视频眼动图是一种用于研究眼动功能及运动学习的高定量性方法。本文介绍了如何在小鼠中进行视频眼动图的测量。将该技术应用于正常、药物处理或基因修饰的小鼠，是探索运动行为潜在生理机制的有力研究工具。
本文内容
摘要
摘要
为了追踪物体或在运动过程中使视网膜上的图像保持稳定，眼球运动至关重要。像小鼠这样没有中央凹的动物，其将眼睛固定于目标的能力有限。与这类指向目标的眼球运动不同，补偿性眼球运动在无中央凹动物中很容易被诱发1,2,3,4。补偿性眼球运动由前庭和视动信息共同处理生成指令信号，进而驱动眼肌。前庭和视动信息的处理可以分别或联合进行研究，从而精确定位眼动系统中的功能缺陷。眼动系统可通过诱发视动反射（OKR）、前庭-眼动反射（VOR）或视觉增强型前庭-眼动反射（VVOR）来检测。OKR是一种反射性眼动，用于补偿视网膜上的“全视野”图像运动；而VOR是一种反射性眼动，用于补偿头部运动带来的影响。VVOR则是一种综合利用前庭和视动信息产生适当补偿的反射性眼动。小脑对这些补偿性眼动进行监测并能够对其进行调节。因此，眼动记录是研究正常及病理状态下（例如源于前庭、眼部和/或小脑的病变）脑-行为关系的强有力工具。
以眼动系统作为行为学研究范式进行测试具有多个重要意义。首先，眼动系统是一个神经机制较为明确的神经系统5。其次，眼动系统的结构相对简单6；其眼球的“球窝关节”结构（“单关节”）以及三对眼外肌限制了眼球运动的可能方式7。第三，该系统的行为输出和感觉输入易于测量，使其成为进行定量分析的理想模型8。许多其他行为学测试缺乏如此高水平的定量能力。最后，眼动系统的功能表现及其可塑性均可被检测，从而支持对学习与记忆过程的研究9。
如今，转基因小鼠已广泛可得，它们是研究不同层次脑功能的重要资源10。此外，它们还可作为模型用于模拟人类疾病。在正常、经药物处理或转基因小鼠中应用眼动图技术，是研究正常和病理条件下运动行为潜在生理机制的有力研究工具。本文中，我们描述了如何在小鼠中进行视频眼动图的测量8。
方案
1. 准备
以下实验均按照杜赫动物实验伦理委员会的规定进行。
- 准备小鼠进行视频眼动记录。为了测量小鼠的眼动，需要固定其头部。因此，在小鼠颅骨上构建一个基座结构（图1）。
- 通过异氟烷（异氟烷 1-1.5%；Rhodia Organique Fine LtD，法国）与氧气的混合气体在气体麻醉室中对小鼠进行麻醉。过量气体需进行回收。通过鼻罩维持麻醉状态。通过夹趾反应确认麻醉深度。
- 使用肛温探头和加热垫（FHC，Bowdoinham，ME）将小鼠体温维持在 37 °C。
- 使用眼膏（duratears，Alcon，比利时）覆盖眼睛以进行保护。剃除颅背侧毛发，并使用消毒液（碘伏或氯己定溶液）交替擦拭清洁手术区域。
- 沿中线做切口，暴露颅骨背侧表面。将表面清理干净并保持干燥。
- 在颅骨背侧表面从前囟至后囟区域滴加一滴磷酸酸蚀剂（磷酸酸蚀凝胶 37.5%；Kerr，CA），15 秒后去除酸蚀剂，并用生理盐水清洗颅骨表面，再次干燥。
- 在酸蚀处理后的颅骨表面滴加一滴 OptiBond 底涂剂（Kerr，CA），并用气流吹干 30 秒。
- 在 OptiBond 底涂剂上滴加一滴 OptiBond 粘接剂（Kerr，CA），然后用可见光照射固化 1 分钟（Maxima 480 可见光固化仪；Henry Schein，USA）。
- 在粘接层上覆盖一层薄薄的 Charisma 复合树脂（Heraeus Kulzer，德国）。将两个相连的螺母（直径：3 mm）嵌入树脂中，随后用光固化树脂。如有需要，可逐层添加更多树脂并逐层光照固化。
- 术后给予小鼠布托啡诺（0.015 mg/kg，皮下注射）以缓解疼痛。动物通常在约 5 分钟内恢复站立。手术后，让小鼠在室温下的饲养笼中至少恢复 3 天。
- 小鼠视频眼动记录系统设置（图2）。
- 将小鼠放入固定装置中，并通过两个螺丝将其头部固定在装置上（图1）。此操作无需麻醉小鼠。每日固定时间不应超过 1 小时。
