Schistosoma mansoni 虫卵是辅助性 T 细胞 2 型（Th2）免疫反应的强效刺激物，这类免疫反应是寄生虫感染、哮喘及过敏性炎症的特征。本方案利用 S. mansoni 虫卵注射，在肺部诱导由 CD4+ Th2 细胞因子介导的炎症反应，其特征为围绕虫卵形成的肺肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多以及巨噬细胞的替代性活化。
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摘要
摘要
Schistosoma 寄生虫是一种血吸虫，全球约有 2亿人感染1。在慢性 Schistosoma 感染中，严重的病理变化（包括肝纤维化和脾肿大）是由宿主对寄生虫卵的免疫反应引起的，而非寄生虫本身所致2。寄生虫卵可诱导产生 Th2 型免疫反应，其特征是分泌 IL-4、IL-5 和 IL-13，巨噬细胞发生替代性活化，并募集嗜酸性粒细胞。本文中，我们描述了注射 Schistosoma mansoni 虫卵的方法，作为一种研究模型，用于检测肺组织及引流淋巴结中针对寄生虫的 Th2 细胞因子反应、虫卵周围肺部肉芽肿的形成以及气道炎症。
经腹腔致敏和静脉激发后 S. mansoni 虫卵通过肺动脉被运送至肺部，并在肺实质内被由淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和替代性活化的巨噬细胞组成的肉芽肿所截留 3-6伴随肉芽肿形成，可观察到支气管肺泡腔内的炎症、引流淋巴结的肿大以及CD4 T细胞的活化。本文详细阐述了分离 曼氏血吸虫 来自感染肝脏的虫卵（改良自 7），使小鼠致敏并进行激发，随后回收器官（支气管肺泡灌洗液（BAL）、肺组织及引流淋巴结）用于分析。我们还提供了代表性的组织学和免疫学数据，并提出了进一步免疫学分析的建议。
总体而言，该方法提供了一种in vivo模型，用于研究肺部由蠕虫诱导的免疫反应，广泛适用于包括蠕虫感染、纤维化疾病、过敏性炎症和哮喘在内的 Th2 型炎症性疾病的研究。该模型在研究肺部 2 型炎症方面的优势包括：可在肺组织及引流淋巴结中稳定地诱导强烈的 Th2 炎症反应，可通过组织学方法简便地评估虫卵周围肉芽肿的炎症程度，以及虫卵具备长期保存的潜力。
方案
1. 纯化 曼氏血吸虫 卵
- 用尾蚴感染Swiss-Webster小鼠，尾蚴是血吸虫（Schistosoma）生命周期中的感染阶段8。或者，可从美国国家过敏和传染病研究所血吸虫资源中心（http://www.schisto-resource.org/）获取已感染血吸虫的小鼠。感染后饲养小鼠6–7周，此时肝脏中已有虫卵，可按以下方法回收（见图1）。
- 用CO2处死小鼠，并用70%乙醇润湿体表。将小鼠仰卧放置。使用钝头镊子和剪刀剪除皮肤及下方的腹膜。取出位于肋骨下方和膈肌下方的肝脏。
- 将肝脏精细剪碎，每份肝脏加入20 mL消化液混合物，该混合物由胶原酶/分散酶（0.5 mg/mL）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）溶于PBS中配制而成。将混合物置于50 mL Falcon管中，在37 °C摇床中孵育过夜。
- 在400 × g、3分钟、20 °C条件下离心混合物。轻轻倒去上清液，并用PBS充满管内。再次离心并重复PBS洗涤。最后一次离心后，将沉淀重悬于25 mL PBS中。
