一种通过神经肌肉电刺激实现肌肉训练的小鼠模型

摘要

本文描述了一种针对小鼠前 compartment 肌肉的神经肌肉电刺激（NMES）的啮齿类动物模型，该方法是一种安全且经济的临床手段。该模型的优势在于可对一种 readily available 的临床设备进行改造，以实现对小鼠特定目标肌肉收缩的诱导。

摘要

神经肌肉电刺激（NMES）是一种常见的临床治疗手段，广泛用于恢复¹、维持²或增强^3-5肌肉功能能力。经皮表面刺激骨骼肌时，电流在阴极和阳极之间流动，从而引发运动单位及其周围肌纤维的兴奋。

神经肌肉电刺激（NMES）是一种具有吸引力的研究骨骼肌适应性反应的方法，原因如下。首先，它提供了一种可重复的实验模型，其中多种生理适应已被充分记录，例如肌纤维肥大和肌肉力量增强⁶、血管生成^7-9、生长因子分泌^9-11以及肌肉前体细胞的活化¹²。这些生理反应可通过调节不同的刺激参数进行精确控制（有关Cochrane综述，参见¹³）。此外，NMES以非选择性、空间固定且时间同步的方式募集运动单位¹⁴，从而能够对所有类型的肌纤维均产生治疗效应。尽管在某些临床人群中存在明确的禁忌证，例如外周静脉疾病或恶性肿瘤，但NMES总体上安全且可行，即使对于病情严重和/或卧床患者，以及难以进行高强度运动的人群亦适用。

本文演示了如何改装市售电极，并使用小鼠模型进行神经肌肉电刺激（NMES）的操作流程。该动物模型的优势在于可使用临床现有的设备，并能即时反馈电极放置位置，以诱发目标肌肉的收缩效应。在本研究中，我们将详细描述对小鼠后肢前群肌肉进行刺激的具体操作步骤。

方案

1. 电极制备

• 裁剪一块 1 cm × 1 cm 的矢量电路板。
• 使用虎钳固定两根线绕针，使针脚间距约为 3.5 mm，线绕针的分叉端应朝上。
• 使用尖嘴钳在线绕针约一半长度处将其弯折成 90° 角。
• 从导线连接点起约 7 cm 处剥除导线绝缘层，露出连接器的铜线部分。
• 将一根铜线焊接到其中一根线绕针的分叉端，再对另一根线绕针重复相同的焊接步骤。
• 将热缩管拉至铜线与金针的焊接连接处，以实现绝缘和加固；使用烙铁头加热热缩管使其收缩。
• 将未焊接的线绕针尖端插入面包板电路板的相邻插孔中。
• 确保线绕针彼此平行，并穿过面包板，使针尖从板上穿出的距离一致。
• 将焊接端的针脚嵌入透明环氧树脂中，静置约 10 分钟，或直至完全固化。
• 重复涂抹环氧树脂，直至针脚和矢量电路板完全被包裹，以增强导线的结构强度并提供应力释放。
• 使用金属锉刀打磨环氧树脂，以露出金针的尖端。
• 使用万用表检测，确保两条导线之间无电气短路，并确认导线通路正常。
• 将 NMES 设备的电极导线连接至双孔母头线缆连接器（Pomona 跳线）。

2. 动物准备

• 使用2%异氟烷（Abbott Laboratories, North Chicago, IL）与100% O₂气体通过吸入法对动物进行麻醉。在整个NMES过程中，动物应保持麻醉状态。
• 开始NMES方案前，应进行足趾夹捏测试，以确认动物已完全麻醉。
• 应定期检查动物对刺激的反应，以确保麻醉深度足够。必要时应调整麻醉剂量。应定期评估除被刺激肢体外的其他部位是否出现运动、呼吸深度的变化以及黏膜颜色，以监测麻醉深度。
• 将动物置于侧卧位。
• 在眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。
• 剃除待治疗的后肢区域毛发，并用酒精擦拭。
• 用3%漂白剂擦拭电极，然后用水冲洗。
• 在电极放置部位涂抹一层导电凝胶。在整个NMES方案过程中，应根据需要重新涂抹，以确保电极与皮肤之间的电流传导。
• 应使用加热灯或循环水毯以维持正常的机体核心温度范围。
• 注意：所有实验程序均已通过匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的审查和批准，并在获得PHS认证及AAALAC International认证的项目和设施中进行。

