本文展示了一种用于研究生命早期应激下DNA甲基化和基因表达变化的简化工作流程。从新生小鼠的母体分离开始，到离散脑组织的分离，我们提供了一种从脑组织穿孔样本中同时提取DNA和RNA的实验方案，以用于后续的亚硫酸氢盐测序和逆转录PCR分析。
本文内容
摘要
摘要
在生命敏感期暴露于饮食、药物及早期生活逆境1,2，可导致基因表达发生持久性改变，进而影响生理和行为表型的表现。此类环境编程可能增加个体对代谢性疾病、心血管疾病和精神疾病易感性3,4。
DNA甲基化和组蛋白修饰被认为是介导基因与环境对话的关键过程，似乎也是环境编程的基础5。在哺乳动物中，DNA甲基化通常指在CpG二核苷酸背景下，胞嘧啶的5位碳原子上共价添加一个甲基基团。
CpG 甲基化以高度组织和细胞特异性的方式发生，这使得研究细胞异质性高且组织量有限的脑部微小区域变得具有挑战性。此外，由于基因表达与甲基化密切相关，通过在同一份样本中比较这两个参数，可以获得更高的研究价值。
本文以“母体分离”这一早期生活逆境模型为例，展示了一种研究大脑表观遗传编程的逐步实验方案（图1）。该方案描述了从不同年龄小鼠脑组织中制备显微穿刺样本的方法，可从同一组织样本中同时提取DNA和RNA，从而能够在同一样本中进行DNA甲基化和基因表达分析。
方案
1. 早期生活逆境的编程作用
通过定时妊娠的C57BL/6N小鼠所产的幼鼠（出生当天为出生后第0天（P0））进行母体分离（MS），以诱导其早期生命阶段的应激（ELS）。
- 从出生后第1天至第10天（P1–10），每天将单个窝的幼鼠放入清洁笼具中（配备加热垫）3小时。
- 对照组（非早期生活应激，non-ELS）幼鼠在整个期间留在母鼠巢穴中，不进行干扰。
- 幼鼠断奶前一直与母鼠同笼（至P21），断奶后按性别分组饲养（每笼3–5只小鼠），置于标准实验动物饲养条件下。
2. 脑组织的分离与解剖
- 小鼠在预定年龄通过颈椎脱位处死。 注意：由于本实验方案涉及应激范式，为避免干扰应激激素的正常生理调节，颈椎脱位前不给予麻醉。打开颅骨后小心取出脑组织，并立即浸入异戊烷-干冰中快速冷冻，随后于 - 存放80 °C.
- 脑组织进行冷冻切片（10 μm 厚度）；切片置于 Superfrost 玻片上，并于 -20 °C参考标准小鼠立体定位图谱（例如 Paxinos 6用于验证解剖学定位的准确性，并确保目标区域被完整采集（例如，采集室旁核神经元时，应从室旁核前部水平开始，即前囟水平 -0.75 至 -0.85 处收集切片）。
- 切片用焦油紫染色以方便识别不同的脑区结构。通过获取感兴趣区域（如室旁核）的0.8 mm钻孔组织样本， 原位 显微解剖
3. 从脑组织穿孔样本中提取核酸
本文描述了一种优化的方案，可从微小的神经解剖学定义脑区同时提取DNA和RNA，用于亚硫酸氢盐测序和基因表达分析7。
注意：由于RNA在GTC缓冲液中的稳定性低于DNA，我们建议优先处理RNA。用于DNA纯化的匀浆在此期间可室温（RT）保存。
- 在室温下，使用移液器和涡旋振荡器将穿孔组织在400 μl胍硫氰酸盐（GTC）缓冲液（4.5 M 胍硫氰酸盐，2% N-月桂酰肌氨酸，50 mM EDTA pH 8.25 mM Tris-HCl pH 7.5，0.1 M β-巯基乙醇，0.2% 消泡剂A）中匀浆，通过皮下注射器（29G）反复吹打数次（图2）。
- 将裂解液等分；可根据具体实验需求同时或分别提取RNA和DNA。
- 进行RNA纯化时，向裂解液中加入1/10体积的NaOAc、1体积的AquaPhenol（Appligene，pH 4）以及1/2体积的氯仿:异戊醇（24:1）。每步操作后剧烈涡旋，冰上孵育10分钟，然后离心（4 °C下10,000 g离心20分钟）；向水相中加入等体积的70%乙醇。
- 将混合物转移至RNA离心柱（例如Macherey-Nagel的Nucleospin RNA II），按制造商说明书进行柱上DNase消化和洗涤步骤；用25 μl H2O洗脱RNA。
