本实验的目的是确定并控制水溶液中自组装盘状两亲分子的尺寸、形状和稳定性。对于基于水相的超分子聚合物而言，实现这种程度的控制非常困难。我们采用了一种同时利用排斥作用和吸引作用的策略。用于表征该系统的实验技术具有广泛的适用性。
本文内容
摘要
摘要
对于水相超分子聚合物而言，同时控制其形状、尺寸和稳定性非常困难1。然而，考虑到功能软材料在电子学、生物医学工程和传感器等多个领域的应用，实现这种控制具有重要意义。过去，调控超分子聚合物尺寸和形状的成功策略通常集中在模板的使用2,3、端基封端剂4或选择性溶剂技术5上。
本文介绍了一种基于自组装盘状两亲分子的策略，该策略可实现对有序手性柱状聚集体堆叠长度和形状的控制。通过平衡聚合构筑单元亲水边缘的静电排斥作用与疏水核心内的吸引性非共价相互作用，我们成功制备出尺寸较小且均一的球形结构6,7。提高盐浓度以屏蔽电荷可诱导球形向棒状结构转变。有趣的是，这一转变表现为温度依赖性自组装过程中协同性的增强，并获得更稳定的聚集体。
在本研究中，我们选择以苯-1,3,5-三甲酰胺（BTA）为核心，通过一个疏水性的、基于L-苯丙氨酸的氟化间隔基连接至亲水性金属螯合物的分子结构（方案 1）。所选用的金属螯合物为带两个净负电荷的Gd(III)-DTPA配合物，每个配合物需结合两个反离子。该组装体的一维生长由π-π堆积和分子间氢键作用驱动。然而，当组装体达到一定尺寸后，Gd(III)-DTPA配合物所带电荷引起的静电排斥力将限制基于BTA的盘状结构的一维延伸。在毫摩尔浓度下，形成的组装体呈球形，直径约为5 nm，该结论基于1H-NMR波谱、小角X射线散射以及冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）的分析结果得出。通过提高缓冲溶液中的盐浓度，可减弱分子间静电排斥作用的强度。电荷屏蔽效应促使组装体从球形结构转变为长度> 25 nm的棒状结构。冷冻透射电子显微镜可用于直观观察组装体形貌与尺寸的变化。此外，圆二色（CD）光谱可揭示加盐前后自组装过程的机理细节。尤为重要的是，当静电相互作用被屏蔽后，协同性——决定所形成超分子聚合物物理性质的关键特征——显著增强。这种协同性的提升导致在水中形成的超分子聚合物分子量显著增加。
方案
图式 1. 基于BTA的盘状分子在柠檬酸盐缓冲液中自组装形成直径约5 nm的球形聚集体，构筑单元浓度为毫摩尔级别。通过添加NaCl提高离子强度后，会形成直径约3 nm、长度>25 nm的伸长棒状结构。 点击此处查看放大图。
1. 制备用于圆二色光谱的 BTA-Gd(III)DTPA 溶液及测量不同 NaCl 浓度下随温度变化的圆二色光谱
- 配制 100 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）。
- 配制含 2 M NaCl 的 100 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）。
- 将 0.254 mg 的 BTA-Gd(III)DTPA（分子量 = 3184 g•mol-1）溶解于 10 mL 的 100 mM 柠檬酸盐缓冲液中，目标浓度为 8•10-3 mM 的 BTA-Gd(III)DTPA。
- 对溶液进行超声处理 5 分钟。
- 用该溶液填充 1 cm 紫外比色皿，测定 230 至 350 nm 范围内的圆二色光谱，并在最强圆二色吸收峰（例如 λ = 269 nm）处以 1 K min-1 的速率记录 363 至 283 K 的圆二色冷却曲线。
- 向 BTA-Gd(III)DTPA 的柠檬酸盐缓冲溶液中加入等体积的含 2 M NaCl 的缓冲溶液，使离子强度提高至 1 M NaCl，同时使盘状分子浓度稀释至原来的一半，目标浓度为 4•10-3 mM 的 BTA-Gd(III)DTPA。
- 对离子强度提高后的溶液涡旋振荡 5 分钟。
- 重新测定 230 至 350 nm 范围内的圆二色光谱，并在最强圆二色吸收峰处以 1 K min-1 的速率记录 363 至 283 K 的圆二色冷却曲线。
2. 将温度依赖性圆二色（CD）数据拟合到温度依赖性自组装模型
- 将原始CD数据导出至Origin 8.5中并进行归一化处理。归一化方法为：定义最高测量温度下的CD效应值为0，最低测量温度下的CD效应值为1。由于CD效应的大小与聚集程度成正比8，因此归一化后的CD曲线与聚集程度成正比。
- 使用OriginPro 8.5中的非线性曲线拟合功能，采用van der Schoot推导的温度依赖性自组装模型8,9对归一化数据进行拟合。该模型区分了成核阶段和延伸阶段。首先拟合延伸阶段（T < Te）中的聚集程度，使用以下方程：
上述方程包含（除变量温度外， T，以及聚集程度， Φn三个参数； 即 延伸焓 he，延伸温度 Te （自组装开始的温度）以及参数 ΦSAT，其引入是为了确保 Φn/ΦSAT 不超过1，这源于聚集体程度不能超过1的约束条件。
拟合可得到表征分子在给定浓度下自组装过程的延伸焓 he（J/mol）和延伸温度 Te（K）。在进行拟合时，应遵守一个限制条件：仅拟合低于 Te 温度下的聚集程度，因为方程 2.1 仅在延伸阶段有效。
接下来，可使用以下方程对成核阶段实验测得的聚集程度进行拟合：
上述方程包含（除变量外） T 和 Φn）四个参数中已有三个通过公式2.1确定。 即 延伸焓 he，延伸温度 Te 参数 ΦSAT唯一的未知参数是 Ka 值——用于描述成核阶段的协同性——通过拟合实验测得的高于该温度的聚集程度获得 Te.