- 将重悬的沉淀通过标准金属厨房滤网过滤（使用50 mL注射器活塞将肝组织压入玻璃烧杯），随后将混合物通过细筛过滤（使用10 mL注射器将混合物推过细筛进入第二个玻璃烧杯）。
- 将过滤后的混合物放入50 mL Falcon管中。在400 × g、5分钟、20 °C条件下离心。小心倒出上清液，避免丢失沉淀。将沉淀重悬于3 mL PBS中。
- 轻柔地将混合物叠加至20% Percoll梯度液上，梯度液总体积为40 mL，由8 mL Percoll和32 mL 0.25 M蔗糖（分子量=342.3，即8.56 g蔗糖/100 mL H2O）组成。
- 在800 × g、10分钟、20 °C条件下离心。用移液器吸除并弃去上层胶状肝细胞层。用移液器取出底部的虫卵沉淀，转移至15 mL Falcon管中。
- 使用离心条件：30 × g、3分钟、20 °C，用10 mL PBS/1 mM EDTA/1 mM EGTA洗涤沉淀3次。最后将沉淀重悬于500 μL PBS中。
- 将混合物叠加至新的25% Percoll梯度液（2.5 mL Percoll和7.5 mL 0.25 M蔗糖）上，总体积10 mL，离心条件为：800 × g、10分钟、20 °C。
- 使用离心条件：30 × g、3分钟、20 °C，用10 mL PBS洗涤3次。
- 在最后一次10 mL洗涤中，取出100 μL用于计数虫卵。虫卵沉降迅速，因此在取样前必须充分混匀Falcon管。将100 μL样品与900 μL PBS稀释。取100 μL稀释液（即1:10稀释）滴于显微镜载玻片上，使用解剖显微镜进行计数。应使用宽口移液器吸头。
- 将虫卵以50,000个/mL的浓度重悬于PBS中。虫卵可在-80 °C保存数月，并可解冻使用一至两次。使用前应在显微镜下检查，确保虫卵仍保持完整（见图1）。
2. 采用S. mansoni虫卵进行腹腔致敏：第0天
- 在5 mL旋盖管中，用100 μL PBS配制5,000个卵。注射时，应准备比所需数量多50%的卵。
- 使用23号3/4英寸针头和1 mL注射器，每只小鼠注射100 μL卵悬液。卵会沉降，因此应在使用前立即吸取卵悬液。
- 每次注射前轻轻来回摇动注射器以混匀卵悬液，并对每只小鼠进行100 μL卵悬液的腹腔内注射。
3. 小鼠眼后静脉注射 S. mansoni 虫卵攻击：第14天
- 按上述方法制备虫卵，浓度为 5,000 个虫卵/100 μL。
- 使用异氟烷（4%）在专用麻醉舱内对小鼠进行麻醉，或通过腹腔注射赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（120 mg/kg）。通过夹捏足垫并确认无任何身体反应来判断麻醉深度。
- 用 1 mL 注射器和 23 号3/4英寸针头吸取虫卵悬液后，用镊子将针头弯曲成 90° 角，使针尖斜面朝下并位于弯角处。确保无气泡存在。
- 将小鼠侧放，牵拉皮肤使眼球突出，以与鼻部呈 45° 角的方向将 100 μL 虫卵悬液注入眼球后方的血管中。
- 拔出针头后施加轻压以控制出血。
所有这些操作都必须谨慎进行，并且必须监测小鼠，直至其从麻醉中恢复。这些方案已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
4. 实验收获：第22天
- 用 CO2 处死小鼠。
- 用 70% 乙醇润湿小鼠，并将其仰卧放置。
- 使用钝头镊子夹住小鼠腹部，在皮肤上做一个小切口。用剪刀小心去除皮肤，暴露肋骨和腹膜。