- 进行DNA纯化时采用Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒的优化方案。用等体积的Buffer AL和100%乙醇平衡裂解液，加载至离心柱中（室温下10,000 g离心1分钟），弃去穿流液。
- 向柱中加入500 μl Buffer AW1，并加入5 μl RNase（1 mg/ml），室温孵育10分钟。离心（室温下10,000 g离心1分钟），弃去穿流液。
- 用500 μl Buffer AW2洗涤离心柱，弃去穿流液，空柱离心干燥（15,000 g离心1分钟）。
- 加入预热（70 °C）的Buffer AE，于70 °C孵育离心柱10分钟。通过离心（1分钟，10,000 g）洗脱，将穿流液重新上柱并重复离心步骤。
使用分光光度计测定 DNA 和 RNA 浓度。一次典型的下丘脑室旁核组织取样可获得约 600 ng DNA 和约 400 ng RNA。在进行定量 PCR（qPCR）基因表达分析时，逆转录反应中通常使用约 100 ng RNA。
4. 亚硫酸氢盐转化
亚硫酸氢钠用于将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。相比之下，甲基化的胞嘧啶则不会被转化。因此，经亚硫酸氢盐处理后的PCR扩增产物在最终测序中检测到的所有胞嘧啶均代表原本甲基化的胞嘧啶。
亚硫酸氢盐转化会导致DNA显著降解，这可能成为PCR分析的限制因素。使用Qiagen的EpiTect Bisulfite试剂盒，可实现优化的反应条件，最大限度地提高胞嘧啶的转化率，减少DNA片段化，并在较低温度下仍保持单链DNA状态。据我们经验，从显微切割组织中纯化的约200 ng DNA即可为亚硫酸氢盐反应提供足够的起始材料。
为防止转化反应效率的差异，实验中所有样本的模板DNA用量应保持一致。此外，应通过检查非CpG位点的未转化率来严格评估测序读段的转化效率。该比率应超过98%。较低的数值表明亚硫酸氢盐转化不完全或效率低下，相应的序列应从分析中剔除。
5. 亚硫酸氢盐 PCR
- 设计特异性针对亚硫酸氢盐转化后DNA的测序引物（见讨论部分）；Methyl Primer Express软件（https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=602121）可辅助引物设计，并有助于在预实验中确定最佳退火温度。
- 按以下组分配制PCR主混合液（单个反应）：
2.5 μl 10x PCR缓冲液
0.5 μl 10 mM dNTPs
1 μl 10 μM 正向引物
1 μl 10 μM 反向引物
0.125 μl Qiagen Hotstart Taq Plus
用H2O补至23 μl - 向反应体系中加入2 μl亚硫酸氢盐处理后的DNA。
- 按以下条件进行扩增：
1个循环：95 °C，6分钟
45–50个循环：95 °C，1分钟；最佳退火温度，1分钟；72 °C，1分钟
1个循环：72 °C，5分钟
取7 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以验证扩增片段的大小，并使用 commercially available PCR纯化试剂盒（例如Macherey-Nagel Nucleospin Extract）对剩余PCR反应产物进行纯化，用于后续连接反应。若出现额外的非目标PCR产物，建议进行凝胶纯化。
6. 亚硫酸氢盐测序
通过单克隆测序获得的高分辨率DNA甲基化谱能够检测DNA甲基化的微小变化，并鉴定对处理（环境编程）有响应的调控区域。亚硫酸氢盐测序过程包括三个连续的操作步骤：首先，将前期亚硫酸氢盐PCR获得的PCR产物连接至载体并转化入细菌中；其次，对单个克隆进行菌落PCR，以确定插入片段的正确大小；第三，对阳性菌落PCR产物进行纯化后，进行Big-Dye测序反应。经过纯化步骤后，产物在毛细管测序仪上进行电泳分析。
