用于浓缩水中病毒及农业人畜共患病原体的玻璃棉滤器

摘要

全球多个研究团队已使用玻璃棉滤器来浓缩水传播的病毒。本文展示了一种构建玻璃棉滤器的简单方法，并证明该滤器在浓缩水传播的病毒、细菌和原生动物病原体方面同样有效。

摘要

评估疑似受污染水体中病原体水平的关键第一步是浓缩。浓缩方法通常针对特定病原体类别，例如美国环境保护署方法1623（US Environmental Protection Agency Method 1623）用于 贾第虫 和 隐孢子虫¹，这意味着如果采样计划针对多个病原体类群，则需要采用多种方法。当前方法的另一个缺点是设备可能复杂且昂贵，例如使用1MDS滤筒过滤器浓缩病毒的VIRADEL方法²本文介绍了如何构建玻璃 wool 过滤器以浓缩水传播病原体。滤器洗脱后，浓缩液可进行二次浓缩步骤（如离心），随后通过培养或分子方法进行病原体检测与计数。该过滤器具有多项优势：构建简便，且可根据特定采样需求制作成任意尺寸；滤器组件成本低廉，使得在不显著增加项目预算的情况下可采集大量样品成为可能。根据样品浊度导致的堵塞速率，可浓缩较大体积的样品（数百至数千升）。过滤器便携性强，仅需泵和流量计等少量设备，即可在野外用于成品饮用水、地表水、地下水及农业径流水样的采集。此外，玻璃 wool 过滤法对多种类型的病原体均具有良好的浓缩效果，因而仅需使用单一方法。本文报道了该过滤器在浓缩水中人源肠道病毒方面的有效性， 肠道沙门氏菌，微小隐孢子虫以及禽流感病毒。

方案

1. 准备玻璃棉

1. 每次制备滤材前后，均需使用10%的次氯酸钠溶液对工作区域进行消毒。
2. 戴上手套和实验服。将一个桶通过高压灭菌（121°C、15 psi）至少20分钟进行灭菌处理。将玻璃棉放入已灭菌的桶中。
3. 用反渗透水充分浸润玻璃棉，并浸泡15分钟。
4. 将桶中的反渗透水排干。
5. 用1 M HCl充分浸润玻璃棉，并浸泡15分钟。
6. 将桶中的1 M HCl排干。
7. 用反渗透水冲洗玻璃棉。
8. 充分混匀。
9. 使用pH试纸检测pH值，并重复用反渗透水冲洗，直至达到中性pH。
10. 倒掉冲洗水。
11. 用1 M NaOH充分浸润玻璃棉，并浸泡15分钟。
12. 将桶中的1 M NaOH排干。
13. 重复反渗透水冲洗，直至达到中性pH。
14. 倒掉冲洗水。
15. 除使用桶外，也可构建玻璃棉清洗装置，其设计类似于玻璃移液管清洗器（图1）。
16. 用pH值调至6.8的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）完全覆盖玻璃棉。
17. 制备好的玻璃棉应立即使用，或在4°C下保存，最长可保存两周。使用前需确认pH为中性，因pH会随时间升高；若pH非中性，需用无菌磷酸盐缓冲液（pH 6.8）重新冲洗。

2. 组装玻璃棉滤器

1. 在PVC管帽上钻一个11/16英寸的孔，并攻出螺纹，以便将尼龙外螺纹接头拧入管帽中。此步骤仅在首次组装时需要。此后，管帽可多年重复使用。在尼龙接头的螺纹上缠绕生料带，然后拧紧至管帽上。
2. 用小块玻璃棉填充PVC管。可使用类似汽车发动机气门的金属冲杆将其压实。压实过程无需施加过大力量，只需压至玻璃棉固定不移、且不形成水流通道即可。但也不可过紧，以免阻碍水流通过滤器。当滤器连接至压力为40–60 psi的水龙头时，适当填充后应能达到每分钟4至5升的流速。对于本方案中指定尺寸的PVC管，每根管约需使用85克经清洗并压实的玻璃棉。将空PVC管置于电子天平上归零，然后填充清洗过的玻璃棉，直至管的总质量增加85克。
3. 将聚丙烯筛网插入已安装尼龙外螺纹接头的PVC管帽中。
4. 在PVC管的螺纹部分缠绕生料带。
5. 将PVC管帽拧紧到PVC管两端，并将其中一端标记为进水口，另一端标记为出水口。此标记在后续洗脱步骤中非常重要。哪一端标记为进水口并无特定要求。
6. 使用带有导管头的注射器，将60 mL无菌磷酸盐缓冲液（pH = 6.8）推入滤器中，多余液体将从另一端流出。
7. 用Parafilm膜紧密包裹两端，以防泄漏。滤器可在4°C下储存最多30天。

