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利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

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DOI：

10.3791/3918

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2012年4月29日

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1Department of Neurosurgery, The University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran

本文内容

摘要

本视频方案演示了如何应用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）根据细胞分裂频率来鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的不同细胞亚群。

摘要

肿瘤异质性是支持肿瘤稳健性的基本特征，也是开发治疗策略面临的主要障碍1为克服肿瘤异质性问题，必须开发出能够对驱动特定疾病病理并代表临床相关靶点的肿瘤亚群进行表型、（表观）遗传及功能层面鉴定与表征的检测方法和工具。目前已有充分证据表明，肿瘤包含具有不同细胞分裂频率的独立亚群，且在多种癌症（包括脑癌、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌以及白血病）中，细胞增殖缓慢这一功能性特征与成瘤能力呈正相关。2-8荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）已被用于追踪细胞的分裂频率 体外 和 在体 在血液传播性肿瘤和胶质母细胞瘤等实体瘤中2,7,8细胞可渗透的非荧光CFSE前体药物可被细胞内酯酶转化为荧光化合物，该化合物通过其琥珀酰亚胺基团与细胞内胺基发生反应，共价结合于蛋白质，形成稳定的酰胺键，从而保留在细胞内。9荧光染料在细胞分裂时均等地分配到子细胞中，导致每次细胞分裂后荧光强度减半。这使得细胞周期频率可被追踪至八到十次分裂轮次。10采用CFSE保留能力法对脑肿瘤细胞进行分析，以鉴定和分离出具有较慢增殖周期的亚群（染料保留率最高的前5%细胞），该亚群被证实富含癌症干细胞活性。2.

本方案描述了使用CFSE对细胞进行染色，并通过流式细胞术分离培养的人源胶质母细胞瘤（GBM）细胞中具有不同分裂速率的亚群的技术2。该技术已用于鉴定并分离出一类因能够保留CFSE标记而表现出缓慢循环特性的脑肿瘤细胞亚群。

方案

1. 制备胶质母细胞瘤单细胞悬液

  1. 胶质瘤球培养采用神经球检测法（NSA），具体方法如前所述2,11,12。
  2. 当胶质瘤球需要传代时，吸除含有瘤球的培养基，转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以800 rpm（110 g）离心5分钟。
  3. 弃去上清液，将瘤球沉淀重悬于1 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中，于37 °C水浴孵育3–5分钟。
  4. 随后加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。
  5. 轻轻吹打细胞悬液，确保细胞均匀分散并完全中和胰蛋白酶活性。
  6. 再次以800 rpm离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml NeuroCult NSC基础培养基中。
  7. 取10μl单细胞悬液与90μl台盼蓝混合，进行细胞计数。

2. 使用细胞示踪羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）绿色荧光染料染色

  1. 每染色100万个细胞，需配制1 ml染色试剂：将1 μl的5 mM Cell Trace CFSE染料（Molecular Probes, Invitrogen）加入1 ml NeuroCult NSC基础培养基中，终浓度为5 μM。
  2. 将含有细胞的染色试剂充分混匀至均一状态，并在室温下孵育10分钟。
  3. 在孵育期间，预先准备好冰冻的NeuroCult NSC基础培养基作为淬灭溶液。
  4. 为终止染色过程，向载有CFSE的细胞中加入约5–10倍体积的冰冻淬灭溶液。
  5. 随后以800 rpm离心5分钟，并弃去上清液。
  6. 此时，离心管底部应可见细胞沉淀，呈亮绿色，表明染色成功。
  7. 通过将细胞沉淀重悬于1–2 ml新鲜NeuroCult NSC基础培养基中进行洗涤，800 rpm离心5分钟，弃去上清液；重复该步骤，共洗涤三次。
  8. 第三次洗涤后，将细胞重悬于1 ml NeuroCult NSC基础培养基中，并进行细胞计数。
  9. 将CFSE标记的细胞以适当密度（50,000个细胞/ml）接种至无菌组织培养瓶中，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。

