确定学龄儿童土壤传播性蠕虫感染状况与身体素质

摘要

长期感染土源性蠕虫（STHs）会导致生长发育期儿童出现营养吸收不良、生长迟缓和消瘦。因此，这些感染也可能降低儿童的身体素质。本文展示了两种用于诊断土源性蠕虫感染的技术，以及用于评估儿童身体素质的20米往返跑测试。

摘要

土壤传播的蠕虫（STH）感染十分常见。事实上，全球有超过10亿人受其影响，主要集中在贫困普遍、卫生习惯不良、供水和卫生设施常常不足的发展中国家^1,2。Ascaris lumbricoides、Trichuris trichiura以及两种钩虫Ancylostoma duodenale和Necator americanus是最常见的STH种类³。据估计，钩虫病、蛔虫病和鞭虫病所导致的全球疾病负担分别为2210万、1050万和640万伤残调整生命年（DALYs）⁴。此外，约有3000万至1亿人感染了Strongyloides stercoralis，这是全球范围内最受忽视但具有重要意义的STH种类，其对公共卫生的影响不容忽视^5,6。多种蠕虫共感染（即同一感染者体内同时存在不同种类的STH）十分普遍，且这些感染已被证实与劳动生产率下降相关，从而影响发展中国家的经济前景^1,3。

对于常见土源性蠕虫病的诊断，世界卫生组织（WHO）推荐使用Kato-Katz法^7,8，这是一种相对简便的方法，用于确定此类感染的流行率和感染强度。该方法有助于检测感染者粪便中排出的寄生虫虫卵。

关于S.stercoralis的诊断，目前尚无简单且准确的检测工具。巴曼法（Baermann technique）是目前应用最广泛的方法。该方法的原理是，由于S.stercoralis幼虫具有趋光性⁹，在光照条件下，活的幼虫会从新鲜粪便样本中迁移出来。与培养法和免疫学方法相比，该方法对实验设备的要求较低，且耗时更短⁵。

与土壤传播的蠕虫感染（STH）相关的疾病范围从腹痛、腹泻和瘙痒等常见但急性症状，到贫血、营养不良、体重不足以及认知功能障碍等慢性症状¹⁰。由于这些症状通常不具特异性且较为轻微，常被忽视，感染者可能将其视为正常状态，或误认为是其他在特定环境中更常见疾病的症状。因此，可以推断，依赖于个体自述症状和体征的评估工具往往会低估STH感染的真实疾病负担，而基于人群的调查通常正是采用此类方法。

20 世纪 80 年代末至 90 年代初，Stephenson 及其同事指出，土壤传播的蠕虫（STH）感染可能降低 6 至 12 岁男童的身体素质^11,12。近年来，这一科学探索方向重新获得了关注^13,14,15。20 米（m）往返跑测试由 Léger et al.¹⁶ 开发并验证，目前在全球范围内用于评估儿童的有氧适能¹⁷。该测试易于标准化，只要有 20 米长且平坦的跑道以及音频播放设备即可实施，因此在资源有限的环境中具有较高的应用价值¹³。为了促进并标准化评估 STH 感染对学龄儿童身体素质影响的研究，我们提供了一系列简单易行、同时又能提供准确且可重复结果的方法，用于诊断 STH 感染或测量身体素质。这将有助于生成关于 STH 感染健康影响的新证据。

