本报告中，我们描述了一种用于分离高度纯化的肿瘤浸润白细胞群体的实验方案。该方案改编自 Miltenyi Biotech 的实验流程，旨在提高从复杂肿瘤组织中分离细胞的得率和纯度。
本文内容
Retraction Notice
This article, Isolation of Immune Cells from Primary Tumors, has been retracted at the request of the corresponding author due to concerns regarding the validity of the data presented in the article.
摘要
摘要
肿瘤会形成一种独特的免疫抑制性微环境（肿瘤微环境，TME），通过多种趋化因子和生长因子将白细胞募集至肿瘤部位。 1,2然而，一旦进入肿瘤微环境（TME），这些细胞便失去促进抗肿瘤免疫的能力，转而支持肿瘤生长并下调抗肿瘤免疫反应。 3-4对肿瘤相关白细胞的研究主要集中于从肿瘤引流淋巴结或脾脏中分离的细胞，这是因为从原发性肿瘤中获取足够数量和纯度的细胞存在固有困难。尽管明确肿瘤荷瘤小鼠淋巴系统中细胞活化与迁移机制对于理解抗肿瘤免疫反应的动力学具有重要意义，但根据我们的经验，肿瘤引流淋巴结中的许多白细胞（包括树突状细胞，DCs）其表型与浸润肿瘤的白细胞存在差异。 5,6 此外，我们先前已证明，从肿瘤引流淋巴结中分离并过继转移的T细胞未被耐受化，且能够对再次刺激产生应答。 体外 与从肿瘤微环境（TME）中分离的T细胞不同，后者处于耐受状态，无法增殖或产生细胞因子 7,8有趣的是，我们已经证明，改变肿瘤微环境，例如提供 CD4+ 通过过继转移的辅助性T细胞，促进CD8+ T细胞维持促炎性效应功能 5上述各项研究的结果均表明，测量肿瘤微环境（TME）中浸润的免疫细胞的细胞反应，相较于仅分析外周循环中残留的细胞，具有更为重要的意义。为利用Miltenyi Biotech分离系统研究浸润肿瘤的免疫细胞功能9我们对该基于抗体的分离方法进行了改进和优化，以获得高度富集的抗原提呈细胞和肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞群体。该方案包括从小鼠自发性前列腺肿瘤模型（转基因小鼠前列腺腺癌 - TRAMP）中详细解剖小鼠前列腺组织 10 以及皮下黑色素瘤（B16）肿瘤模型，随后纯化多种白细胞群体。
方案
1. 从 TRAMP 前列腺肿瘤中分离髓系细胞
- 所有操作均在动物伦理审查委员会的指导下进行。TRAMP 小鼠由于携带由前列腺素启动子调控的 SV40 转基因，会自发形成同源性前列腺肿瘤10。任何雄性小鼠均可用于本实验。虽然 TRAMP 肿瘤可在任意年龄收获，但需注意的是，TRAMP 前列腺肿瘤通常在小鼠年龄超过 20 周之前保持较小体积。通过 CO2 窒息法处死小鼠。切开腹腔并拨开脂肪组织，取出泌尿生殖道（UGT）。脂肪组织呈泡沫状、有光泽的组织。
- 定位膀胱；它位于两个较大的白色精囊之间。用镊子夹住膀胱。保持剪刀闭合，轻轻拨开脂肪组织并找到尿道。尽可能靠近骨盆带处沿尿道向下剪开，并切断输精管。在剪切的同时，同步向上牵拉膀胱。这样即可完整释放 UGT，随后可通过显微解剖分离出前列腺的各个叶。
- 将 UGT 置于室温 PBS 中。使用解剖显微镜观察 UGT，并清除多余的脂肪组织。用镊子夹住尿道，收集前列腺的腹侧叶、外侧叶和前叶。在继续收集其余叶的同时，将已获取的组织暂时置于 PBS 中。
- 移除精囊并弃去。
- 将剩余组织旋转 180°，收集壶腹腺和背侧前列腺叶。
- 用镊子将前列腺组织轻轻分离，并将其放入消化（解离）缓冲液中。
- 将肿瘤组织置于 1 ml 解离缓冲液中（含 100 U/ml IV 型胶原酶和 100 μg/ml DNase 的 RPMI + 10% FBS）。不同肿瘤可能需要不同的解离条件；对于 TRAMP 前列腺肿瘤，使用 1 ml；对于 B16 肿瘤，使用 5 ml（见下文）。注意：胶原酶的类型（I–IV 型）取决于目标分离的细胞群体；分离髓系细胞时推荐使用 IV 型，而分离淋巴细胞时 I 型可获得更高得率。
- 将离心管置于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
- 使用 1 ml 移液器反复吹打，获得易于流动的单细胞悬液。