3. CFSE 负载验证

  1. 在NSA培养体系中培养的细胞可通过荧光显微镜观察以验证CFSE染色效果。在此阶段，所有细胞均呈现明亮的绿色（图1）。或者，也可将CFSE染色后的细胞悬液滴加至载玻片上，加盖盖玻片，随后在荧光显微镜下观察细胞形态。
  2. CFSE标记的成功与否还可通过流式细胞术进一步确认。每组取1-5 × 105个细胞即足以用于CFSE染色的验证。将CFSE负载的细胞与未负载的阴性对照细胞分别重悬于1 × PBS或NeuroCult NSC基础培养基中，总体积为500 μl，并分装至不同的FACS管中。
  3. 根据流式细胞仪用户手册中的说明，调整仪器相关参数。CFSE的最大激发波长为492 nm，最大发射波长为517 nm。
  4. 首先检测未负载的对照细胞，记录前向散射光与侧向散射光（FSC vs. SSC）及直方图数据，并对主要细胞群进行设门（图2A）。
  5. 同样地，使用与对照细胞相同的参数分析CFSE负载的细胞（图2B）。

4. 使用荧光激活细胞分选（FACS）分离慢分裂（即CFSE保留）细胞群体

  1. 分裂后，CFSE 荧光强度降低，hGBM 细胞形成胶质瘤球，其内部细胞表现出不同水平的绿色荧光强度（图3）。当胶质瘤球体达到平均直径约150-200 μm 直径达到一定大小时（根据细胞系的生长速率，通常在CFSE标记后约5至10天），移除含有细胞球的培养基，转移至适当大小的无菌组织培养管中，室温下以800 rpm离心5分钟。
  2. 单细胞悬液按先前步骤制备，细胞重悬于PBS中进行细胞计数，以制备密度高达10的细胞悬液7 每毫升细胞数
  3. 在用适当体积的 PBS 重悬细胞后，加入碘化丙啶（Propidium Iodide, PI, Sigma, 500 μg/ml) 的添加浓度为 1 μl/ml 排除死细胞的细胞悬液，在流式细胞术分选/分析时使用。
  4. 两个15 ml无菌组织培养管，每管含有1 ml完全NeuroCult NSC培养基，用于收集分选后的慢速分裂细胞（CFSE保留细胞）和快速分裂细胞（CFSE稀释细胞）。
  5. 首先，将未加处理的细胞组的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。
  6. 细胞（事件）根据前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）进行绘图，调整这两个参数的电压，使大多数细胞包含在流式图中。
  7. 为排除死细胞或受损细胞，根据SSC与PI反应性对细胞进行散点图分析，并圈选单个活细胞群体（PI阴性）。
  8. 然后，根据前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）选择均一的细胞群体。
  9. 将均一的单个活细胞群体根据细胞频率与CFSE强度的关系绘制在直方图上，CFSE强度采用对数刻度。调整CFSE激光强度，使阴性信号位于0至100之间。
  10. 使用相同的参数和类似的设门策略，将CFSE标记的细胞通过流式细胞仪进行检测和分析（图 4C).
  11. 随后，根据细胞保留CFSE（CFSE）的能力，鉴定出缓慢分裂的细胞群体和总体细胞群体（快速分裂的细胞）。高-顶部5% 和 CFSE低-底部85%，分别）。
  12. 将这些不同的细胞群体分别分选至含有1 ml完全NSC培养基的独立15 ml无菌组织培养管中。
  13. 分选后的细胞在800 rpm下离心5分钟。
  14. 弃去上清液，将沉淀物重悬于适量培养基中（根据分离得到的细胞数量或沉淀物大小确定体积），并进行细胞计数。
  15. 将不同分选群体的细胞以每毫升50,000个细胞的密度接种于适当的无菌组织培养瓶中，并置于 37 °C 在5% CO2加湿培养箱中培养5-10天，随后进行连续传代或用于下游实验。

5. 代表性结果

CFSE标记后，所有细胞在显微镜下均呈现强烈的绿色荧光（图1）。这种绿色甚至肉眼可见（见视频）。通过流式细胞术分析这些细胞，与对照细胞相比也显示出强烈的绿色荧光（图2）。将CFSE标记的细胞接种至神经球培养体系中后，这些细胞增殖并在5至10天内形成直径为150–200 μm的胶质瘤球。随着细胞不断增殖，荧光染料在每次细胞分裂时均等地分配给子代细胞，导致每经历一次细胞分裂，荧光强度减半。胶质母细胞瘤在功能上具有异质性，包含以不同时间尺度增殖的细胞群体。本实验方案所述方法可根据细胞稀释或保留CFSE的能力，分别鉴定并分离出快速和缓慢分裂的细胞（图3，亦见视频）。

