禾谷镰刀菌的有性发育与子囊孢子释放

摘要

有性杂交及重组子代的分离是研究丝状真菌Fusarium graminearum的重要研究工具。本文介绍了成功实施这些操作所需的技术。

摘要

Fusarium graminearum 已成为研究丝状真菌发育和致病性的模式系统。F. graminearum 在胡萝卜琼脂培养基上最易产生称为子囊壳的果实结构。子囊壳包含多种在子囊壳发育特定阶段形成的组织类型，按出现顺序包括：子囊壳原基（产生子囊性菌丝）、外壁、拟侧丝（在子囊形成前占据子囊壳中心的无性菌丝）、子囊以及子囊内的子囊孢子¹⁴。这些组织的发育阶段间隔约24小时，构成了性发育过程中转录组学研究的基础^12,8。有关发育过程的更详细描述（包括各阶段的照片），请参见 Hallen et al. (2007)。本文介绍了用于生成和收获同步发育的子囊壳菌垫的方法，以进行基因调控、发育及生理过程的时间序列研究。尽管本方法专为 F. graminearum 设计，但只要能够在培养条件下诱导产果且发育具有一定同步性，这些技术也可适用于其他多种真菌。我们最近已将该方案改进用于研究 F. verticillioides 的有性发育。尽管该物种无法诱导形成同步发育的子囊壳菌垫，必须手工挑选单个子囊壳，但该方法在发育研究中仍表现出良好效果（Sikhakolli 和 Trail，未发表）。

真菌子实体最重要的功能是孢子的传播。在许多子囊菌门（产生子囊的真菌）物种中，由于子囊内膨压的产生，孢子会从子囊中弹射而出，从而将孢子（以及子囊内液）通过子囊顶端的小孔喷射出去^2,7。我们对强制性子囊孢子释放的研究已发展出一种“孢子释放测定法”，用于筛选该过程中发生的突变。本文将详细介绍该测定方法的具体步骤。

F. graminearum 是同宗配合的，因此在没有相容性配偶的情况下也能形成子实体。同宗配合的优点在于，无需杂交即可获得特定性状的纯合子后代，这一特性促进了对该物种有性发育的研究^14,7。然而，目前已构建出异宗配合的菌株，可用于杂交实验^5,9。此外，也可通过同宗配合菌株之间的杂交，获得单个菌株中多个基因的突变体¹。该方法通过在同一培养皿中共同接种两种菌株来实现。在菌株相遇的交界区域，大多数子囊壳将为重组产物（前提是任一亲本菌株的突变不会抑制异交）。随着子囊壳的成熟，它们会大量渗出子囊孢子，而非通过强力弹射释放。所产生的孢子渗出物（称为孢子丝）聚集在子囊壳顶端，可轻易采集以分离单个孢子。本文介绍了一种用于识别重组子囊壳及回收重组后代的实验方案。

方案

1. 子囊壳的制备

1. 在胡萝卜琼脂上进行中心接种¹⁰ 在直径为6.0 cm的培养皿中，使用一种可育菌株 F. graminearum （推荐 PH-1）。
2. 将接种后的培养皿置于室温（18–24 °C）并培养至菌丝体到达培养皿外缘（3-5天）。商用家用荧光灯可有效促进子实体形成及孢子释放。
3. 用无菌牙签轻轻去除气生菌丝。
4. 用无菌玻璃刮铲或无菌玻璃棒的圆头，将 1.0 ml 2.5 % 吐温 60 水溶液均匀涂布于表面。
5. 将培养板放回光照条件下。切勿在培养板上加封 Parafilm。
6. 24小时后，培养皿表面应呈现光泽外观。若菌丝再次出现，需刮除表面并重新涂抹Tween-60溶液。
7. 在接下来的一周内观察子囊壳的发育情况。可通过轻轻刮取琼脂表面收集子囊壳发育的中间阶段材料，并进行速冻，用于RNA提取。图1).
8. 到第7天时，成熟的孢子将聚集在培养皿盖上。最初仅能在解剖显微镜下观察到，但到第9天时，其密度已足够高，可肉眼可见。

2. 子囊孢子释放实验

1. 在施加Tween溶液后的第6天，使用木制打孔器从琼脂中切下直径1 cm的圆形区域。或者，也可使用解剖刀切除大小相似的片段。将该圆形琼脂块切成两半，每半放置于一块玻璃显微镜载片上。
2. 调整琼脂块的位置，使其带有子实体的表面垂直于载片表面，并确保孢子沿载片长度方向发射。
3. 将载片置于湿润 chamber 中，并在光照条件下过夜。次日早晨，孢子将积聚在载片上，肉眼可见（图2）。
4. 如有需要，可用清水将积聚的孢子冲洗下来并进行定量。
5. 可通过在实验组装过程中将潜在的子囊孢子释放抑制剂添加至琼脂块的背面，以检测其抑制效果。已有研究利用该技术检测过一些可减少孢子释放的离子通道抑制剂¹⁵。