- 将悬液通过 70 微米滤膜过滤，并用补充了 10% FBS 的 MACs 分离缓冲液洗涤 3 次，用于髓系细胞的分离。
- 以 400 ×g 离心 10 分钟。然后用 10 ml MACs 缓冲液重悬沉淀，并以相同条件再次离心。
- 将细胞沉淀重悬于 100 μl MACs 缓冲液中。随后，每 108 个细胞加入 1 μg 抗 CD16/32 抗体（Ab）（200 μl 2.4.G2 杂交瘤培养上清），室温孵育 10 分钟。注意：FcR-γ 阻断抗体（Ab）的用量可能因组织中 FcR-γ+ 细胞的频率/数量及细胞悬液体积而异；因此，此步骤可能需要优化。
- 根据目标细胞群体，每 108 个总细胞加入 100 μl “Pan-DC” 或 10 μl 抗 CD11b、抗 CD11c 或抗 PDCA-1 MicroBeads。注意：所需 MicroBeads 的用量可能因目标细胞群体在组织中的频率/数量而异；因此，此步骤可能需要优化。
- 轻轻弹击离心管充分混匀（切勿涡旋），在 4–8 °C 避光孵育 15 分钟。切勿在冰上孵育。
- 加入 10 ml MACs 缓冲液洗涤细胞。以 400 ×g 离心 10 分钟。
- 完全倾去上清液，将细胞重悬于 500 μl MACs 缓冲液中。肿瘤细胞悬液更易通过 LC 柱（其他可选型号：MS、LS、LD）。
- 将一根新的柱子安装至磁力分选器上。用所选柱子推荐量的 MACs 缓冲液预洗柱子：LC 和 MS 柱使用 500 μl，LS 或 LD 柱使用 1 ml。预洗后，将细胞悬液加至柱子顶部。每 1 × 108 个细胞使用一根柱子。
- 收集未标记细胞（流穿组），并用 500 μl 缓冲液至少洗涤柱子三次（最多五次），总洗液体积为 1.5–2.5 ml。第一步洗涤：向柱子中加入 MACs 缓冲液；保持柱子持续流动至关重要。一旦柱子滴下最后一滴液体，立即加入更多缓冲液。切勿让柱子静置无流动或干涸（这一点再强调也不为过，因为柱子干涸会严重影响纯度并导致细胞活力显著下降）。第二步洗涤：用解离缓冲液混合液（含胶原酶 + DNase，如步骤 1.7 所述）冲洗柱子；此为“较剧烈”洗涤步骤，用于清除死亡或濒死肿瘤细胞的黏附性碎片。第三步洗涤：使用 MACs 缓冲液；若第三步洗涤后流出液仍未完全澄清，继续用 MACs 缓冲液再洗涤 2 次（共 5 次洗涤）。对于较大的皮下肿瘤（如 B16 黑色素瘤），在最后一次洗涤时，用戴手套的手指轻轻按压柱子顶部，以释放额外碎片，获得更纯净的细胞群体。此步骤不适用于前列腺等实体组织肿瘤；对于此类组织，应增加洗涤次数，至少洗涤 5–6 次。
- 从磁力分选器上取下柱子，置于合适的收集管上。向柱子中加入 2 ml 缓冲液。使用随柱提供的推杆用力推压，收集磁性标记的细胞。
- 计数细胞数量，并通过流式细胞术分析确认所选细胞群体的纯度。用于鉴定树突状细胞（DC）群体的推荐标志物包括 CD45、CD11c、PDCA-1、B220 和 CD11b。推荐的巨噬细胞标志物包括 CD45、CD11b、F4-80 和 Ly6C。
2. 从小鼠皮下B16黑色素瘤肿瘤中分离过继转移的T细胞
该方案最适合用于面积不超过 250 mm2 的肿瘤（通过测量肿瘤的垂直直径进行估算）。
- 将 B16 肿瘤细胞皮下注射至 C57BL/6 小鼠体内，每 2 天记录一次肿瘤大小 8。当肿瘤大小达到 250 mm2 时，采用 CO2 窒息法对小鼠实施安乐死。使用经高压灭菌并用 70% 乙醇冲洗过的手术器械，将肿瘤切成小块（< 3 mm），置于 5 ml 解离液（含 5% FBS、胶原酶 I 型（200 U/ml）和 DNase I（100 μg/ml）的 RPMI 培养基）中，在 37 °C 下孵育 30 分钟，孵育期间每 10 分钟用 1,000 μl 移液枪头吹打混匀并短暂涡旋。若后续需分离髓系细胞，则分别以 10% FBS 和胶原酶 IV 型（200 U/ml）替代 5% FBS 和胶原酶 I 型。
- 孵育结束后，将细胞悬液通过 70 μm 细胞滤器过滤，并用 10 ml MACs 缓冲液（按 Miltenyi Biotech 说明书配制）洗涤两次。可选步骤——对于非常大的肿瘤（>300 mm2），可通过密度梯度离心法（Percoll 或 Ficoll）预先富集炎性细胞。
- 吸除洗涤上清液，加入 1 μg 抗 CD16/32 抗体/108 个细胞（200 μl 克隆 2.4.G2 的培养上清液），室温孵育 10 分钟。
