通过热酚-水法提取纯化和可视化革兰氏阴性菌脂多糖

摘要

我们介绍一种改良的热酚水法，用于从革兰氏阴性菌中纯化脂多糖（LPS）。提取后的LPS可通过SDS-PAGE进行分析，并通过直接染色或Western免疫印迹进行检测。

摘要

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。它是一种三部分结构的分子，包括嵌入外膜中的脂质A、核心寡糖以及从细胞表面向外延伸的重复O-抗原单位。^{1, 2}LPS 是一种免疫优势分子，对包括多种细菌在内的许多细菌物种的毒力和致病性具有重要作用， 铜绿假单胞菌，沙门氏菌 物种，以及 大肠杆菌^3-5，而LPS O-抗原组成上的差异是菌株血清型分类的基础。LPS在感染初期参与细菌与宿主细胞的黏附，并提供对补体介导杀伤的保护；缺乏LPS的菌株其毒力可能减弱^6-8因此，对脂多糖（LPS）进行可视化尤为重要，特别是来自临床分离株的LPS。通过观察LPS的条带模式及其被特异性抗体识别的情况，可有效用于鉴定菌株谱系并表征各类突变体。

本报告中，我们描述了一种采用热酚水法从革兰氏阴性菌细胞中分离和纯化脂多糖（LPS）的方法。该方案能够将LPS与核酸和蛋白质有效分离，避免因使用时间较短、强度较低的提取方法而导致的LPS可视化干扰⁹。采用此方法制备的LPS可通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离，并直接使用碳水化合物/糖蛋白染色或标准银染方法进行染色。许多抗LPS抗血清中含有与外膜蛋白或其他抗原靶标发生交叉反应的抗体，这会干扰在SDS-PAGE分离的粗制细胞裂解液进行Western免疫印迹后所观察到的反应性。单独对粗制细胞裂解液进行蛋白酶处理，并不总能有效消除此类背景干扰，无论使用本方法或其他可视化方法均如此。此外，过度的蛋白酶处理虽旨在去除背景干扰，却可能导致LPS质量下降，无法通过上述任何方法获得良好分辨。基于这些原因，我们认为以下改编自Westpahl和Jann¹⁰的实验方案是LPS提取的理想选择。

方案

1. LPS 提取用细菌的制备

1. 在5 mL的Luria肉汤（LB）中接种过夜培养物，必要时加入抗生素。在37 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中培养12-18小时。
2. 用LB将菌液按1:10稀释，并在分光光度计中测定OD₆₀₀值。根据OD₆₀₀测定结果，将细菌重悬于1.5 mL LB中，调节菌液浓度至OD₆₀₀为0.5。
3. 在微型离心机中以10,600×g离心10分钟，收集菌体沉淀。弃去上清液。若不立即提取脂多糖（LPS），可将菌体沉淀保存于-20 °C。