6.1 连接与转化
注意：我们常规使用pGEM-T载体克隆试剂盒（Promega）。根据我们的经验，克隆效率在很大程度上取决于待连接的插入片段。如果反复获得较少数量的重组克隆，应尝试不同的载体。
- 设置连接反应：
5 μl 2x 连接缓冲液
1 μl pGEM-T 载体
1 μl T4 连接酶
3 μl 纯化后的 PCR 产物 - 用移液器混匀反应体系，在 4 °C 过夜孵育。
注意：也可在室温下反应 1 小时。为增加重组克隆的数量，推荐在 4 °C 过夜连接。 - 通过乙醇沉淀法纯化连接产物：
- 向连接反应体系中加入 1 μl 糖原、1 μl 3M 醋酸钠和 25 μl 100% 乙醇，于液氮中沉淀 1 分钟。
- 离心（15,0000 g，4 °C，30 分钟），弃上清。
- 用 300 μl 70% 乙醇洗涤，离心（15,000 g，4 °C，20 分钟），弃上清，室温干燥沉淀（10 分钟）。
- 将沉淀重悬于 10 μl H2O 中。
6.2 将连接产物转化至电转感受态细菌中
- 将电穿孔杯（1 mm 宽度）置于冰上预冷，并将一份电转感受态 DH5α 菌在冰上解冻。
- 将 45 μl DH5α 菌加入 10 μl 纯化后的连接产物（见上文）中，混匀后转移至电穿孔杯中。
- 在 1.5 kV、200 Ω、15 μF 条件下进行细菌转化，电击后立即加入 1 ml 预热的 SOB 培养基。
- 在 37 °C 下复苏细菌 1 小时，取 100 μl 菌液涂布于含有氨苄青霉素并涂有 IPTG/X-Gal 的 LB 平板上。
- 将平板在 37 °C 下过夜培养。
6.3 菌落 PCR
注意： 对单克隆进行菌落 PCR 以确认插入片段具有预期大小。蓝/白筛选中颜色发育延迟、连接过程中发生非预期的重组事件、引物二聚体的形成或截短的 PCR 产物均可能导致测序结果错误。我们通常使用 T7 和 SP6 引物扩增克隆插入片段；此方法会额外扩增出约 150 bp 的载体序列。在后续步骤中，测序反应将使用 T7 引物。
- 在96孔板中设置菌落PCR反应。每个反应使用：
3 μl 2.5 mM MgCl2
2.5 μl 10x Taq缓冲液
1.5 μl 10 mM dNTP
2 μl 2.5 mM T7引物
2 μl 2.5 mM SP6引物
1 μl Fermentas Taq DNA聚合酶
用H2O补足至25 μl - 将25 μl主混合液加入96孔板的每个孔中。
- 用移液器吸头挑取平板上的阳性（白色）克隆，并浸入PCR反应液中。
- 使用以下条件进行扩增：
1个循环：95 °C下4分钟
10个循环：94 °C下30秒，56 °C下30秒，72 °C下30秒
30个循环：94 °C下30秒，48 °C下30秒，72 °C下30秒
1个循环：72 °C下5分钟 - 取5 μl菌落PCR产物上样至琼脂糖凝胶，确定含有正确插入片段大小的反应。
- 使用市售试剂盒（Macherey Nagel Nucleofast）对含有目标扩增产物的菌落PCR产物进行纯化。
6.4 大片段染料终止反应与测序
- 准备Big-Dye反应的主混合液。每次反应使用：
1 μl H2O
0.5 μl Big-Dye试剂
1.5 μl测序缓冲液 - 将3 μl主混合液加入96孔板的每个孔中，每孔再加入2 μl纯化后的菌落PCR产物，并在PCR仪上按照以下程序运行反应：
96 °C孵育1分钟，1个循环
96 °C变性10秒、50 °C退火5秒、60 °C延伸4分钟，共35个循环 - 使用商业化试剂盒（Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit）对Big-Dye反应产物进行纯化，随后在毛细管测序仪（例如ABI 3100 DNA）上进行测序分析。