3. 用于透射电子显微镜的 BTA-Gd(III)DTPA 溶液制备及通过低温透射电镜观察超分子聚合物
- 准备两种缓冲液：100 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）和含 5 M NaCl 的 100 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）。
- 将 0.318 mg 的 BTA-Gd(III)DTPA（分子量 = 3184 g•mol-1）分别溶解于 0.1 mL 上述制备的缓冲液中，目标浓度为 1 mM 的 BTA-Gd(III)DTPA。
- 冷冻透射电子显微镜（cryogenic TEM）的样品玻璃化过程使用自动玻璃化机器人（FEI Vitrobot Mark III）进行。在玻璃化操作前，CryoTEM 载网（来自 Quantifoil Micro Tools GmbH 的 R2/2 Quantifoil Jena 载网）需用 Cressington 208 碳镀膜仪在 5 mA 条件下进行 40 秒的表面等离子体处理。随后，在自动化的 FEI Vitrobot 上将水溶液施加到载网上进行玻璃化操作，包括将样品加至载网上，吸除多余液体以在载网上形成一层薄水膜，然后迅速将载网浸入液态乙烷中实现玻璃化。玻璃化完成后，样品保存在液氮中，并手动转移至同样用液氮冷却的自动进样盒中。随后将该进样盒插入透射电镜的自动进样器中。以上所有步骤均为手动操作。
- 冷冻透射电镜实验在埃因霍温理工大学（TU/e）的 cryoTITAN（FEI）仪器上进行（www.cryotem.nl）。该 cryoTITAN 配备了在 300 kV 下运行的场发射电子枪（FEG）。图像采集使用配备有后列 Gatan 能量过滤器（GIF）的 2k × 2k Gatan CCD 相机完成。
4. 低离子强度下球形自组装 BTA-Gd(III)DTPA 的 1H-DOSY NMR 测量
- 配制 50 mM d6-琥珀酸盐缓冲液在D中2O（'pH 6.0'）；该缓冲液通过溶解 d6-二甲基亚砜中的琥珀酸2O，随后使用 1 M ND 将 pH 调整至 6.04D 中的 OD2O. 用额外的D将琥珀酸的终浓度调整至50 mM2O.
- 由于 Gd(III) 具有强顺磁性且 1因此，H信号会显著变宽，故用Gd(III)取代Y(III)。
- 溶解 2.98 mg 的 BTA-Y(III)DTPA （分子量 = 2979 g·mol⁻¹）-1) 加入 1 mL 50 mM 的 d6-琥珀酸盐缓冲液在D中2O（'pH 6.0'），目标浓度 1 mM BTA-Y(III)DTPA.
- 该 1H-DOSY NMR 测量在配备 Varian 5 mm ID-PFG 探头的 Varian Unity Inova 500 波谱仪上进行。DOSY 实验采用 DOSY 单次脉冲序列（Doneshot，Varian）。90 度脉冲和混合时间根据需要进行调整。化学位移以 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-[D4] 酸钠盐（TMSP）。
- 利用HDO的自扩散来校准测量；文献已知，HDO在D中的自扩散2298 K 时，O 的值为 19.0 × 10⁻⁹ m2•s-1作为参照，HDO 在 D 中的自扩散2O 在 VARIAN 2 Hz D 中测定2O标准样品并以其标准值进行校准。用于计算流体动力学半径R的模型H 聚集体的扩散遵循球形粒子扩散的斯托克斯-爱因斯坦关系。
5. 典型结果
1H-DOSY NMR 和 SAXS 对 BTA-M(III)-DTPA 在柠檬酸盐缓冲液中测量：球形物体
外围Gd(III)配合物的离子特性对盘状单体的一维生长产生阻碍作用，而盘状单体的内核设计用于聚合成细长的棒状聚集体。吸引与排斥相互作用之间的平衡控制着聚集体的尺寸和形态。方案 2).