- 将小鼠头身固定装置安装在 X-Y 平台上，该平台进一步安装于转台（直径：60 cm）之上。利用 X-Y 平台可将小鼠头部置于转台中心正上方。小鼠可在俯仰、偏航和滚动轴向上移动。通过 ISCAN 系统生成的眼部图像对准眼睛，以调整小鼠头部至正确的俯仰、偏航和滚动角度。或者，也可在立体定位仪框架中完成基座结构的安装11。
- 转台连接至交流伺服电机（Harmonic drive AG，荷兰），其位置由安装在转轴上的电位计（Bourns inc.，CA）监测。
- 一个带有随机点阵图案（每个元素 2°）的圆柱形环绕屏幕（直径：63 cm；高度：35 cm）覆盖转台；该圆筒也配备交流伺服电机（Harmonic drive AG，荷兰）。圆柱屏幕的位置由连接在其轴上的电位计（Bourns inc.，CA）监测，并可通过卤素灯（20 瓦）照明。环绕屏幕和转台均可独立驱动。
- 转台和环绕屏幕的运动由连接至 I/O 接口（CED limited，剑桥，英国）的计算机控制。台面和环绕屏幕的位置信号经过滤波（截止频率：20 Hz），由 I/O 接口数字化后存储于该计算机中。
- 小鼠眼睛由三个红外发射器（600 mW，发散角：7°，峰值波长：880 nm，RS components，荷兰）照明。其中两个红外发射器固定在转台上，第三个发射器安装在相机上。该第三个发射器产生一个参考角膜反射点（CR），用于校准过程及眼动记录期间的参考。
- 一台配备变焦镜头（Zoom 6000，Navitar inc.，NY）的红外 CCD 相机安装在转台上，并对准位于转台中心的小鼠头部。在校准过程中，相机可解锁并围绕转台轴精确偏转 20°。
- 视频信号由眼动追踪系统（ETL-200，ISCAN，Burlington，MA）处理。ISCAN 系统采用算法追踪瞳孔中心和参考角膜反射点（CR）的位置。该系统可在水平和垂直方向上以 120 Hz 的采样率追踪瞳孔和参考 CR。
- 参考 CR 位置、瞳孔位置和瞳孔大小信号由 I/O 接口数字化，并与台面及环绕屏幕位置信号存储于同一文件中。视频瞳孔追踪系统导致眼动信号延迟约 27 ms。
2. 使用视频瞳孔追踪技术校准和测量眼动
眼动追踪系统将瞳孔的运动捕捉为平移运动。被追踪瞳孔的平移运动包含一个由于眼球旋转中心与眼球解剖中心（即角膜曲率中心）之间存在轴向差异而产生的平移分量，以及一个由于眼球角向旋转而产生的旋转分量。通过从瞳孔运动/位置中减去参考角膜反射点（CR），可从信号中消除不需要的平移分量，从而得到仅由眼球旋转引起的平移运动。尽管头与相机之间的平移通常非常微小，该减法过程同样可消除这些平移。剩余的孤立平移运动通过以下校准方法8,12转换为眼球的角向旋转。此校准在任何眼动实验之前完成。
- 调整小鼠头部相对于摄像头的位置，使瞳孔的视频图像位于显示器中央，同时参考角膜反射（CR）的影像位于眼球垂直中线上，最好直接位于瞳孔正上方。为减少因摄像头绕轴旋转引起的参考CR移动，应将角膜曲率中心置于摄像头/载物台的旋转轴上。
- 围绕转台的垂直轴，将摄像头在±10°范围内多次旋转（即峰峰值20度）。利用摄像头旋转至极端位置时记录的瞳孔（P）和参考CR位置，计算瞳孔的旋转半径（Rp；Rp = Δ/sin(20°)；其中Δ=(CR-P)，见图3A）。
- 由于Rp值依赖于瞳孔大小，需实施瞳孔大小校正12（图3B）。在不同光照条件下（即改变瞳孔大小；图3C）重复步骤2.2多次，以确定瞳孔大小与Rp之间的关系，并绘制Rp校正曲线（图3D）。Rp值还受眼球垂直位置的影响。若实验中会引起垂直眼动，则强烈建议对不同垂直眼位进行校准修正13。
- 通过测量参考CR位置、瞳孔位置及瞳孔大小，确定眼球的角位置（E）。将瞳孔位置减去参考CR位置，得到消除平移影响的瞳孔位置。通过测量瞳孔大小，从Rp校正曲线中获取对应的Rp值，并利用以下公式计算E：E = arcsin{(Δ1)/Rp}（图4A；其中Δ1=(P2-P1)，P1和P2均已通过减去参考CR进行校正）。
- 现在可采用多种转台和/或周围屏幕旋转方案来刺激眼动系统。若需在暗环境中进行视频眼动记录，必须预先使用缩瞳药物处理小鼠眼睛，以限制瞳孔散大，从而在此类条件下实现瞳孔追踪。在本实验中，我们使用匹鲁卡品（4%，Laboratories Chauvin，法国）来抑制黑暗中的瞳孔扩张。