3. 取样

1. 通过循环或浸泡在0.525% NaClO（即标准家用漂白剂的10%溶液）中30分钟，对采样所用的管路进行灭菌。随后排空次氯酸盐溶液，并用0.05%硫代硫酸钠中和，该溶液通过将25 mL 2%无水硫代硫酸钠储备液加入1升反渗透水中配制而成。
2. 对于pH值大于7.5的水样，使用HCl将pH值调节至6.5至7.0之间。HCl浓度可在0.25 M至1 M范围内。通常情况下，0.5 M HCl溶液4升足以处理两个800升的水样，具体用量取决于水样的初始pH值和缓冲能力。在采样过程中使用蠕动泵或文丘里管（图2）注入HCl。调节泵速或文丘里管开口以达到目标pH值。使用便携式pH计测量采样管线出口处的pH值。
3. 若玻璃棉滤器因高浊度水样而堵塞，应使用预滤器。（预滤器及其外壳的规格详见在线材料清单。）由于病原体可能附着在预滤器截留的颗粒上，因此必须与玻璃棉滤器一同进行洗脱（见下文）。
4. 将流速调节至每分钟2至4升。典型的采样体积在200至1,500升之间。
5. 拆下玻璃棉滤器，置于无菌塑料袋中，在4°C下保存，最长可保存48小时。

4. 洗脱

1. 将玻璃棉滤器固定在铁架台上，使样品流入端朝下指向聚丙烯瓶。洗脱方向应与样品流动方向相反。
2. 向滤器中压入80 mL无菌的3%牛肉提取物溶液（溶于0.05 M甘氨酸，pH为9.5）。
3. 等待15分钟。
4. 再次向滤器中压入80 mL无菌的3%牛肉提取物溶液（溶于0.05 M甘氨酸，pH为9.5）。
5. 向滤器中通入空气，直至泡沫从滤器入口处排出。
6. 用1 M HCl将洗脱液的pH调节至7.0至7.5之间。
7. 洗脱液可在4°C下保存最多24小时，或在-20°C下长期保存。
8. 如果使用了预滤器，则需对其进行洗脱。拧开滤壳卡盒的顶部，在用无菌手套固定预滤器的同时，倒出滤壳内部所有残留的水。
9. 从滤壳卡盒中取出预滤器，并将其放入一个15英寸×6英寸的自封袋中。
10. 向袋中加入200 mL无菌的3%牛肉提取物溶液（溶于0.05 M甘氨酸，pH为9.5），然后用自封条严密封口。
11. 将装有预滤器的袋子反复倒置数次，确保整个表面均与牛肉提取物接触。
12. 静置15分钟，期间偶尔倒置并轻轻揉搓装有预滤器的袋子。
13. 打开自封口，用手紧握袋子包裹住预滤器，尽可能挤出牛肉提取物，然后用无菌手套将预滤器取出。
14. 将牛肉提取物洗脱液倒入聚丙烯瓶中。
15. 用1 M HCl将洗脱液的pH调节至7.0至7.5之间。
16. 洗脱液可在4°C下保存最多24小时，或在-20°C下长期保存。预滤器洗脱液可单独用于病原体分析，也可与玻璃棉滤器洗脱液合并处理。

5. 代表性结果

病原体	水体浊度水平（NTU）a	接种量/L b,c,d	回收率 ± 1 SD	独立实验次数
肠道病毒-脊髓灰质炎病毒萨宾III型	0.5	500	81% ± 11	7
肠道病毒-脊髓灰质炎病毒萨宾III型	0.5	5000	67% ± 12	8
肠道病毒-脊髓灰质炎病毒萨宾III型	215	500	59% ± 32	7
肠道病毒-脊髓灰质炎病毒萨宾III型	215	5000	38% ± 22	6
肠道病毒-脊髓灰质炎病毒萨宾III型	447	500	56% ± 18	8
肠道病毒-脊髓灰质炎病毒萨宾III型	447	5000	63% ± 37	8
Cryptosporidium parvum	0.5	5	38% ± 14	7
Cryptosporidium parvum	0.5	50	53% ± 19	8
Cryptosporidium parvum	215	5	40% ± 16	7
Cryptosporidium parvum	215	50	30% ±6	6
Cryptosporidium parvum	447	5	33% ± 13	8
Cryptosporidium parvum	447	50	28% ± 11	8
Salmonella enterica	0.5	5	29% ± 24	7
Salmonella enterica	0.5	500	56% ± 16	8
Salmonella enterica	215	5	32% ± 24	7
Salmonella enterica	215	500	34% ±11	6
Salmonella enterica	447	5	34% ± 18	8
Salmonella enterica	447	500	31% ± 24	8

1. 浊度单位（Nephelometric Turbidity Unit）
2. 通过qPCR定量的肠道病毒基因组拷贝数/L
3. 通过免疫荧光法计数的C. parvum卵囊数
4. 通过培养法计数的S. enterica菌落形成单位

表1. 不同水体浊度和病原体密度下的玻璃棉浓度。

病原体	水样采集地点	接种量/La	回收率%
禽流感 H5N2	Sundi 湖，安克雷奇自治区	2500	42.9%
禽流感 H5N2	Minto Flats，费尔班克斯北星自治区	2500	36.7%
禽流感 H5N2	Portage Valley，安克雷奇自治区	2500	7.8%
禽流感 H5N2	波特沼泽，安克雷奇自治区	2500	41.5%
禽流感 H5N2	Willow 湖，育空-科尤库克自治区	2500	15.5%

