一种利用磁珠进行液相结合捕获分析研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法：以脊髓灰质炎病毒-纳米抗体为例

摘要

本文介绍了一种简单、定量的液相亲和捕获检测方法。该技术基于磁珠与带标签蛋白（如纳米抗体）之间的相互作用，以及带标签蛋白与另一种标记蛋白（如脊髓灰质炎病毒）之间的亲和力，是一种可靠的检测手段。

摘要

本文介绍了一种简单、定量的液相亲和捕获检测方法。只要一种蛋白质可被标记，另一种蛋白质可被示踪，该方法即可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法一方面依赖于钴包被磁珠对带标签蛋白的识别，另一方面依赖于带标签蛋白与另一种被示踪的特异性蛋白之间的相互作用。首先，将被示踪和带标签的蛋白质混合，并在室温下孵育。然后加入可识别标签的磁珠，利用磁铁将结合态的示踪蛋白与未结合的游离部分分离。通过测定未结合组分中残留示踪蛋白的信号，可间接定量被捕获的示踪蛋白量。所述液相亲和检测法在检测对构象转换敏感的蛋白质时尤为有用。本文以脊髓灰质炎病毒与其识别纳米抗体之间的相互作用为例，展示了该检测方法的开发与应用¹。由于脊髓灰质炎病毒在结合固相表面时易发生构象转换²（未发表结果），ELISA 的应用受到限制，因此应优先选用基于液相的检测系统。在脊髓灰质炎研究中常用的一种液相检测系统是微蛋白 A 免疫沉淀试验^3,45。尽管该方法已证明其适用性，但它需要 Fc 结构域，而纳米抗体缺乏该结构^6,7。然而，作为一种替代方案，这些有趣且稳定的单域抗体⁸可方便地通过基因工程引入多种标签。(His)₆ 标签是广泛使用的一种标签，可特异性结合镍或钴等二价离子，而这些金属离子又可轻易包被于磁珠表面。因此，我们开发了基于钴包被磁珠的简单定量亲和捕获检测法。为使脊髓灰质炎病毒与纳米抗体的相互作用不受阻碍，并实现定量检测，本研究采用³⁵S 对病毒进行标记。该方法操作简便，成本低廉，且磁珠可高效再生，进一步降低了使用成本。

方案

原理（A）与方法的示意图（B）见图1。

1. 缓冲液的制备

1. 通过将磷酸二氢钠（50 mM）和氯化钠（300 mM）溶于水中，配制结合/洗涤缓冲液，并将pH值调节至8.0。再加入Tween 20（终浓度0.01%（m/v））、甲硫氨酸（终浓度2%（m/v））和牛血清白蛋白（终浓度0.1%（m/v）），并定容至所需体积。

2. 磁珠的制备

根据说明书准备磁珠。简要步骤如下：

1. 使用涡旋振荡器重悬磁珠。
2. 每个样本转移 10 μl 重悬后的磁珠（40 mg/ml）至离心管中。
3. 使用磁力架吸附磁珠，直至上清液澄清（约 30 秒），小心移除上清液。
4. 洗涤磁珠两次：加入 150 μl 结合/洗涤缓冲液重悬磁珠，用磁力架将磁珠移至管壁一侧，待上清液澄清后，小心吸除上清液。
5. 每个样本使用 40 μl 结合/洗涤缓冲液重悬磁珠（10 mg/ml）。

3. 亲和捕获实验

注意：为测量（宇宙）背景放射性（0%放射性），在对照样本1中不添加放射性标记的病毒，而是加入相同体积的结合/洗涤缓冲液。

....

讨论

在该实验方案中，与纳米抗体相互作用的抗原的放射性通过上清液中放射性标记病毒的减少量来定义。因此，可通过上清液中的放射性（= a %）间接估算沉淀的放射性（=100 - a %）（即结合到磁珠上的部分）。另一方面，也可通过使用500 mM咪唑将免疫复合物从磁珠上洗脱，直接测定抗原结合部分的放射性。先前已有研究¹¹证实，总放射性与上清液和沉淀组分中放射性之和完全一致。因此，测定上清液的放射性是可接受且节省时间的方法。从磁珠上洗脱免疫复合物的具体方法由Thys et al., 2011¹¹描述。

除脊髓灰质炎病毒外，其他小RNA病毒也被证实对固体表面诱导的构象转换敏感，例如具有重要经济意义的口蹄疫病毒（FMDV）²。文献中已有描述，蛋白质在结合到塑料表面后通常会发生形状改变以及结合亲和力降低的现象¹²。因此，该检测方法可用于研究其他对构象变化敏感的蛋白质之间的相互作用，用于表位作图、确定正确折叠蛋白质的含量、在生产过程中筛查与结构相关的杂质、在生产期间对批次进行快速筛选、纯化由高度相.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
His标签蛋白分离与沉淀用Dynabeads	Invitrogen	101.03D	磁珠
Optiphase ’HiSafe’ 2	PerkinElmer, Inc.	1200 - 436	闪烁液