本文演示了一种通过电天线图分析法测定成年脐橙螟（Amyelois transitella）触角对单一组分及混合物挥发性物质的电生理反应，从而快速筛选寄主植物挥发物的方法。
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摘要
摘要
植物挥发物在植物与昆虫的相互作用中起着重要作用。植食性昆虫利用植物释放的挥发物（称为利己素）来定位其寄主植物。1,2 当寄主植物为重要的农业经济作物时，害虫取食造成的损害可能给种植者带来严重的经济损失。因此，利己素可作为引诱剂用于吸引或干扰这些昆虫，从而为害虫防控提供一种环境友好的农药替代方案。3 然而，植物会释放大量挥发物，其成分种类及排放比例随作物物候期或一天中的时间而变化。这使得鉴定具有生物活性的单一成分或挥发性成分组合变得极为困难。为了帮助鉴定寄主植物挥发物中具有生物活性的成分，我们采用基于实验室的电生理筛选生物测定法——触角电位（EAG）。EAG是一种有效的工具，可用于评估和记录昆虫通过触角受体产生的嗅觉电生理反应。EAG筛选过程有助于减少需测试的挥发物数量，从而快速锁定具有潜力的生物活性成分。然而，EAG生物测定仅能提供有关受体激活的信息，无法揭示化合物所引发的昆虫行为类型——例如引诱、驱避或其他行为反应。相对于适当阳性对照能引发显著EAG反应的挥发物，通常会被进一步用于测试害虫的行为响应。本文所介绍的实验设计将详细阐述通过EAG生物测定法检测成年害虫脐橙螟蛾（Amyelois transitella）对基于杏仁的寄主植物挥发物4,5的单一组分及简单混合组分的电生理触角反应的方法。该方法使用两个离体触角，置于“叉状”电极支架上。此处演示的方案提供了一种快速、高通量且标准化的挥发物筛选方法。每种挥发物均以设定且恒定的剂量施加，以标准化刺激强度，从而使触角反应能够反映相对化学感受敏感性。阴性对照有助于排除残留溶剂及气流机械力引起的电生理反应。阳性对照（本实验中为苯乙酮）是一种能够稳定引起来自雄性和雌性脐橙螟蛾（NOW）个体一致反应的单一化合物。另一种常用于雄性NOW蛾生物测定研究的半化学标准物质是(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛，它是雌性产生的性信息素中的醛类成分。6-8
方案
1. 用于EAG筛选的寄主植物挥发物的制备
- 在通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对所有挥发性物质进行适当的鉴定与确认后，对每种可获得的挥发性物质进行触角电生理（EAG） puff 分析。初步筛选时，每种性别的触角反应可采用较低的重复次数（N=3–5），以在较短时间内获得相对化学感受敏感性的初步评估。表1).
- 配制每种挥发性物质在戊烷中的溶液，浓度为 5 mg/mL。密封后冷藏保存，待立即使用时取出（例如苯乙酮，密度 = 1.03 g/mL，体积 = (0.005 g/1.03 g/mL) × 1,000 = 4.85 μL 将苯乙酮加入1.0 mL容量瓶中，并用戊烷定容至1.0 mL。
- 在进行EAG分析前，取出装有待测挥发物（5 mg/mL浓度）的小瓶，置于室温下回温。同时，标记相应数量的巴斯德移液管，使其与每种待测挥发物一一对应，并用一小块帕拉膜（约15 × 15 mm）覆盖移液管尖端。在初步筛选阶段，准备10根刺激用移液管（每份雄性和雌性样本N=4），以应对制备失败或其他意外情况。
- 使用一对镊子，将生物测定圆片轻轻对折，以方便放入移液管中，然后将对折后的圆片部分插入移液管的宽口端，使约2–3 mm的圆片露出。将已标记并准备好的移液管整齐排列在支架中。
- 使用移液器或注射器，加载 10 μL (50 μg将挥发性溶液滴加到每个圆盘上，静置2分钟后，再将圆盘完全插入移液管中。加载完成后，立即用Parafilm封膜（约15 × 30 mm）密封移液管末端。所用挥发性刺激物的剂量及喷出量可能因昆虫种类不同而有所差异。