方案

1. 加藤厚片法

1. 将一个标准的Kato-Katz模板（孔洞可容纳41.7毫克（mg）粪便）放置在显微镜载玻片上。
2. 用小勺取2-3克（g）新鲜粪便样本置于报纸或铝箔纸上，然后将一块金属丝网或塑料筛网压在样本上进行过筛。
3. 使用小型塑料刮刀将筛过的材料从筛网上刮下，并完全填满Kato-Katz模板上的孔洞。用刮刀刮平孔洞表面，以去除多余的粪便材料。
4. 垂直取下模板，避免扰动已粘附在显微镜载玻片上的粪便样本。模板和刮刀可用含洗涤剂的水清洗后重复使用。
5. 将一片预先在甘油-孔雀绿溶液中浸泡至少24小时（hr）的透明纸覆盖在载玻片上的粪便样本上。
6. 为将粪便材料涂布成厚涂片，用另一块干净的载玻片轻轻按压样本载玻片，使材料均匀展开，形成一个直径略小于载玻片宽度的圆形区域。
7. 将载玻片静置30-60分钟（min）以澄清样本，期间必须避免直接暴露于阳光下。随后在光学显微镜下（40-100倍放大）系统性地检查厚涂片，计数土壤传播蠕虫（STH）虫卵，并按虫种分类（即A.lumbricoides、T.trichiura和钩虫）。值得注意的是，该方法也可检测其他蠕虫卵（如Schistosoma mansoni），应单独计数并记录。
8. 为获得标准化的感染强度估计值（通常以每克粪便中的虫卵数（EPG）表示），将虫卵计数乘以24（24 × 41.7 mg ≈ 1 g）。

2. 贝尔曼法

1. 架设一个能够固定玻璃漏斗的支架，并在漏斗底部连接一段带有夹子的橡胶管。
2. 在漏斗中放置一个筛子或锥形金属网筛，并在其上铺一层医用纱布。
3. 用自来水注满漏斗，确保整个装置无泄漏。
4. 取20–30 g新鲜粪便样本，置于医用纱布中央，确保其完全浸没于水中；必要时可补充更多水。将纱布包裹住样本并折叠封好。
5. 从下方用人工光源照射漏斗，持续2小时。
6. 轻轻松开橡胶管上的夹子，将漏斗中下部50毫升（ml）水样缓缓排入离心管中。
7. 将收集的水样以600 × g（相对离心力）离心5分钟，小心倾去上清液，注意不扰动沉淀物，保留管底最后几滴液体。
8. 重新悬浮沉淀物，用移液器吸取2滴溶液滴加到显微镜载玻片上，置于光学显微镜下观察（检测时使用40倍放大，种属鉴定时使用100–400倍放大）。S. stercoralis 的第一期幼虫（L1）在显微镜下为活体，可观察到活跃运动。

3. 20米往返跑测试

1. 测量一段20米平坦且笔直的跑步路线，并用锥形标志物标记。
2. 协助测试参与者将心率监测器佩戴在手腕上，并将相应的发射器绑在胸部¹⁸。该设备可用于测量参与者在测试前后的心率，从而监测其是否已达到最大努力程度。
3. 指导参与者根据预先录制的声音信号节奏在跑道上来回跑动，声音信号用于界定每20米一个的往返段。起始跑步速度为8.5千米每小时（km/hr），此后每分钟声音信号提示20米间隔的频率递增，相当于速度每分钟增加0.5 km/hr。
4. 确保参与者每次听到信号时开始新的20米段，并在下一个信号出现前完成该段距离。
5. 若参与者连续两次未能跟上节奏完成20米段，则停止测试。
6. 记录参与者完整完成的最后一个20米段所对应的最大跑步速度，同时记录参与者的年龄和性别。
7. 确认测试结束时参与者达到的心率为其最大心率¹⁹。若未达到该心率，表明参与者可能未尽最大努力，因此应重复测试。
8. 使用Léger及其同事提出的一个公式估算参与者的最大有氧能力（VO₂ max）：VO₂ max = 31.025 + 3.238 * 速度（km/hr） - 3.248 * 年龄（岁） + 0.1536 * 速度（km/hr） * 年龄（岁）。

4. 代表性结果

在使用Kato-Katz法诊断土源性线虫病（STH）时，不同蠕虫卵的独特特征可用于鉴定大多数虫种²⁰。A.lumbricoides虫卵长约45–75微米（μm），宽约35–50 μm（图1），其壳壁比T.trichiura（图2）和钩虫（图3）的虫卵更厚。A.lumbricoides的受精卵（图1）具有外层蛋白膜，使其呈金棕色；而非受精卵则缺乏该外层膜，形态略呈长椭圆形，整体稍大。T.trichiura虫卵（长约50 μm，宽约22 μm，图2）呈长椭形，具有明显的极塞结构。而钩虫卵（长约64–76 μm，宽约36–40 μm，图3）具有极薄的壳壁，其内可见一圈清晰的环状结构，包围着位于虫卵中央的致密细胞团。

