触角电位生物测定作为寄主植物挥发物筛选工具

摘要

本文演示了一种通过电天线图分析法测定成年脐橙螟（Amyelois transitella）触角对单一组分及混合物挥发性物质的电生理反应，从而快速筛选寄主植物挥发物的方法。

摘要

植物挥发物在植物与昆虫的相互作用中起着重要作用。植食性昆虫利用植物释放的挥发物（称为利己素）来定位其寄主植物。^1,2 当寄主植物为重要的农业经济作物时，害虫取食造成的损害可能给种植者带来严重的经济损失。因此，利己素可作为引诱剂用于吸引或干扰这些昆虫，从而为害虫防控提供一种环境友好的农药替代方案。³ 然而，植物会释放大量挥发物，其成分种类及排放比例随作物物候期或一天中的时间而变化。这使得鉴定具有生物活性的单一成分或挥发性成分组合变得极为困难。为了帮助鉴定寄主植物挥发物中具有生物活性的成分，我们采用基于实验室的电生理筛选生物测定法——触角电位（EAG）。EAG是一种有效的工具，可用于评估和记录昆虫通过触角受体产生的嗅觉电生理反应。EAG筛选过程有助于减少需测试的挥发物数量，从而快速锁定具有潜力的生物活性成分。然而，EAG生物测定仅能提供有关受体激活的信息，无法揭示化合物所引发的昆虫行为类型——例如引诱、驱避或其他行为反应。相对于适当阳性对照能引发显著EAG反应的挥发物，通常会被进一步用于测试害虫的行为响应。本文所介绍的实验设计将详细阐述通过EAG生物测定法检测成年害虫脐橙螟蛾（Amyelois transitella）对基于杏仁的寄主植物挥发物^4,5的单一组分及简单混合组分的电生理触角反应的方法。该方法使用两个离体触角，置于“叉状”电极支架上。此处演示的方案提供了一种快速、高通量且标准化的挥发物筛选方法。每种挥发物均以设定且恒定的剂量施加，以标准化刺激强度，从而使触角反应能够反映相对化学感受敏感性。阴性对照有助于排除残留溶剂及气流机械力引起的电生理反应。阳性对照（本实验中为苯乙酮）是一种能够稳定引起来自雄性和雌性脐橙螟蛾（NOW）个体一致反应的单一化合物。另一种常用于雄性NOW蛾生物测定研究的半化学标准物质是(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛，它是雌性产生的性信息素中的醛类成分。^6-8

方案

1. 用于EAG筛选的寄主植物挥发物的制备

1. 在通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对所有挥发性物质进行适当的鉴定与确认后，对每种可获得的挥发性物质进行触角电生理（EAG） puff 分析。初步筛选时，每种性别的触角反应可采用较低的重复次数（N=3–5），以在较短时间内获得相对化学感受敏感性的初步评估。表1).
2. 配制每种挥发性物质在戊烷中的溶液，浓度为 5 mg/mL。密封后冷藏保存，待立即使用时取出（例如苯乙酮，密度 = 1.03 g/mL，体积 = (0.005 g/1.03 g/mL) × 1,000 = 4.85 μL 将苯乙酮加入1.0 mL容量瓶中，并用戊烷定容至1.0 mL。
3. 在进行EAG分析前，取出装有待测挥发物（5 mg/mL浓度）的小瓶，置于室温下回温。同时，标记相应数量的巴斯德移液管，使其与每种待测挥发物一一对应，并用一小块帕拉膜（约15 × 15 mm）覆盖移液管尖端。在初步筛选阶段，准备10根刺激用移液管（每份雄性和雌性样本N=4），以应对制备失败或其他意外情况。
4. 使用一对镊子，将生物测定圆片轻轻对折，以方便放入移液管中，然后将对折后的圆片部分插入移液管的宽口端，使约2–3 mm的圆片露出。将已标记并准备好的移液管整齐排列在支架中。
5. 使用移液器或注射器，加载 10 μL (50 μg将挥发性溶液滴加到每个圆盘上，静置2分钟后，再将圆盘完全插入移液管中。加载完成后，立即....

讨论

利用触角电位图（EAG）记录作为生物测定方法来确定目标昆虫的化学感受反应较为常见，文献中已有大量研究采用EAG作为气相色谱流出物的检测器（GC-EAD）。^9,10 本文所展示的方法能够对等量挥发性组分进行快速筛选，并具有较高的重复性，从而可靠地评估相对响应程度。Syntech软件中的AutoSpike程序适用于挥发性物质的初步筛选，因其可提供来自昆虫触角的最大偏转信号振幅（图1-3），本文将此值称为“筛选”值。此外，根据配置参数及研究者所需获取的信息，AutoSpike还可提供一些适用于半高级应用的基本数据（见图4）。GcEAD或EagPro Syntech程序则更适合于更高级的实验，或适用于熟悉电生理反应的研究人员，因为其输出的波形图可更详细地反映触角去极化反应随时间变化的过程。

在对寄主植物中检测到的化合物进行筛选之前，对挥发性物质进行准确鉴定至关重要，且应遵循严格的鉴定规程。如果条件允许，应使用两根极性不同的气相色谱柱（例如 DB-Wax 和 DB-1），通过匹配保留指数（RIs，见<.......