3. 刺激

• 电极放置：
  • 为了刺激包括胫骨前肌和趾长伸肌在内的前肌室肌肉，应将表面电极直接放置在动物的腓深神经上，该神经是腓总神经的一个远端分支，位于腓骨头前方稍偏位置。
  • 当刺激引发踝关节完全背屈及足趾完全伸展时，表明电极放置位置正确。相反，若仅有背屈而无足趾伸展，则提示仅胫骨前肌被激活。根据实验设计的不同，这种靶向性的收缩反应可能是理想的。
  • 肌肉收缩分为两个刺激阶段：第一个阶段为自由运动的向心收缩期，持续约0.5秒。在此阶段初期，足爪从静息位置移动至最大背屈和足趾完全伸展状态。第二个阶段为在最大背屈和足趾伸展位置维持的等长收缩。
• 刺激参数：
  • 本神经肌肉电刺激（NMES）模型采用300 PV Empi多功能电疗仪，该设备提供两个常规NMES通道（见表格）。在本模型中仅使用一个通道。
  • 所用参数包括对称波形、脉冲持续时间为150 μs、频率为50 Hz。刺激时间设定为5秒，包含0.5秒的上升斜坡和0.5秒的下降斜坡，以使肌肉更渐进地适应刺激。在当前方案中，两次收缩之间的间歇时间为10秒，但可根据所需效果进行调整。缩短间歇时间将更快引发肌肉疲劳。这些刺激参数基于临床方案设计，旨在通过神经肌肉电刺激增强肌肉力量，同时避免引起显著的骨骼肌损伤^{1, 15, 16}。
  • 小鼠完成两组各10次收缩，组间休息5分钟。
  • 对于成年动物，NMES刺激强度通常从9 mA开始。根据我们的经验，此强度接近不会在刺激后立即引起明显步态障碍的最大起始强度。在后续NMES疗程中，每当动物能够完成20次完整背屈动作时，刺激强度即增加1 mA。
• 完成刺激方案并从麻醉中恢复后，动物通常表现出正常的步态与姿势。在整个NMES干预过程中，步态应始终保持无异常。

4. 典型结果

本文所述的NMES方案已在多种小鼠品系中实施，包括：野生型（B6/10）、B6.SCID和mdx/SCID小鼠。展示了在3至5月龄的mdx/SCID小鼠中，连续4周（共20次）进行NMES的代表性结果。

动物在麻醉状态下通过颈椎脱位实施人道安乐死。取胫前肌组织后立即置于液氮预冷的2-甲基丁烷中速冻，并于-80 °C保存。制备连续横切面冰冻切片（10 μm），贴附于载玻片上。采用标准统计软件包（SPSS，v19.0软件）进行统计分析。首先采用Levene检验评估方差齐性，随后采用独立样本t检验分析NMES组与对照组之间的差异。

采用苏木精-伊红（H&E）染色法，以检测NMES方案是否会导致肌营养不良肌肉的损伤加重。选取一张切片，使用光学显微镜（Nikon Eclipse E800；Nikon，日本）拍摄图像。利用美国国立卫生研究院（NIH）开发的图像分析软件Image J，人工计数肌纤维总数以及细胞核位于中央的肌纤维数量。与对照组相比，接受NMES处理的动物其再生指数（中央核肌纤维数/总肌纤维数）未见显著升高（p=0.802；图1）。这表明，NMES的应用并未加剧肌营养不良动物中所观察到的变性-再生级联反应，因此不太可能引起肌肉损伤的加重。

