技术。我们还演示了从成年雌性I. scapularis蜱虫中收集唾液的方法。
方案
1. 用于制片的血淋巴采集
（视频 1）
- 轻柔地从动物身上取下正在吸血的蜱虫，放入3%外用过氧化氢中5分钟，再转入70%乙醇中10分钟，以进行表面消毒。
- 使用防脱笔在硅烷涂层载玻片上画一个圆圈，并将蜱虫置于该圆圈内。
- 硅烷涂层载玻片有助于血淋巴更好地附着于载玻片表面。
- 在解剖显微镜下观察蜱虫（物镜1X，目镜10X，总放大倍数3.5X）。
- 用镊子轻轻按压蜱虫背部，使其足部展开并固定蜱虫。
注意：固定蜱虫时不要用力过猛，以免破坏中肠或刺破蜱虫，导致血淋巴污染。
- 使用精细的一次性解剖刀在远端关节处截取蜱虫的一条或多条腿。若仅通过血淋巴检测感染性，截取一条腿即可。若需在载玻片上收集血淋巴，可截取多条腿。
注意：不要将腿部切得过于靠近身体，因为这可能导致血淋巴被中肠污染。
- 切断蜱虫的足部后，继续轻轻按压其背侧，使血淋巴从足部切口渗出至载玻片上。轻轻移动蜱虫，将血淋巴在载玻片上均匀涂开。
2....
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讨论
采集蜱虫的血淋巴、唾液腺及唾液，对于研究蜱传病原体在蜱虫及其宿主中的传播、流行、扩散、增殖和持续存在具有重要意义6,11-13,20,23,29。蜱虫解剖方法有多种30,31，但在采集唾液腺时，关键是要正确解剖蜱虫，以避免唾液腺破裂或遗留在蜱虫残体中。一旦将唾液腺从蜱虫体内取出，需多次清洗以去除中肠污染，随后可将其固定于载玻片上进行染色，或在磷酸盐缓冲液（PBS）中研磨以获得唾液腺提取物（SGE）。与唾液相比，SGE更易于收集，且具有与唾液相似的特性，因此可作为唾液的替代物。然而，SGE中含有来源于唾液腺细胞的额外蛋白质，而这些蛋白质并不存在于蜱虫唾液中。SGE中额外蛋白质的存在可能对某些研究有利，也可能不利，具体取决于实验目的，但研究人员在使用SGE时必须意识到这一点。SGE的一个优势在于，采集唾液腺过程中无需使用匹罗卡品。匹罗卡品是一种毒蕈碱型胆碱能激动剂，可促进唾液分泌，但在唾液采集过程中已被证明对B. burgdorferi具有细胞毒性作用32,33。多巴胺是另一种促唾液分泌激动剂，但与具有持续作用的匹罗卡品相比，多巴胺会迅速被血淋巴及其他蜱虫体.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者谨此感谢虫媒疾病防治司动物资源科，特别是Andrea Peterson、Lisa Massoudi、Verna O'Brien和John Liddell，感谢他们对小鼠和兔子的饲养与维护。我们还要感谢Amy Ullmann、Theresa Russell和Barbara J. Johnson为本手稿作出的贡献。最后，我们谨向美国疾病控制与预防中心（CDC）传播沟通副主管办公室的Alissa Eckert致谢，感谢她制作了本手稿的图示插图；同时感谢Judy Lavelle，感谢她负责本手稿拍摄过程中所有相关法律事务的协调工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 过氧化氢 | Fisher Scientific | H312-500 | |
| 乙醇 | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| 杜蒙特精细镊子（3C型） | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| 硅烷处理载玻片 | Bioworld | 42763007-1 | |
| 疏水笔 | Bioworld | 21750008-1 | |
| 超冻 Plus 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| 匹鲁卡品 | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 一次性手术刀 | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| 无毒油泥 | Fisher Scientific | S17307 | |
| 毛细管 | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
参考文献
- Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
- Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
- Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H.
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重印与许可