3. 数据分析
- 眼位、台面位置及周围屏幕位置均被转换为角位置（见图4B及2.4节中的公式）。眼动信号根据瞳孔追踪系统图像处理引起的27 ms延迟进行校正。
- 眼、台面和周围屏幕的角位置通过截止频率为20 Hz的巴特沃斯低通滤波器进行微分和滤波处理。
- 使用40°/s的检测阈值从眼动速度信号中去除眼跳。当信号跨越检测阈值时，从阈值前20 ms开始至阈值后80 ms结束的数据均被剔除。
- 利用轨迹中每个单独周期对台面、周围屏幕和眼动速度信号进行平均（图4C）。
- 将平均后的信号用适当的函数进行拟合。通常使用正弦速度刺激，平均周期则用正弦或余弦函数进行拟合（图4C）。随后，增益可计算为眼动速度与刺激速度的比值，相位则可计算为眼动速度与刺激速度之间的差值（以度为单位）。
4. 代表性结果
视频眼动图可用于研究多种形式的眼动功能（即视动反射：OKR；前庭-眼反射：VOR；视觉增强的前庭-眼反射：VVOR），以及运动学习（VOR适应；OKR适应）。OKR利用视觉反馈来补偿低频扰动。通过旋转照明充分的周围屏幕可诱发OKR（视频1）。当以0.2–1.0 Hz的频率范围、1.6°的振幅旋转周围屏幕时，可观察到视动系统在低频范围内的补偿效率高于高频范围（图5A）。VOR利用前庭器官的信号来补偿高频头部运动。通过在黑暗环境中旋转动物（即转台）可诱发VOR（视频2）。当以0.2–1.0 Hz的频率范围、1.6°的振幅旋转转台时，可观察到前庭-眼系统在高频范围内产生补偿性眼动的效率高于低频范围（图5A）。当视动系统与前庭-眼系统协同作用时，可在较宽范围的头部运动中将视网膜上的图像稳定化。在周围屏幕充分照明的条件下，以0.2–1.0 Hz的频率范围、1.6°的振幅旋转转台（视频3），可观察到在整个频率范围内眼动均产生“高增益”的补偿性运动（图5A）。所有这些增益和相位值在小鼠中具有典型性，尽管已有研究报道存在性别14和品系15,16,17差异。
独立控制转台和周围屏幕使我们能够使小鼠面临视觉信息与前庭信息之间的不匹配。在长期且一致地暴露于不匹配的视觉和前庭信息后，小鼠的前庭-眼反射（VOR）将发生变化，以补偿改变的视觉输入（VOR适应；视频4）。使转台与周围屏幕反相（即180°）旋转（1 Hz，1.6°）会增加VOR增益（图5B）。当采用单次学习范式时，VOR增益的最大变化通常在30分钟后达到。
图 1. 小鼠头部与身体固定装置的示意图。小鼠身体通过一个直径为 35 mm 的塑料圆管进行固定。通过将小鼠头骨基座用两枚螺丝连接至铁杆，从而实现头部的固定。铁杆呈 30 度角，以确保小鼠头部在行走状态时保持正常的俯仰角度。*，包含两个螺母的基座的顶视图。
图2. 小鼠视频眼动图装置的示意图。
图 3. 视频瞳孔追踪系统的校准。A) 摄像头围绕转台的垂直轴在 ±10° 范围内（即峰峰值为 20°）多次旋转。利用摄像头在旋转极端位置时记录的追踪瞳孔（P）和参考角膜反光点（CR）计算瞳孔旋转半径（Rp）。B) 瞳孔直径的半径取决于瞳孔的大小。C) 示例显示在校准过程中瞳孔大小对瞳孔位置的影响（均以像素（px）为单位测量）。D) 单只小鼠中 Rp 与瞳孔直径之间的关系。通过调节周围光照强度实现了十三种不同的瞳孔直径。
图 4. 使用视频瞳孔追踪技术测量和分析眼动。A) 瞳孔的角位置由瞳孔半径（Rp）和瞳孔位置（P；已校正角膜反射点位置）计算得出。B) 通过刺激前庭系统和视觉系统诱发的代偿性眼动示例（视觉增强的前庭-眼反射，VOR）。转台以 0.6 Hz 的频率正弦振荡，振幅为 1.6°，同时周围屏幕保持良好照明。C) B) 中记录数据的分析结果。图中显示转台（蓝色）和瞳孔（红色）的平均速度轨迹，这些平均轨迹通过正弦函数（黑色）进行拟合。
