采集感染蜱虫的血淋巴、唾液腺及唾液对于研究蜱传病原体如何致病具有重要意义。本实验方案中，我们演示了如何从吸血的肩突硬蜱（Ixodes scapularis）若虫中采集血淋巴和唾液腺，并演示了从雌性肩突硬蜱（I. scapularis）成虫中采集唾液的方法。
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摘要
摘要
蜱虫在全球范围内均有分布，可引发多种蜱传疾病，危害人类健康。蜱是多种病原体的传播媒介，这些病原体可导致莱姆病和蜱传回归热（Borrelia spp.）、落基山斑疹热（Rickettsia rickettsii）、埃立克体病（Ehrlichia chaffeensis 和 E. equi）、无形体病（Anaplasma phagocytophilum）、脑炎（蜱传脑炎病毒）、巴贝西虫病（Babesia spp.）、科罗拉多蜱热（Coltivirus）以及土拉菌病（Francisella tularensis）1-8。这些病原体要成功进入宿主，需通过差异性调控基因表达、与蜱体内的蛋白质相互作用，并在蜱体内迁移3,9-13。例如，引起莱姆病的病原体Borrelia burgdorferi会通过差异性基因表达，适应蜱虫自然循环中的“饱食”与“饥饿”两个阶段14,15。此外，当硬蜱属（Ixodes）蜱虫吸食血液时，Borrelia在中肠内复制，并从中肠迁移至血腔，随后到达唾液腺，最终随唾液排出而传播至宿主9,16-19。
蜱虫吸血时，宿主通常会产生强烈的止血反应和先天免疫反应11,13,20-22。尽管存在这些宿主防御反应，I. scapularis仍可持续吸血数天，因为蜱虫唾液中含有具有免疫调节作用的蛋白、溶菌因子、抗凝剂和纤溶酶，有助于蜱虫取食3,11,20,21,23。蜱虫唾液或唾液腺提取物（SGE）所具有的免疫调节活性，可促进多种蜱传病原体的传播、增殖和扩散3,20,24-27。为了进一步了解蜱传感染因子致病的机制，必须对正在吸血的蜱虫进行解剖，并收集其唾液。本视频方案展示了在将幼虫接种至小鼠后48小时和72小时，对正在吸血的I. scapularis若虫进行解剖以收集血淋巴及分离唾液腺的技术。我们还演示了从成年雌性I. scapularis蜱虫中收集唾液的方法。
方案
1. 用于制片的血淋巴采集
（视频 1）
- 轻柔地从动物身上取下正在吸血的蜱虫，放入3%外用过氧化氢中5分钟，再转入70%乙醇中10分钟，以进行表面消毒。
- 使用防脱笔在硅烷涂层载玻片上画一个圆圈，并将蜱虫置于该圆圈内。
- 硅烷涂层载玻片有助于血淋巴更好地附着于载玻片表面。
- 在解剖显微镜下观察蜱虫（物镜1X，目镜10X，总放大倍数3.5X）。
- 用镊子轻轻按压蜱虫背部，使其足部展开并固定蜱虫。
注意：固定蜱虫时不要用力过猛，以免破坏中肠或刺破蜱虫，导致血淋巴污染。
- 使用精细的一次性解剖刀在远端关节处截取蜱虫的一条或多条腿。若仅通过血淋巴检测感染性，截取一条腿即可。若需在载玻片上收集血淋巴，可截取多条腿。
注意：不要将腿部切得过于靠近身体，因为这可能导致血淋巴被中肠污染。
- 切断蜱虫的足部后，继续轻轻按压其背侧，使血淋巴从足部切口渗出至载玻片上。轻轻移动蜱虫，将血淋巴在载玻片上均匀涂开。
2. 唾液腺切除
（影片 2 和 3）
- 在载玻片上滴加数滴 25 μl 的磷酸盐缓冲液（PBS），并将一只蜱虫放入其中一滴 PBS 中。
- 在解剖显微镜下观察蜱虫（物镜 1X，目镜 10X，总放大倍数 3.5X）。
- 使用尖头镊子夹住蜱虫的基节（口器部分）或虫体后部，以固定蜱虫。
- 将尖头镊子插入蜱虫后部，切开蜱虫的背侧以暴露其内部器官。如需要，可在此时取出中肠，并将其转移至载玻片上新的 PBS 液滴中，或转移至含有 PBS 的微量离心管中。