2. LPS 的提取

1. 首先，配制 2x SDS 缓冲液。在 50 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 6.8）溶液中加入 4% β-巯基乙醇（BME）、4% SDS 和 20% 甘油，混匀。加入少量溴酚蓝以染色溶液。通过将 2x 储液与无菌去离子 H₂O 按 1:1 比例稀释，制备 1x SDS 缓冲液。该溶液可在室温下保存。
2. 分别用无菌去离子 H₂O 配制 10 mg/mL 的 DNase I、RNase 和 Proteinase K 溶液，共三种。
3. 将步骤 1.3 中获得的菌体沉淀重悬于 200 μl 的 1x SDS 缓冲液中。通过缓慢吹打确保沉淀完全重悬。切勿涡旋。
4. 将重悬的菌液在水浴中煮沸 15 分钟。随后在室温下冷却 15 分钟。
5. 加入 5 μl 步骤 2.2 中配制的 DNase I 和 RNase 溶液。将样品在 37 °C 下孵育 30 分钟。*此步骤为可选；核酸酶处理与未处理样品之间的 LPS 质量差异极小。
6. 加入 10 μl 步骤 2.2 中配制的 Proteinase K 溶液。将样品在 59 °C 下孵育 3 小时。如有时间限制，此步骤可过夜进行。
7. 向每个样品中加入 200 μl 冰冷的 Tris 饱和酚（若无 Tris 饱和酚，可用水饱和酚替代）。确保管盖紧闭，每个样品涡旋约 5 至 10 秒。
8. 将样品在 65 °C 下孵育 15 分钟，期间偶尔涡旋。孵育后冷却至室温，然后向每个样品中加入 1 mL 室温的乙醚并涡旋 5 至 10 秒。操作乙醚时务必在通风橱中进行，因其具有挥发性。
9. 将样品在 20,600x g 下离心 10 分钟。小心从离心机中取出样品，收集底部蓝色层。注意避免吸取上层透明层。宁可残留少量蓝色层，也不可被上层污染。
10. 通过重复步骤 2.7 至 2.9 对样品进行再次提取。通常两次提取已足够。若样品仍浑浊，可进行更多次提取。在进行 SDS-PAGE 分离前，向各提取后的样品中加入 200 μl 的 2x SDS 缓冲液。样品可在 8%–15% 的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。通常，使用该方法制备的 5–15 μl LPS 即足以实现可视化。

3. 代表性结果

按照上述方法制备的LPS样品，可在SDS-PAGE分离后通过标准的银染方法或商用LPS染色试剂盒进行直接染色观察。 Alternatively，可在聚丙烯酰胺凝胶上分离LPS后将其转印至硝酸纤维素膜，并使用LPS特异性抗血清进行Western免疫印迹分析。在本实验方案中，我们采用了Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit（Molecular Probes），并按照制造商提供的说明进行操作。

图1显示的是用Pro-Q Emerald 300染色的12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶。每条泳道含有15 μl来自不同菌株的Burkholderia dolosa脂多糖（LPS），这些菌株分离自囊性纤维化患者的痰液样本。通过该方法可明显观察到不同的LPS条带梯状模式，反映了连接在核心寡糖上的O-抗原重复单元数量的不同；例如，第1道和第6道的样品具有相似的条带模式（以红色框标出）。

图1. 临床分离株Burkholderia dolosa的LPS经Pro-Q Emerald 300染色结果。从囊性纤维化患者爆发疫情中分离的七株B. dolosa菌株提取LPS，提取方法如本实验方案所述。取15 μl样品在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，并根据生产商说明书用Pro-Q Emerald 300染色。箭头所示为LPS核心区域，具有相似O-抗原重复条带模式的LPS用红色框标出。M = 分子量标记物。

讨论

我们已描述了一种将脂多糖（LPS）与其他细胞组分（包括核酸和蛋白质）分离的纯化方法。该方法可获得高质量的LPS，可用于多种不同的可视化技术，例如对SDS-PAGE凝胶进行碳水化合物染色，如图1所示。该方法可用于利用特异性抗血清对多种菌株的LPS进行血清分型，或通过直接可视化来显示不同分离株之间的相关性。例如，最近一项全基因组测序研究结合一次 B. dolosa 疫情暴发中分离菌株的LPS表征，发现了一个单核苷酸多态性（SNP），该多态性与这些菌株中LPS的存在或缺失相关¹¹。我们认为，该方法优于Hitchcock和Brown⁹所描述的对全细胞裂解物进行蛋白酶处理的方法，因为本方法相对快速，且足够严谨，能够获得适用于进一步分析的高质量LPS。

虽然我们仅展示了一个使用该方法的示例 洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia dolosa），本方案也可适用于其他革兰氏阴性菌物种。我们已成功应用此方案从其他物种中提取并可视化脂多糖（LPS） 伯克霍尔德菌属 sp.， 大肠杆菌、幽门螺...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重组DNase I，无RNase	Roche Group	04716728001
RNase A	Roche Group	10109169001
蛋白酶K	Fisher Scientific	BP1700
Tris饱和酚	Fisher Scientific	BP1750-100
乙醚	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 脂多糖凝胶染色试剂盒	Molecular Probes, Life Technologies	P20495