对由CFSE标记细胞和未标记细胞解离得到的胶质瘤球进行流式细胞术分析，显示出不同的CFSE保留特性（图4）。在神经球培养条件下，快速分裂的细胞（底部85%）或缓慢分裂的细胞（顶部5%——CFSEhigh）均表现出形成胶质瘤球的能力（图5）。

CFSE 荧光显微镜图像；细胞增殖实验；绿色荧光；细胞染色。
图1. 用CFSE染料标记后立即分离的肿瘤细胞。细胞呈现明亮的绿色，表明标记成功。原始放大倍数：10 ×。

流式细胞术示意图；细胞分析；CFSE 数据；图形比较；细胞群体分化。
图 2. 使用流式细胞术验证 CFSE 标记效果。A) 未标记细胞，B) CFSE 标记细胞，以及 C) 比较标记与未标记细胞中 CFSE 荧光强度。注意标记细胞与未标记细胞之间的荧光强度相差多个数量级。

细胞分裂过程，CFSE染色细胞，荧光显微镜图像
图3. 一个来自接种后第6天CFSE标记细胞的代表性胶质瘤球。部分细胞显示出非常明亮的CFSE染色。原始放大倍数：63 ×。

流式细胞术分析；图表显示细胞散射、CFSE荧光及细胞增殖动力学。
图4. CFSE标记后第6天快速与慢速分裂细胞分离的代表性流式细胞术图谱/直方图。A) FSC 与 SSC 显示全部细胞群体，B) SSC 与 PI 反应性以排除死亡或受损细胞，C) FSC 与 SSC 用于圈选均一的活细胞群体，D) 显示CFSE标记后第6天仍保留CFSE的细胞，其荧光强度高于阴性对照，表明CFSE阳性细胞的存在；直方图还显示CFSE荧光强度随时间逐渐减弱，E) 直方图展示用于识别CFSE保留细胞（前5%）和CFSE稀释细胞（后85%）的设门策略。

细胞分裂分析；细胞来源的球体显微图像；柱状图比较分裂速度。
图 5. 由A) 快速分裂细胞（CFSElow）和B) 缓慢分裂细胞（CFSEhigh）生成的代表性胶质瘤球。原始放大倍数：分别为 10x 和 20x。C) 在传代时从快速或缓慢分裂细胞来源的培养物中获得的代表性细胞计数。P<0.05，t 检验。点击此处查看大图。

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讨论

越来越多的研究表明，在癌症中存在一类分裂缓慢的细胞亚群，这类细胞对肿瘤的形成和治疗耐药性具有重要作用2-8。因此，描述并标准化可用于研究这一特定细胞亚群的实验方法至关重要，或者更广泛地说，用于比较具有不同增殖速率的细胞亚群。利用CFSE根据细胞分裂速率来识别和分离细胞亚群，是进一步表征这些特定细胞组分的起点，有助于加深我们对肿瘤异质性的理解。在本实验方案中，我们以胶质母细胞瘤中慢分裂细胞群的识别与分离为例进行说明，但该方案同样适用于其他肿瘤细胞，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌和皮肤癌。对这些细胞群可进行后续分析，包括增殖潜能2、成瘤能力2、治疗敏感性以及（表观）遗传学特征的比较研究。该方法也可应用于非癌性疾病系统，例如体细胞干细胞/前体细胞的研究。

实验过程中的关键技术要点包括使用胰蛋白酶充分解离细胞，以及将细胞在染色缓冲液中充分重悬，以建立适当的细胞密度并确保染色均匀。应取少量新染色的细胞通过流式细胞术进行检测，以确认标记的均一性，表现为类似高斯分布的狭窄峰型（见图2B）。如果初始标记...

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致谢

本研究工作得到了佛罗里达脑肿瘤研究中心、小普雷斯顿·A·威尔斯脑肿瘤治疗中心以及美国国立卫生研究院（1R21CA141020-01）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NeuroCult NSC 基础培养基（人源）Stem Cell Technologies05750
NeuroCult NSC 增殖添加剂（人源）Stem Cell Technologies05753
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGIBCO, by Life Technologies25300-062
大豆胰蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichT6522
青霉素/链霉素GIBCO, by Life Technologies15140-122
T25 培养瓶Nalge Nunc international136196
T80 培养瓶Nalge Nunc international178905
15 ml 离心管BD Biosciences352096
50 ml 离心管BD Biosciences352070
EGFR&D Systems2028-EG
CellTrace CFSE 细胞增殖检测试剂盒Molecular Probes, Life TechnologiesC34554

参考文献

  1. Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
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