- 在蜱虫腿部两侧寻找成对的唾液腺（呈葡萄串状的团块）。若在蜱虫组织碎片中无法看清唾液腺，可将仍含有唾液腺的主要虫体部分移至新的 PBS 液滴中，以减少干扰并防止唾液腺丢失。
注意： 在吸血初期，唾液腺较难定位，因为其发育程度不如吸血后期充分。
- 用精细尖头镊子将蜱虫的唾液腺取出，并置于新鲜的 PBS 液滴中。
- 用精细尖头镊子将唾液腺转移至另一份干净的 25 μl PBS 液滴中，重复此洗涤步骤 3–4 次，以去除所有外部微生物及蜱虫碎片。
注意：轻柔地清洗唾液腺簇，以减少单个唾液腺的丢失和损伤。
- 将腺体放入干净的 PBS 液滴中，置于经硅烷处理的载玻片上，或放入含有 PBS 的微量离心管中。
3. 唾液采集
（视频 4）
- 在雌性成年蜱即将完全吸饱并自然脱落前，大约在附着后5-7天，使用尖头镊子轻轻将其从兔或其他宿主身上取下。
- 用透明胶带将接近吸饱的蜱固定在载玻片的一端。胶带应贴在蜱背侧约四分之三处，朝向头部方向，使蜱的基节囊（口器部分）保持暴露。
- 在胶带与蜱背面前缘相接处，用移液器加入5 μl的5%匹鲁卡品溶液（溶于甲醇）。让胶带将匹鲁卡品溶液沿蜱背侧向上吸渗，注意避免溶液接触蜱的基节囊。
- 在距离蜱口器约一英寸处的载玻片上，放置一块无毒的塑型黏土。
- 使用尖头镊子将拉制毛细管28的尖端折断至所需直径。
- 在解剖显微镜下观察蜱的基节囊。
- 轻轻将蜱的须下板插入拉制毛细管中，使大颚须位于毛细管外侧。
- 将毛细管的另一端压入塑型黏土中，以固定毛细管位置。
- 将固定好的正在唾液分泌的蜱置于一个黑暗且高湿度的密闭容器内（例如，内壁衬有湿润纸巾的带盖泡沫塑料盒）。将载玻片倾斜放置，使须下板朝向容器底部，利用重力促进唾液收集。
- 将容器置于室温环境中。
- 在开始的1小时内密切监测唾液分泌情况，并使用巴斯德移液器胶头将生成的唾液从毛细管中吹出收集。1小时后，每隔1小时检查一次唾液积聚情况，持续至少4小时，并继续收集新分泌的唾液。
注意：一旦收集到足量唾液用于当前研究，即可停止唾液采集。
- 如果蜱虫未分泌唾液或需要更多唾液，可偶尔使用毛细管轻轻按摩其口下板以诱导唾液分泌。
- 向唾液中加入0.1倍体积的蛋白酶抑制剂混合物，混匀后于-80°C保存，直至使用。
4. 代表性结果
视频1展示了如何持握一只部分吸血的I. scapularis若虫，并截除其腿部以将血淋巴收集到显微镜载玻片上。一旦截除腿部，便会分泌出透明液体（图1A和1B）。若中肠破裂，则血淋巴从被截除的腿部流出时呈现浑浊状（图1C和1D）。
在若虫吸血48或72小时后提取唾液腺的操作过程见视频2和视频3。蜱虫被刺破后通常会释放大量碎片（包括气管、马氏管、血液、结缔组织等），为防止唾液腺丢失或受损，应将蜱虫转移至新鲜的PBS液滴中。图2A和2B显示了若虫被剖开后唾液腺的位置，图2C显示了置于PBS液滴中的已分离唾液腺簇。
I. scapularis 成年雌性蜱唾液采集装置的设置如视频4和图3所示。视频5中可观察到蜱在毛细管中分泌唾液的过程。该唾液采集方法采用匹鲁卡品刺激唾液分泌，每只成年雌性蜱可获得超过20 μl的唾液。
图 1。 I. scapularis 若虫的标注结构。
视频 1. Ixodes scapularis 血淋巴采集。 点击此处观看视频。
图 2. 若虫腿部渗出的未污染（A 和 B）与污染（C 和 D）的血淋巴。
视频 2. 从吸血 48 小时的I. scapularis若虫中提取唾液腺。点击此处观看视频。
视频 3. 从一只吸血 72 小时的I. scapularis若虫中提取唾液腺。点击此处观看视频。
图3。 Ixodes scapularis 若虫唾液腺。（A & B）吸血72小时后的若虫唾液腺示例，提取前状态。（C）已分离的唾液腺组织簇。
视频 4. 从一只成年雌性I. scapularis蜱虫收集唾液的实验装置。点击此处观看视频。