图5. 在一只C57Bl6小鼠中测量的眼动系统性能与学习能力。A) 眼球运动由周围屏幕的旋转引发（视动反射：OKR，上图），在黑暗中旋转小鼠引发（前庭-眼反射：VOR，中图），以及在光照下旋转小鼠引发（视觉增强型前庭-眼反射：VVOR，下图），刺激频率范围为0.2至1.0 Hz，振幅为1.6°。反射增益计算为眼动速度与刺激速度的比值（左图），反射相位由眼动速度与刺激速度之间的相位差计算得出（右图）。B) 通过采用反相训练范式自适应地增强VOR，实现运动学习。小鼠接受一种视听前庭联合训练范式，其中小鼠的旋转与周围屏幕的旋转相位相反（180°），两者均以1.0 Hz频率和1.6°振幅旋转，持续四十分钟。每10分钟测试一次VOR（1.0 Hz，1.6°）。在此小鼠中，反相训练使VOR增益增加。
视频 1. 显示诱导小鼠产生视动反应（OKR）范式的动画 点击此处观看视频。
视频 2. 显示诱导小鼠前庭眼反射（VOR）范式的动画。点击此处观看视频。
视频 3. 显示在小鼠中诱导 VVOR 范式的动画。点击此处观看视频。
视频 4. 动画展示诱导小鼠前庭眼反射（VOR）适应性增强的视觉-前庭刺激异相训练范式。点击此处观看视频。
讨论
为了获得高质量的小鼠眼动视频记录，需要满足若干条件。校准过程必须按照上述标准化方式进行。例如，在校准过程中若出现瞳孔未与参考角膜反射点（CR）对齐于垂直中线的偏心校准情况，将导致对参考位置（RP）的低估，从而引起眼动幅度的高估。此外，我们建议在校准过程中整合瞳孔大小校正方法12，因为实验中瞳孔大小保持高度稳定的情况极为罕见。即使在实验过程中存在轻微的应激因素，也可能显著改变瞳孔直径。
在设计眼动实验时，需要考虑或控制以下因素，因为这些因素已知会影响眼动反应：年龄13,18、性别14和品系15,16,19。此外，实验动物应具有色素性虹膜，因为在瞳孔与虹膜之间对比度过低时（如BALB/c小鼠），无法实现瞳孔检测与追踪。在实验前，极度紧张或焦虑的动物需要经过训练，以适应实验装置和固定状态。这种动物操作程序可减少或避免实验过程中眼睛的闭合或半闭合，并防止眼部分泌物的产生，从而实现更佳的瞳孔追踪效果。
最后，每只动物的数据采集与分析需要两到三个小时。因此，眼动记录很可能仍是一种针对特定小鼠的专门操作，不适合作为高通量筛选检测方法。
致谢
我们衷心感谢荷兰卫生研究与发展组织（M.D.J，C.D.Z）、荷兰科学研究组织（C.D.Z）、NeuroBasic（C.D.Z）、Prinses Beatrix 基金会（C.D.Z）、SENSOPAC（C.D.Z）、C7（C.D.Z）以及欧洲共同体的 CEREBNET（C.D.Z）项目提供的经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Rhodia Organique Fine LTD | ||
| 加热垫 | FHC | 40-90-8 | |
| 杜拉泰尔眼用润滑液 | Alcon | ||
| 磷酸凝胶 | Kerr | 31297 | |
| Optibond 底涂剂 | Kerr | 35369 | |
| Optibond 粘合剂 | Kerr | 35369 | |
| Charisma 复合树脂 | Heraeus Kulzer | ||
| Maxima 480 光固化仪 | Henry Schein | ||
| 交流伺服控制电机 | Harmonic drive AG | ||
| 圆柱形屏幕 | |||
| 卤素灯（20 W） | RS components | ||
| 精密电位计 | Bourns inc. | 6574 | |
| Power 1401（输入/输出接口） | CED limited | ||
| 计算机 | Dell | ||
| 红外发射器 | RS components | 195-451 | |
| ETL-200 | ISCAN | ||
| 变焦镜头（zoom 6000） | Navitar inc. | ||
| 硝酸匹鲁卡品（minims） | Laboratoire Chauvin |
参考文献
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