S. stercoralis L₁ 期幼虫（图4）长约 180–380 μm，口囊极短。可观察到明显的生殖原基（图4 中以蓝色箭头标示），幼虫尾部（图4 中以红色箭头标示）末端尖锐。

由于肠道寄生虫（STH）感染对儿童身体素质的真实影响仍在争论中^13,14,15，目前尚无具有代表性的结论性结果。20米折返跑测试结果的解读方式有多种。可在年龄、性别、其他潜在相关健康状况、社会经济地位及文化习惯等方面相似的感染者与非感染者之间，比较其儿童身体素质。这可通过横断面调查实现^13,14,15，即在特定时间点评估感染与非感染儿童的STH感染状态及其身体素质。若采用随机对照试验设计，对学龄儿童在驱虫剂/安慰剂治疗前后的身体素质进行评估，从而实现短期和长期效果的双重评价，则所得证据的强度更高。此外，还可进一步尝试识别STH感染强度与身体素质之间可能存在的剂量-反应关系，并将不同水平的多重寄生感染¹与身体素质进行比较。Yap及其同事的研究¹⁵显示，以最大摄氧量（VO₂ max）表示的身体素质，在感染毛首鞭形线虫（T.trichiura）的儿童中显著低于未感染T.trichiura的儿童（图5）。

图1. A.lumbricoides 虫卵的显微图像：受精卵（A）和未受精卵（B），放大倍数为500倍。比例尺 = 50 μm。

图2. T. trichiura 虫卵在500倍放大下的显微图像。 比例尺 = 50 μm。

图3. 500倍放大下钩虫卵的显微图像。比例尺 = 50 μm。

图4. S.stercoralis L₁ 幼虫在250倍放大下的显微图像。箭头指示尾部（红色）和生殖原基（蓝色）。比例尺 = 100 μm。

图5. 显示感染T. trichiura的儿童与未感染T. trichiura的儿童在体能水平上的比较图。

讨论

本文所述的三种方案已在中华人民共和国云南省西南部的布朗族少数民族群体中²¹，以及非洲不同地区^6,13,14进行了测试和实施。

Kato-Katz 技术有多种模板可供选择。每种不同孔径的模板会取用不同量的粪便样本。因此，在计算每克粪便虫卵数（EPG）时，必须明确模板的单位，以便将计数得到的虫卵数量乘以正确的换算系数，从而获得准确的 EPG 估计值。此外，当调查地区存在钩虫感染时，必须在制片后尽快读片（透明时间为 30 分钟，但最长不得超过 60 分钟）。主要原因是，在较高温度下，钩虫卵会迅速崩解²²。从研究对象排便到样本检测之间的时间间隔也至关重要，若间隔达到 3 小时或更长，Kato-Katz 技术对钩虫诊断的敏感性可能降低 50%²³。最后，为了提高 Kato-Katz 技术的诊断敏感性，特别是在土壤传播蠕虫感染强度较低的地区，应采集同一参与者的多份粪便样本，并对每份粪便样本制备双份或三份 Kato-Katz 厚涂片^7,24。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注：本列表中的材料为通用材料，可从不同来源获取。
Kato-Katz 试剂盒 [400 个塑料模板，每个模板上有一个直径为 6 毫米（mm）、厚度为 1.5 mm 的孔；400 个塑料刮刀；20 米长、80 目尼龙筛网；20 米长、34 μm 厚的亲水性玻璃纸]	Vestergaard Frandsen		请注意，该试剂盒不包含甘油-孔雀绿溶液，需从任意化学试剂供应商处单独购买。
玻璃漏斗 [约 8 厘米（cm）宽，6 cm 深]			用于贝尔曼法（Baermann technique）的玻璃漏斗应能容纳约 60 mL 水。橡胶管和纱布的尺寸取决于所用玻璃漏斗的类型。
生物显微镜	Olympus	CX21LED/CX21
离心机	上海医疗器械集团	80 - 2T
预录制信号	Bitworks Design	Team Bleep 测试版本 1.3.1	iPhone 应用程序
心率监测仪	POLAR	FT1	手表和发射器