- 使用Biq Analyzer（http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/）或在线工具BISMA（http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/）分析测序结果，以获得目标DNA区域的甲基化模式（图4）。
7. 代表性结果
为了深入了解早期生活应激（ELS）对Avp基因表达及甲基化状态的影响，按照上述流程处理C57BL/6N小鼠。简言之，一组C57BL/6N小鼠接受早期生活应激处理，而对照组小鼠则不予干扰。分别对室旁核（PVN）和视上核（SON）进行脑区穿孔取样，并从单个穿孔样本中同时提取DNA和RNA。将RNA逆转录为cDNA，通过qPCR分析检测Avp转录本水平，并以Hprt和Gapdh两个看家基因的表达量进行标准化。DNA经亚硫酸氢盐处理后，使用针对Avp增强子区域的特异性引物进行扩增（图4a），将PCR产物克隆并测序。每只小鼠/每次PCR至少分析20个重组克隆，以确定PCR扩增片段中所含CpG位点的甲基化频率（图4b）。与对照组相比，早期生活应激在Avp增强子的CpG10、CpG12、CpG13和CpG14位点诱导了显著的低甲基化（p < 0.05，n = 6–8只动物），提示该调控区域可通过早期生活经历产生表观遗传标记。与PVN不同，在SON中，Avp增强子的甲基化水平不受早期生活应激的影响，表明表观遗传标记具有组织特异性（图4c）。在对照组动物（n = 6）中，对CpG10位点的DNA甲基化状态与Avp基因表达水平的分析显示二者呈负相关，提示DNA甲基化在精细调控AVP基因表达中发挥一定作用（图4d）。
图1. 从小鼠脑组织解剖后获取对照组和早期生活应激小鼠的显微穿孔样本。在分离DNA和RNA后，通过qRT-PCR检测基因表达水平，而经亚硫酸氢盐处理的DNA则进行扩增，纯化产物克隆至合适的载体中，利用蓝白斑筛选鉴定重组克隆。通过菌落PCR验证插入片段大小正确后，进行Big-Dye反应并在毛细管测序仪上进行分析。使用适当的软件工具可视化甲基化模式。 点击此处查看大图。
图2. 从DNA/RNA提取到亚硫酸氢盐测序的时间线。
图 3. DNA 与 RNA 同时提取的工作流程。将下丘脑室旁核（一个微小的表达 Avp 基因的脑区）组织穿孔样本置于 400 μl GTA 缓冲液中，涡旋振荡至完全裂解，再通过注射器（29G）反复抽吸进一步匀浆。随后将匀浆液分装，用于RNA和DNA的纯化。分装比例可为1:1或其他比例，具体取决于特定的实验需求。匀浆样品应在数小时内完成处理。
图4. 6周龄对照组与早期生活应激（ELS）动物在Avp基因座的CpG甲基化情况。（A）Avp基因与oxytocin基因尾对尾排列的示意图，两者由基因间区域（IGR）分隔。外显子以带编号的空心方框表示。CpG残基的分布情况已标出，包含CpG10至CpG14的PCR扩增子的位置和大小以粗线标记。（B）对照组与ELS动物下丘脑室旁核（PVN）中Avp增强子的甲基化水平（n = 6–8）。（C）对照组与ELS动物下丘脑视上核（SON）中Avp增强子的甲基化水平（n = 8–10）。（D）Avp基因表达水平与CpG10位点甲基化程度的相关性分析（n = 6）。 点击此处查看高清大图。
讨论
表观遗传编程在健康与疾病中的重要作用正日益受到重视。本文介绍一种改进的方法，可从微小组织穿孔样本中同时分离DNA和RNA，并进一步通过亚硫酸氢盐测序获得DNA甲基化谱。优化后的实验流程便于研究环境刺激下大脑中表观遗传编程的变化。此外，由于在同一份样本中同时分析DNA甲基化与基因表达，该方法有助于探究二者之间的功能关联。最后，该策略可显著减少实验所需的动物数量。