采用CD31免疫荧光染色以研究为期4周的神经肌肉电刺激（NMES）方案对肌肉血管化的影响。简言之，肌肉切片经4%甲醛固定后，使用5%马血清（HS）进行封闭。切片与大鼠抗小鼠一抗（1:300稀释于5% HS中）孵育，随后用555标记的山羊抗大鼠二抗（1:300稀释于5% HS中）处理。为定量CD31阳性细胞总数，选取一个切片，采用荧光显微镜（Nikon Eclipse E800；日本）拍照。毛细血管总数通过Northern Eclipse软件（Empix Imaging Inc.）手动计数。接受NMES处理的动物组中CD31阳性细胞数量较对照组显著增加（p<0.01；图2），表明所述NMES方案可促进骨骼肌血管生成。

在体收缩功能测试：在完成神经肌肉电刺激（NMES）方案4周后，使用在体测试装置（型号809B，Aurora Scientific Inc，加拿大）、刺激器（型号701C，Aurora Scientific Inc，加拿大）和力传感器（Aurora Scientific Inc，加拿大）对前肌室肌肉进行收缩功能测试。简要而言，通过膝关节外侧的小切口分离麻醉动物的腓神经。随后将小鼠仰卧固定于平台，待测足部置于足板上。测试所用后肢通过胶带在膝部和足部进行固定。通过插入皮下的钩状电极对肌肉进行刺激。以150 Hz频率持续350 ms诱导肌肉强直性收缩，以评估为期4周的NMES方案是否可改善肌肉力量。实验结果按湿肌重量进行标准化处理。与对照组相比，接受NMES处理的动物强直性收缩力提高约30%（p=0.005）（图3），表明所述方案可改善mdx/SCID动物骨骼肌的收缩力量。

图 1. 营养不良（mdx）/免疫缺陷小鼠（4-5个月）骨骼肌的苏木精与伊红染色结果（10倍放大）：A）未经处理的对照组，B）经4周神经肌肉电刺激（NMES）后的样本。

图 2. 营养不良（mdx）/免疫缺陷小鼠（4-5个月）骨骼肌中作为骨骼肌血管化标志物的CD31免疫荧光（红色）（20倍放大）A）未处理对照组，B）NMES治疗4周后。

图3. 对照组与接受为期4周NMES治疗动物的前部肌群收缩功能测试。mNm = 毫牛顿·米。点击此处查看高清大图。

讨论

这些结果表明，我们建立的小鼠NMES模型可促进骨骼肌血管生成（图2）和肌肉增强（图3），但不会引起骨骼肌损伤（图1）。

需要注意的是，此处所述的刺激参数旨在对前部肌群产生肌肉超负荷效应。与临床情况类似，可根据需要调整电极放置位置以刺激其他肌群，但不同肌群对神经肌肉电刺激（NMES）的反应可能因其肌纤维类型组成不同而有所差异。根据研究设计，可调整NMES的持续时间、治疗总次数以及重复总次数。

与任何实验方案一样，本方法也存在一些需要注意的局限性。在本研究中，刺激作用于腓深神经。然而，在临床实践中，刺激通常施加于运动单元。在动物模型中，刺激神经需要较低的强度即可引发完全的肌肉收缩。本模型的另一个局限性在于，由于动物处于麻醉状态，我们无法获得应用神经肌肉电刺激（NMES）过程中关于舒适度的信息。因此，难以评估临床人群中类似强度刺激的耐受性。然而，我们的组织学结果表明，所描述的NMES模型不会引起肌肉损伤。

开发能够模拟临床常用治疗模式的动物模型，为我们提供了有用的实验工具，有助于更深入地理解细胞和分子对治疗干预的反应。此外，这些模型还可用于开展临床前研究，以优化现有的康复方案并开发新的适应证。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带分叉焊片端子的向量线绕接柱	Newark Inc	T68
向量电路板	Newark Inc	3662-2
Pomona 跳线	Newark Inc	P-36-0
5 分钟环氧树脂	VO Baker Co.	4001
Spectra 360 电极凝胶	Milliken Medical	MR41217
便携式神经肌肉刺激装置	EMPI	300pv