- 无需洗涤，直接加入 1 μg 抗 Thy1.1 PE 抗体/108 个细胞，轻轻弹动管壁混匀，避光冰上孵育 30 分钟。
- 加入 10 ml MACs 缓冲液洗涤细胞以去除未结合的一抗，400 xg 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，按制造商说明，每 107 个总细胞加入 20 μl 抗 PE 磁珠（Miltenyi Biotech）。
- 轻轻弹动管壁充分混匀（切勿涡旋），避光于 4 °C 孵育 15 分钟（不可使用冰浴）。注意：涡旋可能破坏磁珠完整性。
- 加入 10 ml MACs 缓冲液洗涤细胞，400 xg 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将细胞重悬于 500 μl MACs 缓冲液中。对于较大肿瘤（>300 mm2），使用 1 ml 缓冲液。
- 将一个 LC（大细胞）柱置于磁性分离器中。肿瘤细胞悬液最适宜通过此类柱子。用 500 μl MACs 缓冲液冲洗柱子以预平衡。大多数肿瘤也可通过 LS 和 LD 柱，但需进一步消化和机械解离以获得足够水平的单细胞悬液。用 1 ml MACs 缓冲液冲洗柱子以完成预平衡。
- 将细胞悬液加至柱上，使其完全流过柱子 （切勿让柱子干涸）。随后用 500 μl MACs 缓冲液洗涤，重复洗涤 3 次。仅当柱子储液槽排空后才可加入新的缓冲液，但切勿让柱子在无流动状态下静置。否则会导致堵塞并降低纯度。
- 对于较大的皮下肿瘤，此为关键步骤：最后一次洗涤后，仍保持柱子在磁性分离器上，用戴手套的手指轻压柱子顶部施加轻微压力。此举可释放额外碎片，从而获得更高纯度的富集细胞群。随后再用 500 μl MACs 缓冲液洗涤柱子一次。
- 从分离器上取下柱子，放入洁净的 15 ml 圆底离心管中，向柱子中加入 2 ml MACs 缓冲液。用力推动推杆穿过柱子，冲洗出磁性标记的细胞。
- 将洗脱组分在 400 xg 下离心 5 分钟。此步骤所得纯度通常为 75–80%。若需获得 >90% 的纯度，使用新的 MS 柱重复磁性分离步骤（如步骤 1.10–1.12 所述）。MS 柱体积更小、结构更紧凑，因此悬液流速较慢，但可获得更高数量和纯度的目标细胞。
- 计数细胞数量用于后续实验，并通过流式细胞术分析检测纯度。对于本方案所述的过继转移 T 细胞的分离，可用于鉴别的等位基因标记包括 CD45 和 Thy1.1（转移细胞）以及 Thy1.2（宿主 T 细胞）。
3. 代表性结果
特定细胞群体（如巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等）的得率将取决于肿瘤的大小以及肿瘤生长期间所施用的治疗措施。根据上述分离方案，从一只未经处理的14至16周龄TRAMP小鼠的前列腺中，每300 mg组织可获得8×105–1×106个CD11c+/PDCA-1+（树突状细胞）细胞，纯度为90–95%；或获得1×106–1.5×106个F4/80+/CD11b+（巨噬细胞）细胞，纯度为80–90%，结果如图1所示。在过继转移肿瘤抗原特异性T细胞后，这些细胞的数量略有增加。纯度较低通常是因为洗涤不充分、让层析柱干燥（可能导致肿瘤碎片滞留在柱中）或Fc受体阻断不充分所致。
同样，从 B16 肿瘤中分离的总细胞数量也会因组织收获时及过继性 T 细胞转移（转移 5×106 个细胞）时的肿瘤大小而异，无论是否同时给予树突状细胞（DC）疫苗（转移 1×105 个细胞）。除非在 T 细胞转移后一天内给予抗原致敏的 DC 疫苗，否则极少有抗原特异性 T 细胞浸润肿瘤。如果向携带较小、可触及（< 50 mm2）肿瘤的小鼠施用 DC 疫苗，则如图 2A所示，获得约 3×105 个 Thy1.1+ T 细胞、纯度达 80–85% 可被视为一次“良好”的收获。然而，若收获较大肿瘤，总产量和纯度均会降低。
巨噬细胞（F4/80+/CD11b+）在B16肿瘤的总细胞中通常占比较小。图2B显示，从面积为250 mm2的肿瘤中利用CD11b分离可获得约1×106个巨噬细胞，纯度为90–95%。此外，图2B显示B16肿瘤中的树突状细胞（DC）群体具有异质性。与前列腺肿瘤不同，可从B16黑色素瘤肿瘤中获得两个亚群：CD11c+/PDCA-1+（浆细胞样DC）和CD11c+/PDCA-1-（传统DC）。预计从250 mm2的B16肿瘤中可获得约2×106个pDC和4×106个cDC，纯度为80–90%。纯度降低通常是由于未将肿瘤细胞从柱中充分清除所致。第2.12步是去除滞留在柱底部的少量黑色素瘤细胞团块的关键步骤。完成此步骤可提高后续洗涤步骤的效率，并获得更高的纯度。