- 按照上述相同方案制备每项分析中需包含的对照样本。对于阴性对照，上样 10 μL 仅将戊烷加到每个圆盘上，等待2分钟，装入已标记的移液管中并密封。对于阳性对照，装入 10 μL (50 μg将样品滴加到圆盘上，静置2分钟，用标记好的移液器吸取，并用封口膜密封。
- 昆虫触角标本的存活能力很可能因物种而异，但我们发现 Amyelois transitella 触角通常保持活跃且稳定 > 切除后30分钟，使用所述方案。该时间通常可支持评估4-10个挥发性样品。 表2 提供了时间与序列的示例。
2. EAG 生物测定用昆虫触角的制备
- 本实验的重点是触角电位（EAG）分析；因此，默认每位研究人员均可获得经过适当饲养的昆虫。
- 本实验将研究3-4日龄、已交配的雄性和雌性蛾类。在分析当天，将单个蛾子转移至小型带盖塑料容器中。在进行生物测定前，立即以头部朝前的方式将待测蛾子转移至固定装置（例如由不同塑料移液器吸头制成）中，并从后方固定。可在低倍立体显微镜下观察昆虫的操作过程，以便于进行组织切除。
- 使用带金属尖端的工具将触角轻轻分离。叉状电极支架上涂有一层薄薄的导电胶，应放置在附近以便快速转移触角。使用显微剪刀切除第一条触角，并将其放置在叉状支架上，确保触角基部置于支架非红色区域（即无关电极/接地电极）。启动计时器（设定为10分钟），随后切除第二条触角，并将其与第一条并列放置，两条触角的基部均位于叉状支架的同一侧。
- 或者，也可将触角保留在固定管内，直接在管中切除，然后使用末端沾有少量导电胶的金属尖工具，从管壁与昆虫之间轻轻取出触角。
- 检查触角，确保其基部和末端均浸入导电胶中，且胶内无气泡存在。必要时可修剪触角末端，以确保其充分接触导电胶。操作时需注意，避免将触角其余部分覆盖导电胶，从而保证最大面积的触角表面暴露于气流刺激中。
- 将准备好的叉状支架插入探针前置放大器中，并在接下来的10分钟等待期间，持续以200 mL/min的流速通入湿润空气。记录切除时间及EAG开始时间（表2）。在首次刺激气流前30秒，打开含有阳性对照物的移液管密封，并将其放入支架中，调整位置使气流/喷气方向距离准备好的触角2-3 mm。
- 每次实验结束后，将测试用蛾子置于干冰环境中实施安乐死，并按规定妥善处理。
- 解剖雌性蛾子以确认其交配状态；共居的雄性个体默认为已交配。
3. 各组分的EAG实验方案
- 通过Syntech EAG仪器配套的AutoSpike软件记录触角反应。在AutoSpike属性选项卡中，EAG探针所在通道的设置为采样率106.7，不整流，滤波范围为0–42 Hz。在滤波器选项卡中，EAG滤波器设为开启，低频截止设为0.1 Hz。
- 刺激气流持续时间为1–2秒。每次气流刺激后启动一个时长为1分钟的计时器。
- 打开下一个测试挥发物的移液管并插入支架中。按照测试挥发物的顺序（例如表2），在每次气流刺激之间严格间隔1分钟进行测试，且不同实验轮次间随机化顺序，以确保没有测试化合物始终紧随另一测试挥发物之后。
- 为便于读取EAG反应，可在计算机屏幕上放置部分标尺，测量基线至向下偏转信号峰顶的距离（单位为mm），并记录在数据表中（例如，对于5 mV设置，33 mm = 2.5 mV）。该软件具备回放已保存记录的功能，可用于后续分析。毫米（mm）到毫伏（mV）或微伏（μV）振幅的换算在后续数据分析中进行。
- 在最后一次阳性对照气流刺激（例如记录编号#12）完成后，取下触角，用乙醇浸湿的擦拭纸清洁叉状支架，并在下次使用前使其干燥。
- 为提高检测通量，可在当前实验结束前约10分钟（即在第四次气流刺激后，按表2为当前实验的第二个测试挥发物）由第二名实验人员开始下一组触角的切除操作，以便在当前实验一结束即刻开始下一轮实验。
- 对于感兴趣的化合物，可增加重复次数（使用不同的触角），以提供更充分的统计学验证。
4. 混合物或其他基质的EAG分析示例（表3）