1. 通过qPCR测量，单位为基因组拷贝数/升

表2. 利用阿拉斯加五个地点的水样进行禽流感病毒的玻璃棉浓缩。

图 1. 玻璃棉清洗装置示意图。该装置可替代水桶使用，节省冲洗时间。其原理与玻璃移液管清洗器类似。

图2. 通过蠕动泵注入酸液的玻璃棉过滤装置。注意“T”型连接器的位置，泵的管路通过该连接器将酸液注入自来水龙头与玻璃棉过滤器之间的样品流路中。仅当所采集水样的pH值> 7.5时，才需要调节pH值。

玻璃棉滤材在从浊度和病原体密度范围广泛的水样中浓缩病原体方面具有高效性（表1）。为验证这一点，将20升脱氯自来水与干燥的粉砂壤土（0、1.27或2.75 g/L）混合，以达到目标浊度水平，并在其中接种不同浓度的病原体。将水样通过玻璃棉滤材过滤，收集洗脱液中的浓缩病原体并进行计数，该数值作为回收率百分比计算中的分子。接种到水样中的病原体数量，即回收率百分比计算中的分母，是通过将病原体接种至阴性洗脱液中后进行计数确定的。阴性洗脱液的制备方法是：将未接种病原体的20升水样通过滤材过滤并洗脱。在阴性洗脱液中定量接种的病原体，可避免因玻璃棉滤材引入的基质差异而导致的病原体定量偏差。Lambertini 等人et al.³讨论了在使用qPCR定量病原体时此步骤的重要性。通过玻璃棉过滤浓缩一份20升的阴性对照样品，以确认其中不存在可能干扰回收率计算的内源性病原体。当浊度水平≥215 NTU时，使用孔径标称10 μm的预滤器。

采用Lambertini et al.³中所述的二次浓缩、核酸提取程序以及引物和探针，通过实时定量PCR（qPCR）对脊髓灰质炎病毒进行定量。在为脊髓灰质炎病毒所建立的二次浓缩程序获得的最终浓缩样品体积（FCSV）中，对Cryptosporidium parvum进行定量。采用免疫荧光法（MeriFluor Cryptosporidium & Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH）对卵囊进行可视化检测。通过将样品接种至XLD琼脂（Remel, Lenexa, KS）并计数菌落形成单位，对FCSV中的Salmonella enterica进行定量。

玻璃棉滤器在浓缩禽流感病毒方面效果显著（表2）。将低致病性禽流感病毒（H5N2）接种至来自阿拉斯加多个地点的水样中，并按上述方法计算回收率。后续的二次浓缩及核酸处理步骤参照脊髓灰质炎病毒的方法进行；病毒通过qPCR定量，所用引物和探针信息见Spackman et al.⁴

讨论

多个研究团队已使用玻璃棉滤器^3,5,6从多种水源中浓缩人肠道病毒，包括处理后的饮用水⁷、地下水^8,9、地表水¹⁰、海水¹¹、废水¹²以及农业径流¹³。本文报道了该滤器在浓缩禽流感病毒以及细菌性和原虫性病原体Salmonella enterica（伤寒沙门菌血清型）和Cryptosporidium parvum方面同样有效。Deboosere 等最近也报道了使用玻璃棉浓缩禽流感病毒的方法¹⁴。

这些滤膜的优势在于价格低廉、便携性强，可在多种水质条件下使用，并且能够有效富集多种水传病原体。根据研究需求，可将滤膜制备成任意尺寸。消毒后，滤膜外壳可重复使用。

然而，玻璃棉滤材也存在一些局限性。与任何依赖带正电介质吸附病毒的病毒浓缩方法一样（例如 1MDS 滤器，CUNO 公司，美国康涅狄格州梅里登），滤材的效...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸	Fisher Scientific	A144-500
氢氧化钠	Fisher Scientific	BP359-212
磷酸盐缓冲液 氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾	Fisher Scientific	BP358-212 BP363-500 BP362-500
次氯酸钠，即家用漂白剂	Clorox
无水硫代硫酸钠	Fisher Scientific	S 475-212
干燥牛肉浸膏	BD Biosciences	211520
甘氨酸	Fisher Scientific	G46-500
油浸钠钙玻璃棉 或 R-11 无覆面玻璃纤维保温材料	Johns Manville	Bourre 725 QN
聚丙烯网	Industrial Netting	xN4510
2英寸×4英寸 Sch 80 PVC 螺纹管接头	Grainger	6MW35
2英寸 Sch 40 PVC 堵头	Grainger	5WDW3
尼龙外螺纹接头（1/2英寸×1/2英寸）	US Plastic Corp.	62178
洗脱液样品瓶 - 1升	Fisher Scientific	03-313-4F
60 mL 注射器	Fisher Scientific	NC9661991
pH 试纸	Whatman, GE Healthcare	2614 991
预过滤器，聚丙烯，10英寸滤芯，10 μm	McMaster-Carr	4411K75
预过滤器外壳	Cole-Parmer	S-29820-10