3. 重组子代的产生

1. 通过将两种菌株接种于胡萝卜琼脂上开始杂交 F. graminearum （一个 Nit+ 和一个 nit-），将接种点置于培养皿的相对两侧。
2. 菌丝长满表面后，刮去气生部分，并按上述方法加入Tween-60溶液。用记号笔在培养皿侧面标记菌丝交界处的位置。
3. 将培养物放回光照条件下培养，直至子囊壳发育，并在两个培养物交界处的子囊壳中开始形成孢子丝。
4. 在解剖显微镜下，观察两种菌落交界处的子囊壳。使用经灭菌并蘸取无菌水的昆虫针，用针尖轻轻触碰交界处的孢子丝。针尖上的水分应能使孢子丝黏附于针上。
5. 用带有触手的针尖在其中冲洗 200 μl 将无菌水加入Eppendorf管中以冲洗孢子。
6. 灼烧针头，再次润湿，然后挑取另一根刚毛。共挑取10至15根刚毛，分别放入盛有水的独立试管中。
7. 短暂涡旋振荡含有悬浮触手的离心管。
8. 移除 60 μl 用移液器吸取孢子悬液并接种于MMTS培养基上¹ 在9 cm的培养皿中，用无菌涂布棒涂布均匀。剩余的孢子悬液可保存于 4 °C 最长可维持一周，必要时可重新接种。
9. 在室温下孵育（无需避光）3-5天，直至出现非常微小的菌落（图3）。菌落中会出现两种表型。nit- 菌落的菌丝比 Nit+ 菌落稀疏。来自重组子囊果的孢子丝中，两种菌落表型大致以相等比例出现。丢弃仅含单一表型菌落的培养皿。需注意，有时由于其他因子的分离，可能出现两种以上的表型。
10. 将菌落转移至V8或胡萝卜琼脂上保存。在察氏培养基（Czapek's Dox Agar）上检测菌落（nit- 菌株不能在察氏培养基上生长），并在含氯酸盐的PDA培养基（0.5 M氯酸钾）上检测（Nit+ 菌株不能在含氯酸盐的PDA上生长），以确认正确的表型。观察这些菌落是否具有目标性状。

4. 代表性结果

产生子囊壳

目标是获得布满子囊壳且无明显菌丝或孢子的培养表面。培养物表面应类似于黑色天鹅绒（图1）。在添加吐温后24小时，琼脂表面应略带光泽。如果菌丝重新出现，则可能是因为平板刮除不充分，未能诱导子囊壳发育。

子囊孢子释放

在实验中始终使用野生型菌株的多个琼脂块作为对照。如果这些对照未发生弹射，则说明你的子囊果可能过于年轻或过于老化。如果子囊果过于老化，菌落表面会出现大量菌丝，使菌落呈现灰白色。若情况并非如此，则可能是子囊果过于年轻，此时应等待24小时后再次尝试该实验。偶尔会出现菌落弹射效果不佳的情况，此时实验需要重复进行。务必确保在合适的光照条件下进行实验。

重组子代

在两种菌株交界处产生的子囊果中，重组子囊果应占大多数。我们通常从一次杂交中处理10个孢子丝，其中至少应有4-6个为重组型。极少数情况下，某种突变会阻碍菌株交配。如果其中一个亲本具有异常的生长表型，则在MMTS培养基上的菌落中可能出现两种以上的表型。

图 1. 胡萝卜琼脂上子囊壳发育的各个阶段。左侧为添加吐温后 72 小时，注意红色色素以及作为表面黑色颗粒可见的极幼小子囊壳。右侧为 144 小时时，已形成成熟子囊壳。注意两种培养物表面菌丝均几乎完全缺失。

图 2. 子囊孢子弹射实验。橙色的胡萝卜琼脂块被放置成一定方向，使成熟子囊壳表面强力弹射出的孢子能够聚集在载玻片表面。孢子聚集时间为 15 小时。

图 3. Nit+ 与 nit- 菌落在选择性 MMTS 培养基上生长差异。nit- 菌落（箭头指示）较小，Nit+ 菌落（箭头指示）生长旺盛。照片拍摄于培养 7 天后。

讨论

F. graminearum 由于具有高质量注释的基因组（mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/；⁴）以及基于 Affymetrix 的基因芯片技术⁶，特别适用于子实体发育的研究。这有助于鉴定在子囊孢子释放过程中起重要作用的基因^7,11,3。本文所介绍的方法可使研究人员针对 F. graminearum 子实体遗传分析中特定的一组发育阶段和功能进行深入研究。这些方法也可轻松适用于其他可在培养条件下诱导产生成熟子实体的相关真菌，并可作为多种不同类型真菌子实体发育研究的标准参考。

在孢子微小且难以观察的物种中，评估孢子弹射表型的能力可能较为困难，例如 F. graminearum。将孢子收集在洁净的载玻片上，既便于进行直观评估，也便于定量分析，因为孢子可从载玻片上冲洗下来并进行定量。某些真菌物种会产生包裹其孢子的黏液，这些孢子无法被冲洗下来，而必须在显微镜下直接计数，因为它们会保留在载玻片上。我们发现 Sclerotinia sclerotiorum 就属于这种情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
禾谷镰刀菌菌株 PH-1	真菌遗传资源中心	FGSC 9075
吐温 60	Sigma-Aldrich	P1629
Czapek’s Dox 琼脂	Difco 实验室	233810
氯酸钾	Sigma-Aldrich	255572