- 切开腹膜，剪断腹主动脉，用巴斯德移液管回收血液。置于冰上保存。
- 将肝脏向下移动以暴露膈肌。使用精细剪刀剪开膈肌，再小心剪开肋骨，暴露肺组织。
- 用精细镊子取出引流肺部的胸腺旁淋巴结。这些淋巴结位于胸腺两侧、肋骨下方9。将其置于含 1 mL 无菌培养基（DMEM，添加 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、50 μM 2-巯基乙醇，均来自 Invitrogen）的容器中，置于冰上保存。
- 为回收支气管肺泡灌洗液（BAL）并为组织学分析充盈肺部，需进行气管内插管。将唾液腺移向两侧以暴露气管，并将精细镊子置于气管下方。使用精细剪刀在气管中部剪一个小孔，将导管插入肺部，并用手术缝线固定导管。
- 将装有 PBS 的 1 mL 注射器连接至导管，用 1 mL PBS 充盈肺部。再用注射器小心回收 BAL 灌洗液，置于冰上保存。
- 将装有 PBS 配制的 4% 多聚甲醛（PFA）的 1 mL 注射器连接至导管，充盈肺部。
- 移除导管，并拉紧手术缝线以防止 PFA 泄漏。
- 小心分离肺组织，放入含 5 mL 4% PFA 的 50 mL Falcon 管中。
5. 恢复组织的制备
- 血清：血液在冰上放置30分钟至2小时以促进凝固后，通过离心（13000 × g，10分钟，4 °C）分离血清。血清储存于-20 °C，可用于细胞因子ELISA或曼氏血吸虫（S. mansoni）虫卵抗原特异性IgG亚型ELISA6, 10。
- 淋巴结：制备单细胞悬液，并通过细胞计数评估免疫反应强度。为检测Th2细胞极化，细胞用曼氏血吸虫（S. mansoni）虫卵抗原重新刺激72小时。通过流式细胞术检测细胞内细胞因子染色，上清液则收集后储存于-20 °C，用于Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）ELISA检测6。
- 支气管肺泡灌洗液（BAL）：细胞经离心（400 × g，5分钟，4 °C）沉淀。收集BAL上清液并储存于-20 °C，用于ELISA检测Th2细胞因子。BAL细胞计数作为气道炎症的评估指标。取10,000–100,000个细胞进行细胞离心涂片（500 rpm，5分钟，4 °C），经Diffquik染色后可对炎性浸润细胞进行分类计数4, 6。此外，BAL细胞也可通过流式细胞术进行分析6。
- 肺组织：肺组织于4 °C保存过夜。固定后的组织经石蜡包埋、切片并贴附于载玻片上，用于组织学及免疫荧光分析。
6. 代表性结果
本方案详细说明了以下所有必要步骤：（i）制备纯化的 曼氏血吸虫 用于卵子的 体内 使用（图1），（ii）用这些虫卵对小鼠进行致敏和激发，（iii）取器官以检测肺部炎症反应。这一 体内 模型可重复地引发强烈的 Th2 型肺部炎症反应。这通过支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞计数和细胞离心涂片所显示的气道炎症和嗜酸性粒细胞增多得以证实（图 2）。H&E染色的肺组织切片可用于观察虫卵诱导的肉芽肿（图 3a），肺组织切片的免疫荧光染色可用于观察替代性活化的巨噬细胞以及Th2细胞因子诱导的基因，例如抵抗素样分子（RELM）α（图 3b）。通过ELISA检测抗原刺激的副胸腺淋巴结细胞产生的IL-5、IL-4和IL-13，以评估抗原特异性CD4 Th2细胞因子反应。图 4).