- 接下来，计算两种三元混合物（三组分混合物）的比例和体积，以举例说明如何组合能引起较强触角电位反应的挥发性物质（表4）。计算基于一些基本比例：α-蛇麻烯 : 2-十一烷酮 : 2-苯乙醇的摩尔比为1:1:1，随后与另一种混合比例1:2:4进行比较。
- 采用此前描述的类似实验方案，配制混合物，并将混合物及必要的阳性和阴性对照分别加入已标记的巴斯德移液管中。
- 将挥发性样品吹过雄性和雌性触角，测量其反应并记录在数据表上（表3）。
5. 代表性结果
对于雌性脐橙螟蛾，使用以下设置：2秒气流脉冲，10秒记录时间，10秒时间窗口，以及5 mV量程。典型的反应为负向偏转，但记录其绝对值（例如，-3,400 μV的偏转记录为3,400 μV）。若样品对阳性对照的反应较弱，则该结果予以舍弃。图1展示了脐橙螟蛾对阳性对照反应较差的图示。
以较差的对照结果为例，雌性触角对苯乙酮的平均反应通常约为 2,600 μV（图 2）；如果制备样本的反应值仅为约 1,300 μV，则该样本将被弃用，并重新制备另一对触角。类似地，雄性对(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛的平均反应通常为 3,000 μV；因此，任何低于 1,500 μV 的反应值通常均被弃用。
每次实验开始和结束时的阳性对照还可提供有关触角状态的信息。我们遵循的快速筛选经验法则是，若触角对实验后对照气流（记录编号#12）的反应 表 2小于75%的1st 预对照的喷气（记录编号 #1， 表 2）或少于 2nd 预对照的喷射（记录编号 #2， 表2）则该实验不纳入数据分析，以避免因样品制备可能发生的降解而影响结果图3）。第一条经验法则的一个示例是记录编号 #1 = 2,730 μV 并记录 #12 = 1,680 μV；经验法则之二：若记录编号 #2 = 2,350 μV 并记录 #12 = 1,680 μV在这些情况中的每一种中，制备过程和实验结果都将被弃用。
以下是一个针对阳性对照测得的EAG反应值进行校正的代表性示例。
| 运行次数 # | EAG (μV) | 运行次数 #2 | EAG (μV) | 运行次数 #3 | EAG (μV) |
| (+) 对照 | 2800 | (+) 对照 | 2420 | (+) 对照 | 3030 |
| 化合物 A | 3000 | 化合物 A | 2500 | 化合物 A | 3440 |
| (-) 对照 | 530 | (-) 对照 | 755 | (-) 对照 | 910 |
| 化合物 B | 2400 | 化合物 B | 2000 | 化合物 B | 2560 |
| (+) 对照 | 2770 | (+) 对照 | 2400 | (+) 对照 | 3020 |
根据上述N=3实验的数值，每个实验中的每个值均减去阴性对照反应，其假设为阴性对照代表触角对机械气流及残留溶剂的基线响应。
| 运行次数 #1 | EAG (μV) | 运行次数 #2 | EAG (μV) | 运行次数 #3 | EAG (μV) |
| (+) 对照 | 2270 | (+) 对照 | 1665 | (+) 对照 | 2120 |
| 化合物 A | 2470 | 化合物 A | 1745 | 化合物 A | 2530 |
| (-) 对照 | 0 | (-) 对照 | 0 | (-) 对照 | 0 |
| 化合物 B | 1870 | 化合物 B | 1245 | 化合物 B | 1650 |
| (+) 对照 | 2240 | (+) 对照 | 1645 | (+) 对照 | 2110 |
每个实验的阳性对照将被取平均值并校正至1,000 μV，同时记录校正至1,000 μV的比值。可使用数据表（例如Excel）轻松处理，将反应信号转换为可用数据。
| 运行次数 #1 | 平均值 (μV) | 运行次数 #2 | 平均值 (μV) | 运行次数 #3 | 平均值 (μV) |
| (+) Ctrl | 2255 | (+) Ctrl | 1655 | (+) Ctrl | 2115 |