图 4。 从成年雌性I. scapularis蜱虫收集唾液。（A & B）蜱虫固定在载玻片上，其口下片插入毛细管的拉细端，毛细管未拉细的一端由橡皮泥固定。（C & D）含有正在分泌唾液的成年雌性I. scapularis蜱虫的湿润培养室。
视频 5. Ixodes scapularis 雌性蜱虫向毛细管内唾液分泌过程。点击此处观看视频。
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讨论
采集蜱虫的血淋巴、唾液腺及唾液，对于研究蜱传病原体在蜱虫及其宿主中的传播、流行、扩散、增殖和持续存在具有重要意义6,11-13,20,23,29。蜱虫解剖方法有多种30,31，但在采集唾液腺时，关键是要正确解剖蜱虫，以避免唾液腺破裂或遗留在蜱虫残体中。一旦将唾液腺从蜱虫体内取出，需多次清洗以去除中肠污染，随后可将其固定于载玻片上进行染色，或在磷酸盐缓冲液（PBS）中研磨以获得唾液腺提取物（SGE）。与唾液相比，SGE更易于收集，且具有与唾液相似的特性，因此可作为唾液的替代物。然而，SGE中含有来源于唾液腺细胞的额外蛋白质，而这些蛋白质并不存在于蜱虫唾液中。SGE中额外蛋白质的存在可能对某些研究有利，也可能不利，具体取决于实验目的，但研究人员在使用SGE时必须意识到这一点。SGE的一个优势在于，采集唾液腺过程中无需使用匹罗卡品。匹罗卡品是一种毒蕈碱型胆碱能激动剂，可促进唾液分泌，但在唾液采集过程中已被证明对B. burgdorferi具有细胞毒性作用32,33。多巴胺是另一种促唾液分泌激动剂，但与具有持续作用的匹罗卡品相比，多巴胺会迅速被血淋巴及其他蜱虫体...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者谨此感谢虫媒疾病防治司动物资源科，特别是Andrea Peterson、Lisa Massoudi、Verna O'Brien和John Liddell，感谢他们对小鼠和兔子的饲养与维护。我们还要感谢Amy Ullmann、Theresa Russell和Barbara J. Johnson为本手稿作出的贡献。最后，我们谨向美国疾病控制与预防中心（CDC）传播沟通副主管办公室的Alissa Eckert致谢，感谢她制作了本手稿的图示插图；同时感谢Judy Lavelle，感谢她负责本手稿拍摄过程中所有相关法律事务的协调工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 过氧化氢 | Fisher Scientific | H312-500 | |
| 乙醇 | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| 杜蒙特精细镊子（3C型） | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| 硅烷处理载玻片 | Bioworld | 42763007-1 | |
| 疏水笔 | Bioworld | 21750008-1 | |
| 超冻 Plus 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| 匹鲁卡品 | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 一次性手术刀 | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| 无毒油泥 | Fisher Scientific | S17307 | |
| 毛细管 | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
参考文献
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