图1. Schistosoma mansoni 虫卵注射模型。 展示了具有典型高负荷S. mansoni虫卵特征的肉芽肿性肝脏的代表性图像以及S. mansoni虫卵图像——平均大小为长（L）120 μm，宽（W）50 μm。
图 2. S. mansoni 虫卵注射诱导气道炎症。 A. 来自未处理（N）或注射S. mansoni（Sm）虫卵小鼠的支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞数量（x105）。*P<0.05。B. BAL细胞的细胞离心涂片制备。Mac，巨噬细胞（MACROPHAGE）；Eos，嗜酸性粒细胞（EOSINOPHIL）；LYMPH，淋巴细胞（lymphocyte）。标尺，10 μm。
图3. 肺部肉芽肿及围绕S. mansoni虫卵的替代性活化巨噬细胞的可视化。A. 在H&E染色的肺组织切片中可见围绕Sm虫卵（黑箭头）的肺肉芽肿。B. 对RELMα（绿色）、甘露糖受体（红色）和DAPI（蓝色）进行免疫荧光染色，显示在肉芽肿中存在替代性活化的巨噬细胞（白箭头），该肉芽肿围绕自发荧光的Sm虫卵（黑箭头）。比例尺，50 μm。
图 4.S. mansoni 卵抗原特异性 Th2 细胞因子反应。 分离未处理（N）或注射Sm 卵抗原的小鼠引流胸腺旁淋巴结细胞，用Sm 卵抗原刺激 72 小时，随后通过 ELISA 检测上清液中 IL-4、IL-5 和 IL-13 的水平。标度单位：ng/mL。*P<0.05。
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讨论
此处采用一种模型 曼氏血吸虫 描述了通过虫卵诱导2型肺部炎症的方法。该模型的特征包括强烈的Th2免疫反应、气道炎症以及肺部肉芽肿的形成。由于这些参数依赖于CD4+ Th2细胞反应 11，这是研究蛋白质特异性或谱系特异性缺失对Th2细胞反应影响的有用模型。此处的检测指标包括抗原特异性Th2细胞因子的定量、气道内细胞浸润的分析以及肺部肉芽肿大小的评估。另一个可测量的参数是虫卵诱导的纤维化。 12。通过Masson三色染色法对注射虫卵的肺组织切片进行染色，可观察到血管周围、气道周围以及肉芽肿内部的胶原沉积（如图所示） 6).
尽管本实验方案使用了曼氏血吸虫（S. mansoni）虫卵，但该模型的一个局限性在于其无法模拟曼氏血吸虫（S. mansoni）感染过程，真正的感染需通过尾蚴感染小鼠来实现。然而，该模型的优势在于操作简便，且不存在研究人员被感染的风险。虫卵纯化后可方便地冷冻保存，并在数月后使用。解冻后的虫卵已无感染性，因此比活虫卵或感染性尾蚴更易于操作。在制备注射...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）AI091759项目以及美国克罗恩病和结肠炎基金会威廉与谢尔比·莫德尔家族基金会研究奖（授予MN）资助。感染血吸虫的小鼠由美国国家过敏和传染病研究所血吸虫资源中心提供（NIAID合同号N01 A130026）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶/分散酶 | 罗氏应用科学 | 11 097 113 001 (500 mg) | |
| Diff Quik Hema 3 染色 | 包装 | Fisher Scientific Co. LLC | 122-911 |
| DMEM | 液体 | Gibco | 11965 |
| Falcon 50 mL | 包装 | Falcon | 352070 |
| Intramedic PE导管 | Becton Dickinson and Co. | 427410（0.58毫米） | |
| 异氟烷 | Abbot Animal Health | 52600405 (250mL) | |
| 氯胺酮 | Fort Dodge 动物保健 | 100 mg/mL | |
| 甘露糖受体抗体 | 生物素 | AbD Serotec | MCA2235B |
| 金属筛网 | 标准厨房滤网 | 靶点 | Laurentiis |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 15710 (16%) | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15070（100倍） | |
| Percoll | GE Healthcare Biosciences | 17 0891 01（1 升） | |
| RELMα 抗体 | Peprotech | 500-P214（50μg） | |
| 手术缝合线 | Surgical Specialties Corp. | SP118（2.0 USP 100码） | |
| 注射器针头 | BD Vacutainer 实验室 医学 | 305143（23号针头，3/4英寸） | |
| 美国标准试验筛 | W.S. Tyler, Inc. | 150μ米，0.0059" ASTME-11，规格编号 100 | |
| 赛拉嗪 | Butler | 20 mg/mL |
参考文献
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