方案 2.
确定溶液中颗粒尺寸和形状的一种强大技术是同步辐射小角X射线散射（SAXS）。将BTA-Gd(III)-DTPA溶解于柠檬酸盐缓冲溶液中，并在0.01 < q < 0.1 Å-1范围内记录并拟合SAXS谱图。在低q区域（q < 0.06 Å-1），斜率趋近于零，表明聚集体无明显形状各向异性，提示存在球形结构（图1）。对不同浓度下测得的数据采用均一单分散球形形态因子进行拟合，得到计算半径R为3.2 nm。单体盘状BTA-Gd(III)-DTPA的计算几何半径为3.0 nm，这表明聚集体的长径比接近1。
图 1. BTA-Gd(III)-DTPA 在柠檬酸盐缓冲液（100 mM，pH 6）中于 0.5 和 1.0 mM 浓度下的 SAXS 谱图（顶部）。BTA-Y(III)-DTPA 在 50 mM d6-丁二酸盐缓冲液中于 1.0 mM 浓度下的 DOSY 核磁共振谱图（底部）。 点击此处查看高清大图。
为了进一步证实自组装物体的球形形貌和纳米级尺寸，我们进行了 1H 扩散有序核磁共振波谱（1H-DOSY NMR）（图1）。DOSY-NMR 可用于测定聚集体的扩散系数，并据此计算其流体力学半径（RH) 可以计算。由于 Gd(III) 具有强顺磁性且 1因此，通过将顺磁性的 Gd(III) 替换为抗磁性的 Y(III)，避免了信号显著展宽。在氘代琥珀酸盐缓冲液（50 mM，pH 6，c = 1 mM）中，抗磁性盘状两亲分子聚集体的扩散系数测定为 0.69×10⁻¹⁰ m²/s。2s-1. 根据斯托克斯-爱因斯坦关系，我们计算出流体动力学半径 RH 2.9 nm，适用于球形离散物体表1该尺寸与从小角X射线散射（SAXS）数据获得的BTA-Gd(III)-DTPA结果高度一致。
| BTA-M(III)-DTPA [mM] | Dt a [10-10 m2s-1] | RH a [nm] | R b [nm] |
| 1 | 0.69 | 2.9 | 3.2 |
a 来自 DOSY；b 来自 SAXS
表1. BTA-M(III)-DTPA的SAXS和DOSY测量结果。
BTA-Gd(III)-DTPA 的冷冻透射电镜观察：从球形结构到伸长的纳米棒
通过冷冻透射电镜（cryo-TEM）显微图像获得了进一步证据，表明可成功调控一维堆叠结构的长度。由于水溶液在冷冻过程中形成玻璃态，低温透射电镜能够保持自组装聚集体的结构形态，避免了传统透射电镜样品制备过程中因干燥引起的结构影响。图2（左）显示，在1 mM浓度下，BTA-Gd(III)-DTPA形成了预期的球形结构，其直径接近6 nm，该结果与SAXS和DOSY测量结果一致。根据这些发现，我们已成功获得可视为树状大分子超分子对应物的离散自组装结构10。
图 2. BTA-Gd(III)-DTPA 的冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）图像；（左）1 mM 样品在柠檬酸盐缓冲液（100 mM，pH 6）中于 298 K 下玻璃化，标尺为 50 nm；（右）1 mM 样品在含有 5 M 总 NaCl 浓度的柠檬酸盐缓冲液（100 mM，pH 6）中于 298 K 下玻璃化，标尺为 50 nm。
到目前为止，我们仅在低离子强度的缓冲溶液中进行实验。然而，如果BTA-Gd(III)-DTPA上外围带电的M(III)-DTPA复合物之间的静电排斥力是一维生长受阻的原因，那么我们预期，通过使用具有高度水合反离子的惰性1:1盐来提高缓冲环境的离子强度，应能减弱静电相互作用，从而形成不同类型的自组装结构。在含有5 M NaCl的柠檬酸盐缓冲液中，确实观察到了这一效应（图2，右侧）。在高离子强度条件下，冷冻透射电镜图像中清晰可见形成长径比较高的棒状超分子聚合物。这一现象最可能的解释是静电屏蔽效应。自组装结构的形貌从直径约6 nm的球形聚集体转变为直径为6 nm、长度可达数百纳米的细长棒状结构。
BTA-Gd(III)-DTPA 的圆二色性测量：通过提高离子强度开启协同自组装
圆二色性（CD）光谱法用于测量左旋和右旋圆偏振光在吸收上的差异。当一个螺旋结构具有特定的手性偏好时，左旋和右旋圆偏振光的吸收程度会有所不同，从而产生圆二色性效应。由于在聚集体中连续的BTA-Gd(III)-DTPA之间形成的分子间氢键呈螺旋状排列，且L-苯丙氨酸部分的手性中心更倾向于形成一种特定的螺旋构型，因此我们预期基于BTA-Gd(III)-DTPA的聚集体将呈现出明显的CD光谱信号11,12。此外，温度依赖性CD光谱是研究BTA-Gd(III)-DTPA聚合自组装机制的有力工具，还可用于推断所形成聚集体的稳定性13。