| (+) Ctrl adj. | 1000 (0.443) | (+) Ctrl adj. | 1000 (0.604) | (+) Ctrl adj. | 1000 (0.473) |
通过在每个实验中乘以校正系数，对化合物 A 和化合物 B 的数值进行调整。
| 运行次数 #1 | 校正后EAG(μV) | 运行次数 #2 | 校正后EAG(μV) | 运行次数 #3 | 校正后EAG(μV) |
| Cmpnd A | 1094 | Cmpnd A | 1054 | Cmpnd A | 1197 |
| Cmpnd B | 828 | Cmpnd B | 752 | Cmpnd B | 780 |
随后确定每种化合物的平均值（均值）以及其他相关统计学数据，并可据此评估所测试化合物的EAG反应，以筛选出适合进一步研究的候选物质。
| 化合物 | EAG (μV) | 运行次数，N= |
| A | 1115 | 3 |
| B | 787 | 3 |
图1. 雄性触角反应的代表性EAG1,180 μV) 与预对照 (1st 阳性对照气流）在确认触角与凝胶接触良好后，若触角反应不佳则予以弃用。底部窗口中的蓝色条形代表持续两秒的挥发性物质气流。 单击此处以查看大图.
图2. 雌性触角反应的代表性EAG3,400 μV) 加入到 1st 适当的吹气预控制。 单击此处查看大图.
图3. 雌性触角反应的代表性EAG1,680 μV) 与对照后组（每次实验的最后一个阳性对照）相比，若结果较差，则提示触角可能已降解<75%st 预对照或 < 2nd 预控制的 puff 值）。在此示例中，第 1 个st 预对照喷气 2,730 μV 和 2nd 预对照喷气 2,350 μV. 单击此处查看大图.
图 4. 雌性触角对候选挥发性混合物气流刺激的典型EAG反应（3,800 μV），以及随后测量的最大初始偏转（3,800 μV）、气流持续期间的初始斜率（0.3 s/1.2 mV = 0.25 s/mV）和剩余气流持续时间的斜率（1.6 s/1.9 mV = 0.84 s/mV）。 点击此处查看大图。
图 5. 小型改良容器，内含待吹过A. transitella触角的样品基质及其相关挥发物。
表 1. 原位 非帕里尔杏仁（2007年）的挥发物释放及其通过Autospike程序中不同且灵敏度较低的配置测定的EAG响应结果。
表 2. 记录雄性和雌性触角对单一挥发性成分反应的表格示例。
表 3. 记录雄性和雌性触角对挥发性混合物和/或香精反应的记录表示例。
表 4. 两种不同配比混合物制备 10 mL 浓度为 5 mg/mL 溶液的示例。
表 5. 记录单一挥发性组分在雄性和雌性触角上连续两次气流刺激反应的记录表示例。
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讨论
利用触角电位图（EAG）记录作为生物测定方法来确定目标昆虫的化学感受反应较为常见，文献中已有大量研究采用EAG作为气相色谱流出物的检测器（GC-EAD）。9,10 本文所展示的方法能够对等量挥发性组分进行快速筛选，并具有较高的重复性，从而可靠地评估相对响应程度。Syntech软件中的AutoSpike程序适用于挥发性物质的初步筛选，因其可提供来自昆虫触角的最大偏转信号振幅（图1-3），本文将此值称为“筛选”值。此外，根据配置参数及研究者所需获取的信息，AutoSpike还可提供一些适用于半高级应用的基本数据（见图4）。GcEAD或EagPro Syntech程序则更适合于更高级的实验，或适用于熟悉电生理反应的研究人员，因为其输出的波形图可更详细地反映触角去极化反应随时间变化的过程。
在对寄主植物中检测到的化合物进行筛选之前，对挥发性物质进行准确鉴定至关重要，且应遵循严格的鉴定规程。如果条件允许，应使用两根极性不同的气相色谱柱（例如 DB-Wax 和 DB-1），通过匹配保留指数（RIs，见<...