图1. 从TRAMP前列腺肿瘤中分离出树突状细胞（DCs，CD11c+/PDCA-1+）和巨噬细胞（F4/80+/CD11b+）。点图数值表示纯化前或纯化后目标细胞的百分比。
图2. （A）过继转移的Thy1.1+/CD8+ T细胞，以及（B）髓系细胞（包括CD11c+/PDCA-1+浆细胞样树突状细胞、CD11c+/PDCA-1-经典树突状细胞和F4/80+/CD11b+巨噬细胞）从Thy1.2+小鼠的皮下B16黑色素瘤中分离获得。点图数值表示纯化前或纯化后目标细胞所占的百分比。
讨论
根据肿瘤的大小和来源（皮下、自发性肿瘤或原位肿瘤），可对本方案进行相应调整。对于较大的肿瘤，建议增加解离缓冲液、MACs缓冲液的用量以及洗涤次数。所分离细胞的耐受性可能取决于其富集来源的肿瘤微环境（TME）。例如，根据我们的经验，从自发性前列腺肿瘤中分离的细胞相较于从皮下B16黑色素瘤中分离的细胞，需要更温和的解离条件。在肿瘤解剖过程中，应尽可能去除脂肪组织、皮肤或其他杂质，以免影响酶解的效率。彻底消化肿瘤组织并获得单细胞悬液至关重要，这有助于确保抗体标记的准确性，并防止分离柱堵塞。在髓系细胞分离过程中，为提高细胞活力，MACs分离缓冲液中胎牛血清的推荐浓度已从2%提高至10%。在整个操作过程中，保持所有缓冲液和细胞处于低温状态也至关重要，以避免非特异性抗体结合和分离柱堵塞。综上所述，为获得高度富集的抗原呈递细胞及肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，我们对基于抗体的分离方法进行了改进和优化，该方法采用美天旎生物技术（Miltenyi Biotech）的技术平台。利用本方案，可通过针对细胞类型特异性表面标志物的抗体，富集过继转移的和内源性的白细胞群体。本方法的优势之一是在充分且严格的洗涤后显著减少了肿瘤碎片的残留。这包括在洗涤缓冲液中使用胶原酶，以及确定在分离柱上施加额外压力以消除肿瘤细胞导致的堵塞的最佳时机。从组织中获取足够数量且纯度满足功能分析要求的免疫细胞通常是一项具有挑战性的任务。然而，根据我们的经验，本方案在细胞得率、纯度和重复性方面均达到了最佳水平。
披露
作者没有相关利益冲突声明。
致谢
作者感谢 Scott Durham 博士对稿件和视频的审阅。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所（NCI）院内研究项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶 I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | 用于T细胞筛选 |
| 胶原酶 IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | 用于髓系细胞筛选 |
| 脱氧核糖核酸酶（DNase） | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| 胎牛血清 | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs 缓冲液 | T细胞使用含2% FBS的缓冲液 髓系细胞使用含10% FBS的缓冲液 | ||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| 抗PE磁珠 | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| 抗全树突细胞（Pan DC）磁珠 | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| 抗CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC 分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS 分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
参考文献
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