在执行本实验流程时，应遵循特定的预防措施和指导原则。鉴于大脑具有极高的复杂性和异质性，且甲基化与表达模式可能因细胞和组织类型而异，因此必须以标准化的方式进行显微切割。例如，Avp 的表观遗传编程仅在下丘脑的室旁核中被检测到，而在视上核中则未发现（图4b-d），尽管这两个区域均为下丘脑中表达 Avp 的区域4。在此方面，从同一组织穿刺样本中同时获得DNA和RNA具有优势，因为在某些情况下，可通过特定组织标志基因的RNA表达来确认所取区域的准确性。尽管显微切割可降低细胞异质性，但仍需注意，该方法并不能实现单一细胞类型或细胞群的分离。为解决这一问题，可考虑增加额外的纯化步骤。
对于亚硫酸氢盐测序，亚硫酸氢盐处理后用于PCR扩增的引物设计至关重要。由于亚硫酸氢盐处理会导致DNA降解，因此长度超过400 bp的PCR产物可能会带来问题。此外，若仅有少数完整的模板参与扩增过程，巢式PCR可能会产生偏差结果。应设计针对修饰后扩增片段特异的引物对；其序列中不应包含CpG二核苷酸，以避免甲基化偏向性扩增。同时，引物中应包含非CpG的胞嘧啶，以防止未修饰或未完全转化的DNA发生扩增。某些模板的扩增可能受益于热启动PCR。无论如何，均应在预实验中验证引物对的适用性，以避免珍贵实验样本的浪费。
亚硫酸氢盐测序是一种用于位点特异性甲基化分析的标准方法，因其能够可靠且精确地以等位基因特异性方式检测单个CpG位点的甲基化状态8。不建议直接对PCR产物进行测序，因为若某个CpG位点存在混合甲基化，则在电泳图谱中会表现为C/T双峰，从而阻碍对该位点甲基化程度的定量分析。因此，通常需增加一个中间克隆步骤，并对多个克隆（约20–30个）进行测序，以确定甲基化的程度。焦磷酸测序是另一种定量DNA甲基化的方法。该方法同样利用亚硫酸氢盐转化和亚硫酸氢盐PCR，但无需克隆，而是将扩增产物直接用于焦磷酸测序反应，其中CpG位点的甲基化状态表现为C/T单核苷酸多态性，可被轻松定量。两种方法检测到的甲基化水平相似9，但由于焦磷酸测序省去了克隆步骤，因此更节省时间。然而，受限于模板长度，每次仅能测序40–100个核苷酸，因此需要使用不同的测序引物进行多轮测序。这一限制尤为关键，因为焦磷酸测序需要较多的DNA模板（每反应约1 μg），而从微小的脑组织穿孔样本中获取的DNA量通常难以满足该要求。因此，对于数个千碱基范围内的区域，采用焦磷酸测序进行初步扫描似乎不如单克隆测序合适。但在确定了较小的目标区域后，应考虑使用焦磷酸测序。
综上所述，上述方案为快速、经济地分析脑组织微穿孔样本中的表观遗传学变化提供了一种准确、高效且简化的途径。单次实验可同时处理多个样本，该方法适用于中等规模实验的样本检测。
致谢
本工作由马克斯·普朗克精神病学研究所和欧盟玛丽·居里初始培训网络（NINA 合同编号 238665）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒 | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| EpiTect 亚硫酸氢盐试剂盒 | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T 载体克隆试剂盒 | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| 96孔测序纯化 | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq 聚合酶 | Qiagen | 203203 | |
| Taq 聚合酶 | Fermentas | EP0401 |
参考文献
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