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披露
作者与Paramount Farming Company（一家与Suterra LLC有关联的公司）已有现有的合作研究与开发协议。
致谢
本研究在 USDA-ARS CRIS 项目 5325-42000-037-00D 下开展，并获得了合作研发协议 CRADA 58-3K95-7-1198 和技术转让协议 TFCA 58-5325-8-419 结果的支持。作者衷心感谢 Suterra 惠赠 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛，感谢 B. Higbee 提出的有益讨论，以及 J. Baker 提供的技术协助。
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参考文献
- Bruce, T. J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Insect host location: a volatile situation. Trends in Plant Sci. 10, 1360-1385 (2005).
- Unsicker, S. B., Kunert, G., Gershenzon, J. Protective perfumes: the role of vegetative volatiles in plant defense against herbivores. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 479-485 (2009).
- Norin, T. Semiochemicals for insect pest management. Pure Appl. Chem. 79, 2129-2136 (2007).
- Beck, J. J., Merrill, G. B., Higbee, B. S., Light, D. M., Gee, W. S. In situ seasonal study of the volatile production of almonds (Prunus dulcis) var. 'nonpareil' and relationship to navel orangeworm. J. Agric. Food Chem. 57, 3749-3753 (2009).
- Beck, J. J., Higbee, B. S., Gee, W. S., Dragull, K. Ambient orchard volatiles from California almonds. Phytochem. Lett. 4, 199-202 (2011).
- Coffelt, J. A., Vick, K. W., Sonnet, P. E., Doolittle, R. E. Isolation identification, and synthesis of a female sex pheromone of the navel orangeworm, Amyelois transitella (Lepidoptera: Pyralidae). J. Chem. Ecol. 5, 955-933 (1979).
- Leal, W. S., Parra-Pedrazzoli, A. L., Kaissling, K. -E., Morgan, T. I., Zalom, F. G., Pesak, D. J., Dundulis, E. A., Burks, C. S., Higbee, B. S. Unusual pheromone chemistry in the navel orangeworm: novel sex attractants and a behavioral antagonist. Naturwissenschaften. 92, 139-146 (2005).
- Kanno, H., Kuenen, L. P. S., Klingler, K. A., Millar, J. G., Carde, R. T. Attractiveness of a four-component pheromone blend to male navel orangeworm moths. J. Chem. Ecol. 36, 584-591 (2010).
- Takacs, S., Gries, G., Gries, R. Semiochemical-mediated location of host habitat by Apanteles carpatus (Say) (Hymenoptera: Braconidae), a parasitoid of cloths moth larvae. J. Chem. Ecol. 23, 459-472 (1997).
- Karimifar, N., Gries, R., Khaskin, G., Gries, G. General food semiochemicals attract omnivorous German cockroaches, Blattella germanica. J. Agric. Food Chem. 59, 1330-1337 (2011).
- Molyneux, R. J., Schieberle, P. Compound identification: a Journal of Agricultural and Food Chemistry perspective. J. Agric. Food Chem. 55, 4625-4629 (2007).
- Marion-Poll, F., Thiery, D. Dynamics of EAG responses to host-plant volatiles delivered by a gas chromatograph. Entomol. Exp. Appl. 80, 120-123 (1996).
- Beck, J. J., Higbee, B. S., Merrill, G. B., Roitman, J. N. Comparison of volatile emissions from undamaged and mechanically damaged almonds. J. Sci. Food Agric. 88, 1363-1368 (2008).
- Lucas, P., Renou, M., Tellier, F., Hammoud, A., Audemard, H., Descoins, C. Electrophysiology and field activity of halogenated analogs of (E,E)-8-10-dodecadien-1-ol, the main pheromone component in codling moth (Cydia pomonella L.). J. Chem. Ecol. 20, 489-503 (1994).
- Rodriguez-Saona, C., Poland, T. M., Miller, J. R., Stelinski, L. L., Grant, G. G., de Groot, P., Buchan, L., MacDonald, L. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-86 (2006).
- Burks, C. S., Brandl, D. G. Seasonal abundance of navel orangeworm (Leipidoptera: Pyralidae) in figs and effect of peripheral aerosol dispensers on sexual communication. J. Insect Sci. 4, 1-8 (2004).
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