例如，图3A给出了BTA-Gd(III)-DTPA在柠檬酸盐缓冲液（100 mM）中随着盐浓度增加（NaCl浓度从0 M增至1.0 M）的室温圆二色（CD）光谱，其浓度分别为8×10-3 mM或4×10-3 mM。尽管CD测量所用浓度显著更低，但明显的科顿效应表明即使在微摩尔浓度下仍存在完整的聚集体。随着盐浓度升高，CD光谱的形状发生变化，这清楚表明柱状堆积体外围相互作用减弱，盘状分子堆积更为紧密。此外，相同溶液的CD降温曲线（363–283 K，在λ = 269 nm或278 nm处测量）在形状上表现出明显差异（图3B）。表观Te（即开始发生聚集的温度）随盐浓度升高而向更高温度偏移，同时呈现出越来越协同的机制，表现为CD效应的急剧增强。在0 M NaCl条件下的降温曲线最适合用等能自组装模型描述，而在1.0 M NaCl条件下的曲线则典型地符合协同性自组装过程14。在前一种情况下，所有缔合常数被假定相等；而在后一种情况下，自组装至少经历两个明显不同的阶段：第一步需形成一个在能量上极不利的“成核”结构；当冷却至临界聚合温度以下时，随即发生延伸并指数增长，形成高分子量的超分子聚合物。采用协同模型对BTA-Gd(III)-DTPA在0 M和1 M NaCl条件下的自组装热力学参数进行量化分析，清晰揭示了无量纲活化常数Ka的降低8。Ka值越低，表明自组装过程的协同性程度越高，这在冷冻透射电镜（cryo-TEM）中观察到的高度伸长的超分子聚合物的形成中得以体现。
| BTA-Gd(III)-DTPA | CNaCl | Ka |
| 8 × 10-3 mM | 0 M | 5 × 10-2 |
| 4 × 10-3 mM | 1 M | 1 × 10-4 |
表2. BTA-Gd(III)-DTPA 在不同 NaCl 浓度（CNaCl）下温度依赖性自组装过程中，以 Ka 表示的协同程度。
图3. BTA-Gd(III)-DTPA在100 mM柠檬酸盐缓冲液中（低离子强度下c = 8 ×10-3 mM，高离子强度下为4 ×10-3 mM）。A] 在293 K下记录的CD光谱，作为离子强度的函数，cNaCl = 0 M - 1.0 M；摩尔椭圆度Δε按以下公式计算：Δε = CD效应/(cxl)，其中c为BTA的浓度（单位：mol L-1），l为光程（单位：cm）；B] 在λ = 269 nm（0 M NaCl）和278 nm（1 M NaCl）处测得的相应CD冷却曲线，以聚集度Φn表示，作为NaCl浓度cNaCl = 0 M - 1.0 M的函数，Φn通过将测得的CD效应除以最大CD效应计算得到。
讨论
本文所讨论的含有 Gd(III)-DTPA 复合物的自组装盘状两亲分子，目前正在作为新型磁共振成像（MRI）造影剂进行研究，这类造影剂兼具高对比度与可调节的排泄时间。15 因此，其自组装行为的细节以及在不同条件下的稳定性至关重要。结合光谱学（CD 和 NMR）、散射（SAXS）和显微技术（cryo-TEM）可实现对所形成结构的可视化及其热力学参数的定量分析。只要所研究体系中存在优先的螺旋手性，导致对左旋和右旋圆偏振光吸收的差异，该多技术联用方法便可广泛适用于各类自组装分子体系。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者们衷心感谢 Marko Nieuwenhuizen 在 DOSY-NMR 实验方面的协助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BTA-Gd(III)-DTPA | 实验室自制 | ||
| BTA-Y(III)-DTPA | 实验室自制 | ||
| 圆二色光谱 | Jasco | Jasco J-815 圆二色光谱仪 | |
| 核磁共振 | Varian | Varian Unity Inova 500 核磁共振波谱仪 | Varian 5-mm ID-PFG 探头 |
| 冷冻透射电子显微镜 | FEI | cryoTITAN 透射电子显微镜 | |
| 小角X射线散射 | 位于法国格勒诺布尔欧洲同步辐射装置（ESRF）的荷兰-比利时线站（BM26B） |
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